Isolamento fecale (micro) RNA
28 ottobre 2020
Questo protocollo isola l'RNA totale di alta qualità da campioni fecali di soggetti animali e umani. Un kit commerciale di isolamento dei miRNA viene utilizzato con un adattamento significativo per isolare l'RNA puro con quantità e qualità ottimizzate. Gli isolati di RNA sono buoni per la maggior parte dei saggi di RNA a valle come sequenziamento, micro-array e RT-PCR.
Presentiamo un protocollo per isolare l'RNA da campioni fecali per studiare i microRNA. Questo protocollo può essere utilizzato per isolare l'RNA dalle feci con alta qualità e quantità. Riduce al minimo gli RNA dei microbi viventi.
È importante sottolineare che il buffer di binding non viene utilizzato in questo protocollo. Questo protocollo è semplice e diretto. Iniziare risospendendo da 25 a 100 milligrammi di campioni fecali in 600 microlitri di 1X DPBS sterile in una provetta da microcentrifuga da due millilitri.
Incubare la provetta contenente il campione a temperatura ambiente per 30 minuti. Quindi schiacciare il composto con un puntale di pipetta da un millilitro e agitare bene. Risospendere la miscela in un omogeneizzatore con un'impostazione per un ciclo a 4.000 rotazioni al minuto per 45 secondi per ottimizzare e aumentare la quantità e la qualità dell'RNA.
Aggiungere 600 microlitri di soluzione acida di cloroformio fenolico al campione e agitare la miscela per 60 secondi. In alternativa, per ottimizzare una maggiore quantità di RNA nella resa, mescolarlo con un omogeneizzatore. Centrifugare il campione per 15 minuti a 10.000 x g a temperatura ambiente per separare la fase acquosa da quella organica.
Ripetere la centrifugazione fino a quando l'interfaccia non sarà compatta. Trasferire con cura la fase acquosa superiore senza disturbare la fase inferiore in una nuova provetta da microcentrifuga da due millilitri con tappo a cerniera. Aggiungere etanolo al 100% di grado ACS a 1,25 volte il volume della fase acquosa acquisita e vorticare per tre secondi.
Posizionare la cartuccia filtrante nelle provette di raccolta. Caricare 600 microlitri di ciascuno dei campioni nella cartuccia filtrante fornita nel kit di isolamento dei microRNA. Centrifugare a 10.000 x g per 90 secondi per filtrare la miscela attraverso la cartuccia.
Quindi scartare il filtrato. Ripetere l'operazione fino a quando l'intero volume della miscela non viene filtrato attraverso la stessa membrana filtrante nelle applicazioni successive. Dopo tutto, il campione viene filtrato.
aggiungere 700 microlitri di soluzione di lavaggio microRNA 1 nella stessa cartuccia filtrante. Centrifugare per 60 secondi per filtrare la soluzione di lavaggio attraverso la cartuccia filtrante. Eliminare il filtrato e posizionare la cartuccia filtrante sullo stesso tubo di raccolta.
Lavare la cartuccia del filtro con 700 microlitri di soluzione di lavaggio 2/3 preparata in etanolo ACS grado 100% e centrifugare a 10.000 x g per un minuto. Scartare il filtrato ottenuto e inserire la cartuccia filtrante nello stesso tubo. Lavare la cartuccia del filtro con 500 microlitri di soluzione di lavaggio 2/3 e centrifugare a 10.000 x g per un minuto.
Scartare il filtrato ottenuto e posizionare la cartuccia filtrante nella stessa provetta di raccolta. Lavare la cartuccia del filtro con 250 microlitri di soluzione di lavaggio 2/3 preparata in ACS grado 100% etanolo e centrifugare a 10.000 x g per un minuto. Scartare il filtrato ottenuto e posizionare la cartuccia filtrante nella stessa provetta di raccolta.
Infine, trasferire la cartuccia del filtro in una nuova provetta di raccolta e far girare il gruppo per cinque minuti per rimuovere il fluido residuo. Trasferire la cartuccia del filtro in una nuova provetta di raccolta, quindi aggiungere 50 microlitri di acqua priva di nucleasi al centro del filtro e tappare il tubo. Incubare la provetta a temperatura ambiente per 10 minuti.
Quindi centrifugare la provetta per cinque minuti a 8.000 x g per recuperare l'RNA in una nuova provetta di raccolta. Un saggio di elettroforesi dell'RNA basato su chip suggerisce che gli isolati di RNA rappresentativi delle feci di topo e umane sono bassi o privi di composizioni di rRNA 18S e 28S e che la dimensione degli isolati di RNA diminuisce nella regione del piccolo RNA. Un'ulteriore elettroforesi di piccoli RNA con l'elettroforesi basata su chip ha rivelato che gran parte degli RNA sono di dimensioni microRNA.
La purezza dell'RNA estratto era elevata, come indicato dal rapporto di assorbanza di 2,0 per lunghezze d'onda di 260 e 280 nanometri e dal valore del rapporto di 1,8 per l'assorbanza a 260 e 230 nanometri. Per garantire il successo dell'estrazione organica, assicurarsi che le facce siano evidenti e trasferire solo la fase acquosa superiore senza disturbare la fase inferiore, anche a costo di un volume ridotto della nostra fase acquosa.
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Panoramica
Questo protocollo presenta un metodo semplice per isolare RNA di alta qualità da campioni fecali, minimizzando la contaminazione da microbi viventi. È progettato sia per soggetti animali che umani, garantendo una resa e una purezza ottimizzate per le applicazioni successive.
Componenti principali dello studio
Area di scienza
- Neuroscienze
- Microbiologia
- Biologia molecolare
Sfondo
- L'isolamento dell'RNA da campioni fecali è cruciale per studiare i microRNA.
- I metodi tradizionali possono portare alla contaminazione da RNA microbico.
- L'RNA di alta qualità è essenziale per saggi accurati successivi.
- Questo protocollo adatta un kit commerciale per l'isolamento di miRNA per risultati migliori.
Obiettivo dello studio
- Fornire un metodo affidabile per l'estrazione dell'RNA dalle feci.
- Migliorare la qualità e la quantità degli isolati di RNA.
- Facilitare la ricerca sui microRNA in vari contesti biologici.
Metodi utilizzati
- Risospensione di campioni fecali in DPBS sterile 1X.
- Uso di un tubo microcentrifuga da due millilitri per l'elaborazione.
- Adattamento di un kit commerciale per l'isolamento di miRNA.
- Minimizzazione della contaminazione dell'RNA da microbi viventi.
Risultati principali
- Isolamento riuscito di RNA totale di alta qualità da campioni fecali.
- Il protocollo ottimizzato produce RNA adatto per il sequenziamento e RT-PCR.
- Efficacia dimostrata nella riduzione della contaminazione dell'RNA microbico.
- Il protocollo è semplice e diretto per i ricercatori.
Conclusioni
- Questo protocollo fornisce un metodo affidabile per l'estrazione dell'RNA da campioni fecali.
- L'RNA di alta qualità è cruciale per le applicazioni successive.
- Gli adattamenti ai kit commerciali possono migliorare la resa e la purezza dell'RNA.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Isolating high-purity RNA from fecal samples enables mechanistic de-risking in target validation by providing access to host-derived microRNAs without microbial contamination. This supports predictive confidence in biomarker discovery and pathway analysis for gastrointestinal and systemic diseases. The protocol’s scalability and reproducibility facilitate enterprise reuse across discovery and preclinical workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of host microRNA signatures in feces for therapeutic hypothesis testing and pathway clarification.
- Operational Value: Reduces mechanistic ambiguity by minimizing confounding signals from living microbes in sample preparation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces RNA isolates suitable for sequencing, RT-PCR, and microarray applications, enabling reliable compound screening readouts.
- Operational Value: Standardized washing steps and phase separation ensure reproducibility and scalability for high-throughput assay development.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports translational biomarker alignment by yielding disease-relevant small RNA profiles from animal and human fecal models.
- Operational Value: Facilitates continuity from discovery through preclinical validation with consistent RNA quality and quantity.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from Early Discovery to Lead Identification and Preclinical validation by providing a standardized input for omics and functional assays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and biological de-risking by isolating host-derived RNA from complex fecal matrices.
- Screening: Enables assay readiness through high-yield, pure RNA outputs compatible with downstream analytical platforms.
- Analytics: Delivers quantitative RNA measurements with high purity (A260/A280 ~2.0, A260/A230 ~1.8) for accurate condition comparison.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via species-agnostic application in mouse and human models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for fecal RNA isolation across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through reduced microbial contamination and enhanced target validation in host-microbiome studies.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability via optimized resuspension, washing, and filtration steps.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in biomarker-driven programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on reliable RNA-derived data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid handling and phase separation techniques to avoid interphase disruption.
- Dependent on centrifugation equipment capable of 10,000 x g and homogenization at 4,000 rpm for sample processing.
- Necessitates cross-team standardization of sample mass limits (25–200 mg) to ensure consistent aqueous phase recovery.
- Adaptation considerations include adjusting wash volumes and incubation times for varying sample types and inhibitor loads.
- Practical limitation: samples exceeding 200 mg may compromise phase separation and RNA purity due to interface instability.
