Induzione e analisi dello stress ossidativo nelle cellule epiteliali del pigmento retinico umano trasforato dalla bella addormentata nel bosco

Il modello del perossido di idrogeno è un approccio semplice ed efficace per valutare gli effetti antiossidanti di fattori che possono essere utili nel trattamento della degenerazione maculare legata all'età o di malattie neurodegenerative simili. L'agente ossidante, il perossido di idrogeno, viene erogato in un unico impulso, il che lo rende più veloce e semplice da eseguire rispetto ai modelli in cui il trattamento con perossido di idrogeno deve essere ripetuto per diversi giorni. Poiché il numero di cellule seminate influenza l'effetto ossidativo del trattamento, è importante contare attentamente le cellule prima della loro coltura.

A dimostrare la procedura sarà Thais Bascuas, post-dottorato del laboratorio di Gabriele Thumann. Per la preparazione del terreno condizionato, 28 giorni dopo la trasfezione con PEDF, GM-CSF o entrambi, seminare le fiasche T-75 della linea cellulare umana ARPE-19 da 500.000 cellule per millilitro di concentrazione completa del mezzo. Quando le cellule raggiungono circa l'80% di confluenza, sostituire il surnatante con un terreno completo fresco e raccogliere il nuovo surnatante dopo 24 ore.

Per purificare le proteine GM-CSF e PEDF marcate con istidina, centrifugare il surnatante per eliminare le potenziali cellule rimanenti e mettere da parte il campione. Quindi, aggiungere 30 microlitri di soluzione di nichel NTA in un tubo da 1,5 millilitri. Dopo la centrifugazione, scartare il flusso di nichel NTA e lavare il pellet due volte con 200 microlitri di tampone di incubazione 1X per lavaggio.

Dopo il secondo lavaggio, risospendere il pellet in 40 microlitri di tampone di incubazione 4X e 900 microlitri di terreno centrifugato e condizionato. Incubare la soluzione di terreno condizionato per un'ora a temperatura ambiente e 70 rotazioni al minuto. Al termine dell'incubazione, centrifugare il campione e lavare il pellet due volte con 175 microlitri di incubazione 1X per lavaggio.

Dopo il secondo lavaggio, aggiungere 20 microlitri di tampone di eluizione per un'incubazione di 20 minuti a 70 giri al minuto a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, centrifugare il campione. Mettere da parte il surnatante e quantificare la proteina totale eluita dal dosaggio delle proteine BCA secondo i protocolli standard.

Per il trattamento di cellule epiteliali pigmentate retiniche non trasfettate con terreno condizionato e perossido di idrogeno, seminare 3000 cellule in 200 microlitri di terreno completo in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti per l'incubazione di 24 ore nell'incubatore per colture cellulari. La mattina successiva sostituire i surnatanti con 200 microlitri di terreno condizionato per pozzetto e rimettere le cellule negli incubatori di coltura cellulare per 10 giorni. L'11° giorno di coltura, trattare le cellule con perossido di idrogeno da 350 micromolari in terreno completo per 24 ore.

Per il trattamento di cellule RPE non trasfettate con PEDF e/o GM-CSF purificati o commerciali, seminare 3000 cellule in 200 microlitri di terreno completo integrati con 500 nanogrammi per millilitro di PEDF ricombinante e/o 50 nanogrammi per millilitro di ricombinante a GM-CSF per pozzetto per un'incubazione di 48 ore nell'incubatore per colture cellulari. Al termine dell'incubazione, sostituire i surnatanti con un terreno completo contenente 350 micromolari di perossido di idrogeno e 500 nanogrammi per millilitro di PEDF e/o 50 nanogrammi per millilitro di GM-CSF per pozzetto per 24 ore. Per il trattamento con perossido di idrogeno di cellule RPE trasfettate, coltivare 5.000 cellule trasfettate in 200 microlitri di terreno completo per pozzetto per 24 ore nell'incubatore di coltura cellulare prima di trattare le cellule con 350 micromolari di perossido di idrogeno come dimostrato.

Per misurare i livelli di glutatione prodotti nelle cellule trasfettate che sovraesprimono PEDF e/o GM-CSF, o nelle cellule non trasfettate pretrattate con fattore di crescita dopo il trattamento con perossido di idrogeno, sostituire il surnatante in ciascun pozzetto con 100 microlitri di miscela di reagenti 1X appena preparata per pozzetto e mescolare le cellule con una miscela di reagenti per 14 secondi a 500 giri al minuto su un agitatore orbitale. Dopo l'agitazione, incubare la piastra a temperatura ambiente per 30 minuti prima di aggiungere 100 microlitri di reagente di rilevamento della luciferina ricostituita a ciascun pozzetto. Mescolare la soluzione per 15 secondi sull'agitatore, seguito da un'incubazione di 15 minuti a temperatura ambiente.

Al termine dell'incubazione, caricare la piastra su un lettore di piastre e selezionare Change Layout (Cambia layout). Nella scheda Parametri di base, è necessario selezionare la piastra a 96 pozzetti e l'ottica superiore e il ritardo di posizionamento deve essere impostato su 0,1, l'ora di inizio della misurazione su zero, il tempo dell'intervallo di misurazione su uno e il tempo per normalizzare i risultati su zero. Definire i pezzi grezzi, gli standard e i campioni, quindi fare clic su Avvia misurazione.

Quindi esporta i dati come file di foglio di calcolo e calcola la concentrazione di glutatione in ciascun campione mediante interpolazione della curva standard. Per misurare la vitalità cellulare, sostituire il surnatante in ciascun pozzetto con 100 microlitri di terreno completo integrato con l'1% di FBS per pozzetto e posizionare le cellule nell'incubatore per coltura cellulare fino all'analisi. Dopo aver raccolto le cellule ARPE-19 non trattate dalla coltura, risospendere le cellule a una dose di 100.000 cellule per millilitro in terreno DMEM Hams F-12 integrato con una concentrazione di FBS all'1%.

Successivamente, preparare sette diluizioni seriali 1:1 in 200 microlitri di terreno integrato con l'1% di FBS e trasferire 100 microlitri di ciascuno standard nei pozzetti appropriati di una piastra da 96 pozzetti in duplicato. Aggiungere 50 microlitri di miscela di reagenti appena preparata a tutto il pozzetto e mescolare le cellule con la miscela per 15 secondi sullo shaker prima di incubare la piastra per 15 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, misurare la luminescenza come dimostrato.

Dopo aver ottenuto la misurazione, aggiungere 50 microlitri di reagente di lisi a ciascun pozzetto per un'incubazione di 15 minuti a temperatura ambiente, quindi misurare nuovamente la luminescenza e utilizzare la formula per calcolare la percentuale di cellule vitali. 24 ore di trattamento con perossido di idrogeno da 50 e 100 micromolari non influiscono sulla produzione intracellulare di glutatione, mentre si osserva una diminuzione significativa del glutatione quando le cellule vengono trattate con un perossido di idrogeno da 350-500 o 700 micromolari concentrazione. Morfologicamente, le cellule trattate con perossido di idrogeno appaiono meno sparse e più arrotondate con l'aumentare delle concentrazioni del composto.

Questo effetto è stato meno evidente per le cellule trasfettate con PEDF e GM-CSF trattate con perossido di idrogeno. È importante notare che il numero di cellule influenza lo stress ossidativo mediato dal perossido di idrogeno, poiché il livello di glutatione è diminuito in modo statisticamente significativo dopo il trattamento con perossido di idrogeno in pozzetti seminati con solo 5.000 cellule. Le cellule trattate con o trasfettate per esprimere PEDF e/o GM-CSF producono significativamente più glutatione rispetto alle cellule di controllo non trattate in condizioni ossidative.

Inoltre, il livello di espressione genica di UCP2 nelle cellule trasfettate con PEDF e GM-CSF è aumentato dopo il perossido di idrogeno, sebbene l'aumento non sia statisticamente significativo. L'analisi Western blot di AKT fosforilata da un lisato di cellule trasfettate con GM-CSF esposte a perossido di idrogeno mostra solo una piccola diminuzione della fosforilizzazione rispetto alle cellule di controllo non trattate, indicando che GM-CSF può proteggere le cellule dai danni da stress ossidativo. È importante seminare le cellule alla densità corretta, utilizzare una soluzione fresca di perossido di idrogeno e aggiungere proteine fresche al terreno.

Una volta che l'effetto antiossidante dei fattori di crescita è stato corroborato utilizzando il modello del perossido di idrogeno, i fattori possono essere testati in un modello di malattia oculare correlata allo stress ossidativo. L'attuale modello di stress ossidativo del perossido di idrogeno consente di valutare gli effetti antiossidanti che diversi fattori possono avere e, quindi, supporta lo sviluppo di nuove terapie geniche.