Applicazione del sistema RatWalker per l'analisi dell'andatura in un modello genetico di ratto della malattia di Parkinson
18 gennaio 2021
Qui descriviamo il sistema RatWalker, costruito riprogettando l'apparato MouseWalker per adattarsi alle maggiori dimensioni e peso dei ratti. Questo sistema utilizza la riflessione interna totale frustrata (FTIR), l'acquisizione video ad alta velocità e il software di analisi ad accesso aperto per tracciare e quantificare i parametri dell'andatura.
Questo metodo consente di quantificare in modo riproducibile le differenze nei parametri dell'andatura. I parametri dell'andatura possono essere valutati nei roditori che camminano liberamente e la tecnica non si basa su passaggi invasivi come immergere i piedi con l'inchiostro. A dimostrare la procedura sarà Ben Lamberty.
Inizia posizionando una gabbia domestica alla fine della passerella prima dell'inizio di ogni corsa, per servire come spunto positivo per il topo per attraversare la passerella. Spegni le luci della stanza. Accendi la fotocamera e inizia a registrare alcuni secondi prima che il topo venga posizionato sulla piattaforma.
Con il recinto installato, posizionare il topo alla fine della passerella, di fronte alla gabbia domestica, e consentirgli di attraversare la passerella in modo non forzato. Interrompi la registrazione una volta che l'animale raggiunge il capolinea della passerella. Pulire la passerella utilizzando il 70% di etanolo e un asciugamano non abrasivo tra una corsa e l'altra e dopo che un animale urina o defeca.
Quindi, lasciare evaporare l'etanolo prima di introdurre un altro animale. Fai correre i ratti attraverso la passerella per un totale di sette volte durante ogni periodo di osservazione, prendendo le prime tre corse che segnano come passaggio per l'analisi. Segna una corsa come passaggio se l'animale fa quattro o più passi consecutivi in direzione della gabbia domestica senza interruzioni a causa di toelettatura, pause o movimenti erranti.
L'analisi dell'andatura è stata eseguita su ratti maschi wild-type e Parkin DKO a due mesi di età per determinare se l'uso dell'analisi cinematica dell'andatura potesse rivelare sottili menomazioni motorie prima della comparsa di grossolani problemi motori. Nonostante l'aumento di peso dei ratti DKO, la pressione del piede applicata alla superficie di calpestio era inalterata. Dopo la valutazione di diversi parametri dell'andatura in funzione della velocità di camminata, la velocità di camminata e le lunghezze dei passi sono risultate simili tra ratti wild-type e DKO.
La variazione tra ratti wild-type e DKO è diventata evidente nella fase di posizione e nella durata dell'oscillazione a velocità di camminata più lente. La frazione del ciclo di passi in cui la gamba è nella fase di posizione era il fattore di dovere. È stato speso più tempo nella fase di oscillazione che nella fase di posizione poiché il fattore di servizio è diminuito.
Inoltre, mentre le velocità di oscillazione aumentavano con l'aumentare della velocità negli animali selvatici, la correlazione era smussata nei ratti DKO. L'analisi dell'andatura FTIR è stata utilizzata anche per creare grafici di tracce di fase di posizione di ciascuna gamba rispetto al corpo in ratti che camminano liberamente. Dopo aver confrontato il posizionamento della zampa, sono stati osservati cambiamenti significativi in AEP e PEP.
Diversi parametri aggiuntivi sono stati significativamente modificati nei ratti DKO rispetto al wild-type. La velocità di oscillazione di entrambi gli arti posteriori sinistro e destro è aumentata nei ratti DKO, mentre la durata dell'oscillazione di entrambi gli arti posteriori sinistro e destro è diminuita. La configurazione coerente delle apparecchiature, compresa la posizione della telecamera rispetto a RatWalker, è importante per la corretta implementazione di questo protocollo.
Dopo aver eseguito questo protocollo, gli animali sono disponibili per qualsiasi comportamento aggiuntivo o endpoint sperimentale necessari. Ad esempio, i cambiamenti dell'andatura possono essere correlati con alterazioni istologiche. Questa tecnica può essere utilizzata per valutare l'andatura in altri modelli di roditori non PD, come i modelli di ansia e depressione.
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Panoramica
Questo studio presenta il sistema RatWalker, progettato per analizzare l'andatura in ratti che camminano liberamente, mediante riflessione totale interna frustrata (FTIR) e acquisizione video ad alta velocità. Esso permette una quantificazione precisa dei parametri dell'andatura, offrendo informazioni dettagliate sui deficit motori, in particolare nei ratti geneticamente modificati Parkin DKO.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Analisi comportamentale
- Valutazione dell'andatura
Sfondo
- L'analisi della deambulazione nei roditori si basa comunemente su metodi invasivi.
- Studi precedenti hanno evidenziato la necessità di tecniche non invasive migliorate per valutare la funzione motoria.
- RatWalker è una modifica del sistema MouseWalker, adattato per accogliere roditori di dimensioni maggiori.
- Questo sistema può aiutare a identificare deficit motori sottili prima dell'insorgenza di sintomi evidenti.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo non invasivo per l'analisi della deambulazione nei ratti.
- Indagare le differenze nella deambulazione tra ratti wild-type e ratti Parkin DKO.
- Stabilire un protocollo affidabile per il monitoraggio dei parametri della deambulazione in più prove.
Metodi Utilizzati
- Il sistema RatWalker è stato utilizzato per analizzare l'andatura di ratti che camminavano liberamente.
- I modelli biologici erano ratti di sesso maschile di tipo selvatico e ratti Parkin DKO di due mesi di età.
- Nello studio non sono stati menzionati workflow di multiomica.
- I ratti hanno percorso il passaggio sette volte in totale, con una valutazione basata su passi consecutivi.
- I parametri dell'andatura sono stati quantificati mediante analisi FTIR e analisi video.
Risultati principali
- L'analisi della deambulazione ha rivelato differenze significative nella fase di appoggio e nella durata della fase di oscillazione nei ratti DKO a velocità più basse.
- Nonostante velocità di camminata simili, i ratti DKO hanno mostrato alterazioni nei parametri temporali della deambulazione rispetto ai ratti di tipo selvatico.
- Sono state osservate importanti modifiche nella posizione delle zampe e nelle velocità di oscillazione nei ratti DKO.
- Lo studio sottolinea l'importanza della coerenza dell'equipaggiamento per ottenere risultati affidabili.
Conclusioni
- Il sistema RatWalker consente un'analisi della deambulazione non invasiva con potenziali applicazioni più ampie in vari modelli di roditori.
- I risultati contribuiscono alla comprensione della disfunzione motoria nei modelli genetici di malattia.
- Le implicazioni si estendono allo studio dei disturbi della deambulazione associati a diverse condizioni neurologiche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il rilevamento precoce di lievi deficit motori in modelli genetici supporta la validazione degli obiettivi e la riduzione dei rischi meccanicistici nei programmi per le malattie neurodegenerative. Il sistema RatWalker consente un'analisi quantitativa della deambulazione non invasiva, in grado di identificare cambiamenti fenotipici prima dell'insorgenza di deficit motori evidenti, migliorando l'affidabilità predittiva nella selezione preclinica. Questo approccio facilita la selezione di candidati terapeutici fornendo biomarcatori traslabili del declino funzionale nei modelli di malattia di Parkinson.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche quantificando i parametri della deambulazione in modelli genetici di ratto della malattia di Parkinson.
- Valore operativo: Supporta la riduzione del rischio biologico mediante la valutazione riproducibile della funzione motoria in roditori che camminano liberamente.
- Valore predittivo: Facilita la caratterizzazione fenotipica precoce per informare le decisioni relative alla fiducia nel bersaglio e alla selezione del portafoglio.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera dati quantitativi ad alta risoluzione sulla deambulazione, inclusi la fase di appoggio, la durata della fase oscillante e il posizionamento delle zampe, per analisi comparative.
- Valore operativo: Fornisce letture standardizzate e scalabili adatte allo sviluppo di saggi e a campagne di screening di composti.
- Riproducibilità: Richiede un allestimento dell'apparecchiatura e criteri di valutazione costanti per garantire dati affidabili tra diversi esperimenti e laboratori.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Correla le alterazioni della deambulazione con parametri istologici, collegando i risultati comportamentali a quelli neuropatologici.
- Sistema rilevante per la malattia: Modella la disfunzione motoria in stadio precoce della forma genetica della malattia di Parkinson, prima dell’insorgenza di sintomi evidenti.
- De-risking meccanicistico: Identifica biomarcatori basati sulla deambulazione che riflettono la neuropatologia sottostante nei modelli carenti di Parkin/Pink1.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il sistema RatWalker si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio all'identificazione del composto promettente fino ai test di efficacia preclinica, consentendo una valutazione iterativa dei fenotipi motori durante le diverse fasi dello studio.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi misurando i deficit della deambulazione in modelli genetici per validare l'interazione con il bersaglio e la modulazione del percorso metabolico.
- Screening: Fornisce output quantitativi pronti per saggi per valutare gli effetti terapeutici sulla funzione motoria in modelli di roditori.
- Analisi: Fornisce parametri cinematici come fattore di appoggio, velocità della falcata e simmetria del passo per un confronto oggettivo tra genotipi.
- Ricerca traslazionale: Permette di correlare i cambiamenti nel cammino con marcatori di neurodegenerazione per supportare l'allineamento dei biomarcatori e approfondire la comprensione della patofisiologia.
- Riutilizzo aziendale: Rappresenta una piattaforma scalabile e non invasiva applicabile a diversi modelli di malattie neurologiche oltre al morbo di Parkinson.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva rilevando precoci deficit motori che rispecchiano i sintomi clinici prodromici.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità attraverso la standardizzazione del percorso di attraversamento, delle soglie di valutazione e dei controlli ambientali.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di proseguimento/cessazione riducendo la dipendenza da letture fenotipiche tardive nello sviluppo preclinico.
- Impatto sul portafoglio: Permette un avanzamento proporzionato al rischio identificando modelli con validità costruttiva per lo screening terapeutico.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in neuroscienze comportamentali e analisi del movimento basata su video per un corretto allestimento e interpretazione.
- È fortemente dipendente da una posizione costante della telecamera, condizioni di illuminazione uniformi e pulizia del percorso, al fine di ridurre al minimo la variabilità.
- Necessita di un accordo condiviso tra i membri del team sui criteri di valutazione della corsa (ad esempio, quattro passi consecutivi) per garantire la comparabilità dei dati.
- Deve tenere conto dei modelli specifici di locomozione tipici della specie quando il sistema viene adattato ad altri modelli o ceppi di roditori.
- È limitato alla valutazione dei parametri temporali e spaziali dell'andatura; non riesce a rilevare sequenze complesse di locomozione o la cinetica fine degli arti senza l’ausilio di metodi supplementari.
