Cancro ipossia stampato in cellule 3D su chip per ricapitolare la progressione patologica del cancro solido

L'ipossia è un fattore chiave dello sviluppo del cancro che induce instabilità genomica e tumorigenesi. Dimostriamo un metodo per generare ipossia centrale in un cancro solido in vitro basato sulla tecnologia di biostampa 3D. Utilizzando questo metodo, un gradiente ipossico radio può essere riprodotto utilizzando una semplice strategia che combina una barriera permeabile al gas stampata in 3D e una copertura in vetro.

Questa tecnologia on-a-chip per il cancro ipossico può essere utilizzata per prevedere l'efficacia del farmaco per facilitare la prescrizione di farmaci antitumorali specifici del paziente. E ci si aspetta anche che consenta una diagnosi rapida dei tumori aggressivi. Per aiutare nella preparazione di una soluzione pre-gel di collagene neutralizzata da tre millilitri, tagliare spugne di collagene da 30 milligrammi in pezzi quadrati di cinque per cinque millimetri.

Mettere i pezzi in una fiala sterile di vetro da 10 millilitro e aggiungere 2,4 millilitri di filtro siringa da 0,2 micron 0,1 normale acido cloridrico al flaconcino per un'incubazione di tre giorni a quattro gradi Celsius e 15 giri al minuto. Dopo la digestione, filtrare eventuali particelle di collagene non digerite attraverso un colino cellulare da 40 micron e conservare la soluzione acida di collagene a quattro gradi Celsius per un massimo di sette giorni. Per regolare il pH della soluzione pre-gel di collagene neutralizzata all'1%, aggiungere 30 microlitri di soluzione rosso fenolo a una concentrazione finale di 1% e 300 microlitri di 10X PBS a una concentrazione finale del 10%Dopo la miscelazione e la centrifugazione, utilizzare un normale idrossido di sodio per neutralizzare il pH a sette, verificando il cambiamento di colore e aggiungere acqua distillata per ottenere un volume totale di tre millilitri.

Quindi conservare la soluzione pre-gel di collagene regolata all'1% regolata all'1% a quattro gradi Celsius per l'uso entro tre giorni. Per precontrollare la gelazione della soluzione pre-gel di collagene neutralizzata, utilizzare una pipetta di spostamento positiva per aggiungere 50 microlitri di goccioline di collagene a un piccolo piatto e incubare le goccioline in un'incubatrice di 37 gradi Celsius per un'ora. Alla fine dell'incubazione, controlla se il collagene è cambiato da un colore trasparente a un bianco opaco.

Inclinare il contenitore per confermare che il collagene aderisce al fondo del contenitore. E versare PBS sulla goccia per confermare che il costrutto di collagene non si rompe in soluzione. Per la stampa 3D di uno stampo PEVA sacrificale, fate clic su File e salvate il tipo di file come STL per convertire il file CAD 3D in un file STL e fate clic su Opzione (Option) e forma di output (Option and output form) come ASCII per generare il codice G.

Per importare il file STL generato, fare clic su File e aprire il file STL e selezionare il file STL salvato. Per generare automaticamente il codice G dello stampo PEVA sacrificale, selezionate il modello slice dello scambiatore STL-CAD. Quindi, per generare percorsi di stampa per la fabbricazione del truciolo, utilizzare un ugello di precisione calibro 50 a una pressione pneumatica di 500 kilopascal a 110 gradi Celsius per stampare lo stampo PEVA sacrificale su uno scivolo istologico idrofilo adesivo sterile.

Per lanciare la barriera PDMS, mescolato sei millilitri di elastomero di base PDMS e 600 microlitri di agente polimerizzante per cinque minuti in un serbatoio di plastica e caricare la soluzione miscelata in modo omogeneo in una siringa monouso da 10 millilitri. Dotato la siringa di una punta di erogazione affusolata in plastica calibro 20 e riempire lo stampo PEVA sacrificale con la soluzione PDMS miscelata. Il PDMS miscelato riempirà questo stampo PEVA sacrificale con una superficie convessa e la barriera sarà superiore a quella dello stampo.

Dopo aver curato la barriera PDMS in un forno a 40 gradi Celsius per oltre 36 ore per evitare di fondere il PEVA, utilizzare un paio di pinzette di precisione per staccare lo stampo PEVA sacrificale e sterilizzare la barriera permeabile al gas a 120 gradi Celsius in autoclave. Per mescolare la soluzione con le cellule tumorali, rimorsi di ogni tipo di pellet cellulare raccolto in 20 microlitri di terreno di coltura e aggiungere un millilitro di soluzione pre-gel di collagene neutralizzata all'1% in ciascuna delle sospensioni cellulari rimonite su ghiaccio umido con miscelazione delicata. Utilizzare una pipetta di spostamento positiva per mescolare ogni sospensione cellulare.

Quando si ottengono soluzioni omogenee, utilizzare una pipetta monouso positiva per trasferire i bioinchiostri di collagene incapsulati cellulari in singole siringhe monouso da tre millilitri e conservare le siringhe a quattro gradi Celsius fino alla stampa di cellule 3D. Per la stampa 3D di anelli concentrici cancero-stroma, convertire il file CAD 3D appropriato in un formato di file STL e utilizzare uno scambiatore STL-CAD per generare un codice G degli anelli concentrici cancro-stroma. Caricare i bioinchiostri di collagene incapsulati nella testa della stampante 3D e impostare la temperatura della testa e della piastra a 15 gradi Celsius.

Caricare il percorso di stampa generato sul software di controllo della stampante 3D e fare clic su Avvia per stampare i bioinchiostri di collagene sulla barriera permeabile al gas in base al codice G caricato con un ago di plastica calibro 18 a una pressione pneumatica di circa 20 kilopascal a 15 gradi Celsius. Al termine di ogni operazione di stampa, posizionare manualmente una copertura di vetro sterilizzata da 22 per 50 millimetri sopra la barriera permeabile al gas per generare il gradiente ipossia. Dopo aver generato tre cancerosi ipossici sui chip, trasferisci i chip in un'incubatrice di 37 gradi Celsius per un'ora per incrociare i bioinchiostri di collagene.

Quando tutti i cancerosi ipossici su chip sono stati stampati, strofinare delicatamente gli occhiali di copertura sopra le barriere permeabili al gas con un raschietto cellulare per un incollaggio stretto. Per aggiornare il mezzo di coltura cellulare ai trucioli senza staccare il costrutto del cancro, inclinare i trucioli e utilizzare una pipetta per introdurre 1,5 millilitri di mezzo di crescita cellulare endoteliale sul lato di ogni chip. L'ipossico cancer-on-a-chip è stato progettato sotto forma di anelli concentrici per imitare la diffusione radiale dell'ossigeno e l'esaurimento osservati nei tessuti tumorali.

Dopo aver definito il volume di controllo di uno spazio in cui l'ossigeno viene diffuso e consumato dalle cellule, una densità cellulare appropriata per la generazione centrale di ipossia può essere determinata attraverso l'analisi computazionale degli elementi finiti. Dopo la stampa cellulare 3D, è possibile creare una struttura ad anello concentrica cancro-stroma compartimentata per riprodurre le caratteristiche anatomiche del cancro solido. Quantitativamente, la vitalità delle cellule post-stampa è in genere superiore al 96% confermando che le condizioni di produzione sono appropriate per il cancro e le cellule stromali.

In questa analisi rappresentativa, due gruppi sono stati confrontati in base alla presenza e all'assenza del gradiente di ossigeno per verificare gli effetti di un gradiente ipossia sulla progressione del cancro. In entrambe le condizioni erano presenti cellule endoteliali positive CD31 mature all'interno delle regioni periferiche, indicando che i costrutti viventi a motivi spaziali sono stati prodotti utilizzando la tecnologia di biostampia 3D. Rispetto alla condizione negativa del gradiente di ossigeno, la condizione positiva gradiente ha dimostrato un gradiente ipossia, indicando l'espressione graduale di HIF1 alpha.

Sono state osservate anche cellule pseudopalisaded positive SHMT2 e cellule pluripotenti positive SOX2, indicative della presenza di caratteristiche fisiopatiche aggressive del cancro solido. Il cancero-on-a-chip ipossia è uno strumento utile per studiare le caratteristiche fisiopatiche dei tumori solidi e il crosstalk dinamico tra cellule tumorali e tumorigenesi che promuovono il microambiente. Poiché la metodologia può essere adattata per una progettazione di farmaci specifica per il paziente in un lasso di tempo ragionevole, questo approccio dovrebbe colmare il divario tra modelli di cancro in vivo e in vitro.