Name: Modellazione del cancro al seno nel tessuto mammario umano utilizzando un sistema microfisiologico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Scopri la modellazione del cancro al seno utilizzando un sistema microfisiologico con tessuto mammario umano primario. Questo metodo consente di mantenere il tessuto vivo ex vivo per studiare le interazioni tumorali.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Vorremmo ringraziare il Tulane Flow Cytometry and Cell Sorting Core e il Tulane Histology Core per il loro supporto tecnico. Questo lavoro è stato supportato dal Southeastern Society of Plastic & Reconstructive Surgeons 2019 Research Grant e dalla National Science Foundation (EPSCoR Track 2 RII, OIA 1632854).

Tutti i tessuti umani sono stati raccolti in conformità con il protocollo #9189 approvato dall'Ufficio del Comitato di Revisione Istituzionale della LSUHSC.
1. Semina di cellule staminali derivate da adiposi (ASC) per fogli cellulari
<ol><li>Acquistare ASC da fonti commerciali o isolare dal tessuto mammario umano primario seguendo i protocollistabiliti 8,9. Sementi di ASC mammari umani a densità del 70% (~80.000 cellule/cm2 superficie) su piastre di coltura tissutale standard a 6 porri nel Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco integrato con siero bovino fetale al 10% e 1% penicillina/streptomicina (BC-MPS Media). Assicurarsi che gli ASC da utilizzare per formare i fogli cellulari siano inferiori al passaggio 10.<ol>
<li>Per ogni pozzo del sistema microfisiologico del cancro al seno (BC-MPS) che verrà generato, cellule di semi in 1 pozzo di coltura tissutale standard e 1 pozzo di dimensioni simili su placca plastica di coltura tissutale rivestita in poli(N-isopropilacrylamide) (pNIPAAm). Una piastra da 6 pozzi di BC-MPS richiederà una coltura tissutale standard 6 piastra del pozzo (in basso) e una piastra rivestita con pNIPAAm (in alto). Le piastre pNIPAAm possono essere acquistate da fonti commerciali o possono essere rivestite in laboratorio10,11,12.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ASC di coltura in un incubatore di coltura tissutale a 37 ° C e 5% CO2. Cambia i supporti ogni 2-3 giorni in un armadietto per la biosicurezza.</li>
	<li>Cultura gli ASC fino a diventare confluenti al 100% e formare un modello striato. A seconda della confluenza in cui sono stati seminati, ci saranno 7-10 giorni. I fogli cellulari confluenti sono necessari per ancorare il tessuto mammario adiposo vivace.</li>
</ol>2. Preparazione delle forniture necessarie per BC-MPS
<ol><li>Per preparare la gelatina per piatti a 6 porvili fare una soluzione di gelatina al 12% in H2O distillato. Mescolare 19 g di gelatina di tipo B (resistenza al gel di ~225 Bloom) e 125 ml di H2O in una bottiglia di supporto di vetro da 250 ml. Aggiungere 1,6 mL di 1 M NaOH alla soluzione per neutralizzare il pH.</li>
	<li>Autoclavare la soluzione sotto un ciclo liquido per 25 minuti per sterilizzare la soluzione.</li>
	<li>Lasciare raffreddare la soluzione a 37 °C. In un armadio sterile per la biosicurezza aggiungere 16 mL di soluzione di sale bilanciato sterile 10x Hanks (HBSS) alla soluzione per ottenere un volume finale di 160 mL. NOTA: La soluzione di gelatina può essere utilizzata immediatamente o conservata a temperatura ambiente per un uso successivo. La gelatina preparata è stabile a temperatura ambiente per 1 mese. Se saranno necessari solo pochi pistoni, è possibile realizzare una soluzione da 10 mL e filtrare sterilemente lo stesso giorno della realizzazione di BC-MPS come descrittoin precedenza 7.<ol>
<li>Per preparare la soluzione di gelatina mediante sterilizzazione del filtro, diluire 1 ml di 10x HBSS con 9 ml di H2O per fare una soluzione DI HBSS 1x in un tubo conico da 15 ml. Aggiungere 100 μL di 1 M NaOH a ciascun tubo da 10 ml, quindi aggiungere 0,7 g di gelatina alla soluzione. Mescolare vigorosamente la soluzione per sciogliere la gelatina.</li>
		<li>Incubare il tubo in un bagno d'acqua a 75 °C per 20 minuti tremando ogni 5 minuti. Utilizzare una siringa da 10 ml e un filtro siringa da 0,22 μm per filtrare la soluzione di gelatina. Filtrare la soluzione di gelatina direttamente sui pistoni in un armadio per la biosicurezza.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Stampa 3D o utilizzare un semplice acrilico per realizzare i pistoni utilizzati per il trasferimento dei fogli cellulari. Assicurarsi che i pistoni si adattino liberamente alla dimensione desiderata del pozzo. Un pistone stampato in 3D standard è mostrato nella figura 1. Gli stantuffo possono essere progettati utilizzando software di progettazione standard attrezzato per computer come TinkerCad e stampati utilizzando stampanti 3D a filamento compatibili con l'acido polilattico (PLA)13,14.</li>
	<li>Per preparare un rack per tenere i pistoni posizionare un rack per tubi da 15 ml in un armadio per la biosicurezza. Posizionare i pistoni a testa in giù nel rack, in modo che il fondo dei pistoni sia rivolto verso l'alto. Posizionare una scatola di plastica con un coperchio per il trasporto di BC-MPS nell'armadio per la biosicurezza. Si consiglia di che la scatola sia lunga almeno 35,5 cm x 28 cm di larghezza x 8,25 cm di altezza per adattarsi a 4 piastre di BC-MPS. Rimuovere il coperchio dalla scatola e spruzzare il rack, i pistoni e la scatola con 70% EtOH.</li>
	<li>Preparare lamette e forcep sterili in autoclave o mettendole in un armadio di biosicurezza e lavandole con 70% EtOH.</li>
	<li>Spruzzare i pistoni e la scatola con 70% EtOH e accendere la luce UV nell'armadio di biosicurezza per almeno 30 minuti per sterilizzare le forniture.</li>
</ol>3. Preparare i pistoni di gelatina e applicare sui fogli delle cellule superiori
<ol><li>Se la soluzione di gelatina è stata preparata in precedenza, scaldarla in un bagno d'acqua a 37 ° C per scioglierla.</li>
	<li>Pipettare la soluzione di gelatina sugli stantuffo nell'armadio di biosicurezza utilizzando una pipetta sierologica da 5 o 10 mL. Uno stantuffo per 1 pozzo di una piastra da 6 po 'richiederà ~ 2,5 mL di gelatina.</li>
	<li>Una volta che la gelatina si è solidificata sui pistoni (~ 30-45 min) spostare le piastre ASC rivestite con pNIPAAm nell'armadio di biosicurezza. Posizionare delicatamente i pistoni nei pozzi delle piastre ASC rivestite con pNIPAAm in modo che la gelatina contatti gli ASC. Posizionare una rondella metallica (~7,5 g) sullo stantuffo per appesantire lo stantuffo in modo che la gelatina sia a diretto contatto con la lastra cellulare ASC. Lasciare i pistoni sui fogli cellulari ASC a temperatura ambiente per 30 minuti.</li>
	<li>Spostare delicatamente la piastra con i pistoni nella scatola sterile nell'armadio di biosicurezza e posizionare il coperchio su di esso. Spostare la scatola in un frigorifero a 4 °C per 30 minuti. Se non è disponibile un frigorifero a 4 °C, posizionare la piastra sul ghiaccio in un secchio di ghiaccio nell'armadio per la biosicurezza per 30 minuti.</li>
</ol>4. Preparazione delle linee cellulari tumorali
<ol><li>Sementi le linee cellulari tumorali in un piatto standard di coltura tissutale T75 e tienile in coltura in modo che siano ~80% confluenti il giorno in cui BC-MPS verrà elaborato. (~200.000 cellule tumorali saranno necessarie per BC-MPS). Far crescere le cellule tumorali nei media normali. NOTA: Per identificare e isolare le cellule tumorali si raccomanda che le cellule siano trasfette da una proteina fluorescente per distinguerle dagli ASC e dal tessuto mammario. Il numero di cellule tumorali necessarie per BC-MPS è stato ottimizzato per le cellule MCF7 e MDA-MB-231. Altre linee cellulari potrebbero richiedere un'ulteriore ottimizzazione.</li>
	<li>Il giorno in cui la BC-MPS è in fase di preparazione spostare il pallone contenente le cellule tumorali nell'armadietto della biosicurezza. Aspirare il supporto dal pallone. Lavare il pallone con 5 ml di PBS.</li>
	<li>Aggiungere 1 ml di soluzione di distacco cellulare al pallone contenente le cellule tumorali e quindi incubare il pallone in un incubatore di 37 °C fino a quando le cellule non si sono staccate (~ 2-5 min).</li>
	<li>Nell'armadio della biosicurezza aggiungere 9 ml di PBS al pallone, trasferire le cellule in PBS in un tubo conico da 15 ml e contare il numero di cellulare usando un emocitometro.</li>
	<li>Centrifugare le cellule tumorali a 500 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Rimosoppo le celle nei supporti BC-MPS in modo che ci siano 2 x 106 celle/mL.</li>
	<li>Mettere le cellule tumorali in un bagno d'acqua a 37 °C fino a quando non sono pronte per essere aggiunte al tessuto umano.</li>
</ol>5. Trattamento del tessuto mammario umano
<ol><li>In un armadio di biosicurezza lavare il tessuto mammario umano (HBT) 3x con 10 mL di PBS sterile.</li>
	<li>Utilizzare forcelle sterili e una lama di rasoio per tritare grossolanamente la BC-MPS e cercare di rimuovere quanta più fascia e tessuto connettivo possibile. La mancata rimozione del tessuto connettivo può comportare che lo strato superiore asc non ancora correttamente l'HBT. NOTA: La fascia e il tessuto connettivo possono essere identificati dal suo aspetto bianco o chiaro rispetto al colore giallo del tessuto adiposo.</li>
	<li>Una volta rimosso il tessuto connettivo, utilizzare una lama di rasoio sterile per tritare finemente il tessuto fino a quando non ha una consistenza liquida omogenea. Il tessuto viene tritato finemente quando può essere facilmente pipettato utilizzando una punta sierologica da 25 mL.</li>
	<li>Utilizzare una lama sterile per tagliare la punta da una punta della pipetta p1000 per facilitare la pipetta dell'HBT tritato.</li>
	<li>In un tubo da 1,5 ml mescolare l'HBT tritato, le linee cellulari tumorali e i supporti BC-MPS (per 1 pozzo di una piastra di 6 pozzetti questo richiede 200 μL di HBT tritato, 100 μL di supporti BC-MPS e 100 μL di cellule tumorali).</li>
	<li>Spostare la piastra ASC che verrà utilizzata per il foglio di cellule inferiori dall'incubatore all'armadio di biosicurezza. Aspirare il supporto dalla piastra ASC inferiore. Pipettare la miscela al centro del pozzo della piastra ASC inferiore utilizzando una punta di pipetta p1000 con l'estremità distale tagliata dal passo 5.4</li>
	<li>Spostare la scatola contenente la piastra ASC superiore con i pistoni su di essa nell'armadio di biosicurezza. Rimuovere delicatamente i pistoni di gelatina dalla piastra rivestita con pNIPAAm e posizionarla sopra la miscela HBT. Aggiungere i supporti BC-MPS al pozzo (per 1 pozzo di una piastra a 6 porsi aggiungere 2 mL di supporti). Spostare con cura le piastre ASC inferiori con la miscela BC-MPS e i pistoni nella scatola di plastica sterile e posizionare il coperchio della scatola per il trasporto. NOTA: Il coperchio della piastra a 6 po porsi non si adatta di nuovo alla piastra ASC mentre i pistoni sono su. Occorre fare attenzione ad evitare di contaminare la cultura.</li>
	<li>Incubare la piastra inferiore nella scatola in un'incubatrice a 37 ° C fino a quando la gelatina non si è sciolta e lo strato ASC superiore ha iniziato ad aderire allo strato inferiore (~ 30 min).</li>
	<li>Spostare la scatola con le piastre nell'armadio per la biosicurezza. Rimuovere delicatamente i pistoni dalle piastre inferiori. Il tessuto con le cellule tumorali sarà ancorato al fondo del pozzo.</li>
	<li>Riposizionare il coperchio della piastra a 6 pozzi sulla piastra inferiore e incubare a 37 °C per sciogliere completamente la gelatina e consentire allo strato superiore di ancorarsi completamente allo strato inferiore (~ 30-60 min).</li>
	<li>Spostare delicatamente le piastre in un armadio di biosicurezza e aspirare il supporto con una pipetta sierologica da 10 mL. Aggiungere 2 mL di supporti freschi ad ogni pozzo. Aspirare dal bordo del pozzo e pipettare sul bordo del pozzo per evitare di slogare il tessuto.</li>
	<li>Mantenere il BC-MPS a 37 °C e 5% CO2 per il periodo di tempo desiderato e cambiare supporto ogni 2-3 giorni.</li>
</ol>6. Digestione di BC-MPS per l'analisi
<ol><li>Quando il BC-MPS è pronto per essere analizzato, spostare la piastra nell'armadio di biosicurezza. Rimuovere i supporti con una pipetta sierologica per evitare lo slogaggio accidentale di qualsiasi tessuto.</li>
	<li>Aggiungere 1 volume di PBS a ciascun pozzo.</li>
	<li>Rimuovere il PBS con una pipetta sierologica.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di soluzione di dissociazione cellulare ad ogni pozzo. Spostare la piastra di nuovo nell'incubatrice e incubare a 37 °C per 5 minuti per consentire alle cellule di staccarsi. In un armadio di biosicurezza, utilizzare un raschietto cellulare per staccare completamente le cellule e il tessuto dalla piastra di coltura.</li>
	<li>Trasferire la soluzione con il tessuto in un tubo conico da 15 ml utilizzando una pipetta sierologica. Aggiungere 2 ml di PBS ad ogni pozzo per raccogliere tutte le celle rimanenti e trasferire questa soluzione al tubo conico. Se le celle sono fluorescenti, avvolgere il tubo in un foglio di alluminio per proteggerlo dalla luce.</li>
	<li>Incubare il tubo a 37 °C sotto agitazione costante in uno shaker orbitale a 1 x g per 10-20 minuti per dissociare completamente le cellule dal tessuto.</li>
	<li>In un armadio di biosicurezza utilizzare una pipetta sierologica per interrompere eventuali grumi di cellule rimanenti nel tubo e filtrare il campione attraverso un colino tissutale da 250 μm in un nuovo tubo da 15 ml. Pipettare lentamente la soluzione attraverso il colino in modo che non trabocca.</li>
	<li>Risciacquare il colino con 1 mL PBS per raccogliere tutte le cellule ancora nel colino.</li>
	<li>Centrifugare i campioni a 500 x g a temperatura ambiente per 5 min. Dopo la centrifugazione, gli adipociti galleggiano sullo strato superiore della soluzione mentre le cellule tumorali e gli ASC saranno mescolati insieme in un pellet nella parte inferiore del tubo.</li>
	<li>Per isolare gli adipociti versare delicatamente lo strato superiore in un nuovo tubo o, in alternativa, tagliare la punta da una punta della pipetta p1000 e trasferire lo strato superiore su un nuovo tubo. Centrifugare nuovamente il campione a 500 x g per 5 minuti e utilizzare una siringa e un ago per rimuovere la soluzione dal basso degli adipociti in modo che rimangano solo gli adipociti. Gli adipociti sono ora pronti per l'analisi</li>
	<li>Dopo aver rimosso gli adipociti dalla soluzione, separare gli ASC e le cellule tumorali l'uno dall'altro per l'analisi se le cellule tumorali sono state precedentemente trasfette con una proteina fluorescente. Aspirare la soluzione rimanente dal tubo contenente gli ASC e le cellule tumorali senza interrompere il pellet cellulare. Risospendare il pellet nei supporti PBS o BC-MPS e utilizzare la citometria del flusso per ordinare le cellule in base alla fluorescenza.</li>
</ol>

<ol><li>DeSantis, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+statistics%2C+2019%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+A+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Breast cancer statistics, 2019.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 69 (6), 438-451 (2019).</li>
<li>NIH Categorical Spending -NIH Research Portfolio Online Reporting Tools (RePORT). , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://report.nih.gov/categorical_spending.aspx">https://report.nih.gov/categorical_spending.aspx</a> (2020).</li>
<li>Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+clinical+trial+success+rates+and+related+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Biostatistics%22%5BJournal%5D)">Estimation of clinical trial success rates and related parameters.</a> Biostatistics. 20 (2), 273-286 (2019).</li>
<li>Sutherland, M. L., Fabre, K. M., Tagle, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+National+Institutes+of+Health+Microphysiological+Systems+Program+focuses+on+a+critical+challenge+in+the+drug+discovery+pipeline%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">The National Institutes of Health Microphysiological Systems Program focuses on a critical challenge in the drug discovery pipeline.</a> Stem Cell Research & Therapy. 4, Suppl 1 1(2013).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+tumors+educate+the+proteome+of+stromal+tissue+in+an+individualized+but+coordinated+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Breast tumors educate the proteome of stromal tissue in an individualized but coordinated manner.</a> Science Signaling. 10 (491), (2017).</li>
<li>Lau, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sandwiched+white+adipose+tissue%3A+A+microphysiological+system+of+primary+human+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">Sandwiched white adipose tissue: A microphysiological system of primary human adipose tissue.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 24 (3), 135-145 (2018).</li>
<li>Scahill, S. D., Hunt, M., Rogers, C. L., Lau, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microphysiologic+platform+for+human+fat%3A+sandwiched+white+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A microphysiologic platform for human fat: sandwiched white adipose tissue.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e57909(2018).</li>
<li>Yu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipogenic+differentiation+of+adipose-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Adipose-Derived+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Adipogenic differentiation of adipose-derived stem cells.</a> Adipose-Derived Stem Cells. 702, 193-200 (2011).</li>
<li>Bunnell, B., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cells%3A+Isolation%2C+expansion+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cells: Isolation, expansion and differentiation.</a> Methods. 45 (2), 115-120 (2008).</li>
<li>Ebara, M., Hoffman, J. M., Stayton, P. S., Hoffman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+modification+of+microfluidic+channels+by+UV-mediated+graft+polymerization+of+non-fouling+and+%27smart%27+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+Physics+and+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Surface modification of microfluidic channels by UV-mediated graft polymerization of non-fouling and 'smart' polymers.</a> Radiation Physics and Chemistry. 76 (8-9), 1409-1413 (2007).</li>
<li>Lin, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermo-responsive+poly%28N-isopropylacrylamide%29+grafted+onto+microtextured+poly%28dimethylsiloxane%29+for+aligned+cell+sheet+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Thermo-responsive poly(N-isopropylacrylamide) grafted onto microtextured poly(dimethylsiloxane) for aligned cell sheet engineering.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 99, 108-115 (2012).</li>
<li>Turner, W. S., Sandhu, N., McCloskey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering%3A+Construction+of+a+multicellular+3D+scaffold+for+the+delivery+of+layered+cell+sheets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering: Construction of a multicellular 3D scaffold for the delivery of layered cell sheets.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), e51044(2014).</li>
<li>Tinkercad. Create 3D digital designs with online CAD. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Tinkercad%22">Tinkercad</a>. , (2020).</li>
<li>Halfter, K., Mayer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bringing+3D+tumor+models+to+the+clinic+-+predictive+value+for+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Bringing 3D tumor models to the clinic - predictive value for personalized medicine.</a> Biotechnology Journal. 12 (2), (2017).</li>
<li>Wang, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammary+adipocytes+stimulate+breast+cancer+invasion+through+metabolic+remodeling+of+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+insight%22%5BJournal%5D)">Mammary adipocytes stimulate breast cancer invasion through metabolic remodeling of tumor cells.</a> JCI insight. 2 (4), 87489(2017).</li>
<li>Qiu, B., Simon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BODIPY+493%2F503+staining+of+neutral+lipid+droplets+for+microscopy+and+quantification+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocols%22%5BJournal%5D)">BODIPY 493/503 staining of neutral lipid droplets for microscopy and quantification by flow cytometry.</a> Bio-Protocols. 6 (17), 1912(2016).</li>
<li>Fotos, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+time-lapse+microscopy%2C+and+high-resolution+tracking+of+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Automated time-lapse microscopy, and high-resolution tracking of cell migration.</a> Cytotechnology. 51 (1), 7-19 (2006).</li>
<li>Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+source+software+for+quantification+of+cell+migration%2C+protrusions%2C+and+fluorescence+intensities%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities.</a> Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).</li>
<li>Akiyama, Y., Kikuchi, A., Yamato, M., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrathin+poly%28N-isopropylacrylamide%29+grafted+layer+on+polystyrene+surfaces+for+cell+adhesion%2Fdetachment+control%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%3A+the+ACS+Journal+of+Surfaces+and+Colloids%22%5BJournal%5D)">Ultrathin poly(N-isopropylacrylamide) grafted layer on polystyrene surfaces for cell adhesion/detachment control.</a> Langmuir: the ACS Journal of Surfaces and Colloids. 20 (13), 5506-5511 (2004).</li>
<li>Shingyochi, Y., Orbay, H., Mizuno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cells+for+wound+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Biological+Therapy%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cells for wound repair and regeneration.</a> Expert Opinion on Biological Therapy. 15 (9), 1285-1292 (2015).</li>
<li>Tokunaga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fat+depot-specific+gene+signature+and+ECM+remodeling+of+Sca1%28high%29+adipose-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%3A+Journal+of+the+International+Society+for+Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Fat depot-specific gene signature and ECM remodeling of Sca1(high) adipose-derived stem cells.</a> Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 36, 28-38 (2014).</li>
<li>Belgodere, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+breast+cancer+microenvironments+and+3D+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Engineering breast cancer microenvironments and 3D bioprinting.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 66(2018).</li>
<li>Cao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte+and+lipid+metabolism+in+cancer+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Adipocyte and lipid metabolism in cancer drug resistance.</a> The Journal of Clinical Investigation. 129 (8), 3006-3017 (2019).</li>
<li>Dirat, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-associated+adipocytes+exhibit+an+activated+phenotype+and+contribute+to+breast+cancer+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Cancer-associated adipocytes exhibit an activated phenotype and contribute to breast cancer invasion.</a> Cancer Research. 71 (7), 2455-2465 (2011).</li>
<li>Druso, J. E., Fischbach, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+properties+of+extracellular+matrix%3A+Linking+obesity+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Biophysical properties of extracellular matrix: Linking obesity and cancer.</a> Trends in Cancer. 4 (4), 271-273 (2018).</li>
<li>Luo, H., Tu, G., Liu, Z., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-associated+fibroblasts%3A+A+multifaceted+driver+of+breast+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Cancer-associated fibroblasts: A multifaceted driver of breast cancer progression.</a> Cancer Letters. 361 (2), 155-163 (2015).</li>
<li>Chandler, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implanted+adipose+progenitor+cells+as+physicochemical+regulators+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Implanted adipose progenitor cells as physicochemical regulators of breast cancer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (25), 9786-9791 (2012).</li>
<li>Oskarsson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+components+in+breast+cancer+progression+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Breast%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix components in breast cancer progression and metastasis.</a> The Breast. 22, 66-72 (2013).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+1A1+%28COL1A1%29+promotes+metastasis+of+breast+cancer+and+is+a+potential+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22Discovery+Medicine%22%5BJournal%5D)">Collagen 1A1 (COL1A1) promotes metastasis of breast cancer and is a potential therapeutic target.</a> Discovery Medicine. 25 (139), 211-223 (2018).</li>
<li>Ahfeldt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+human+pluripotent+stem+cells+into+white+and+brown+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Programming human pluripotent stem cells into white and brown adipocytes.</a> Nature Cell Biology. 14 (2), 209-219 (2012).</li>
<li>Volz, A. -C., Omengo, B., Gehrke, S., Kluger, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+the+use+of+differentiated+adipose-derived+stem+cells+and+mature+adipocytes+to+model+adipose+tissue+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%3B+Research+in+Biological+Diversity%22%5BJournal%5D)">Comparing the use of differentiated adipose-derived stem cells and mature adipocytes to model adipose tissue in vitro.</a> Differentiation; Research in Biological Diversity. 110, 19-28 (2019).</li>
<li>Zimta, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+links+between+central+obesity+and+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Molecular links between central obesity and breast cancer.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), 5364(2019).</li>
<li>Bousquenaud, M., Fico, F., Solinas, G., Rüegg, C., Santamaria-Martínez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+promotes+the+expansion+of+metastasis-initiating+cells+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Obesity promotes the expansion of metastasis-initiating cells in breast cancer.</a> Breast Cancer Research. 20 (1), 104(2018).</li>
<li>Robado de Lope, L., Alcíbar, O. L., Amor López, A., Hergueta-Redondo, M., Peinado, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-adipose+tissue+crosstalk%3A+fuelling+tumour+metastasis+by+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tumour-adipose tissue crosstalk: fuelling tumour metastasis by extracellular vesicles.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1737), 20160485(2018).</li>
<li>Insua-Rodríguez, J., Oskarsson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix in breast cancer.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 41-55 (2016).</li>
<li>Sabol, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptin+produced+by+obesity-altered+adipose+stem+cells+promotes+metastasis+but+not+tumorigenesis+of+triple-negative+breast+cancer+in+orthotopic+xenograft+and+patient-derived+xenograft+models%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%3A+BCR%22%5BJournal%5D)">Leptin produced by obesity-altered adipose stem cells promotes metastasis but not tumorigenesis of triple-negative breast cancer in orthotopic xenograft and patient-derived xenograft models.</a> Breast Cancer Research: BCR. 21 (1), 67(2019).</li>
<li>Cui, X. D., Gao, D. Y., Fink, B. F., Vasconez, H. C., Pu, L. L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+human+adipose+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of human adipose tissues.</a> Cryobiology. 55 (3), 269-278 (2007).</li>
<li>Skardal, A., Shupe, T., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid-on-a-chip+and+body-on-a-chip+systems+for+drug+screening+and+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Organoid-on-a-chip and body-on-a-chip systems for drug screening and disease modeling.</a> Drug Discovery Today. 21 (9), 1399-1411 (2016).</li>
<li>Clark, A. M., Allbritton, N. L., Wells, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+microphysiological+tissue+systems+of+cancer+metastasis+to+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">Integrative microphysiological tissue systems of cancer metastasis to the liver.</a> Seminars in Cancer Biology. , (2020).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Sono necessari nuovi sistemi per modellare il cancro al seno umano per sviluppare una migliore comprensione della malattia. Lo sviluppo di sistemi microfisiologici umani per modellare le impostazioni delle malattie che includono ECM nativo e cellule stromali aumenterà il potere predittivo degli studi preclinici. Il modello BC-MPS qui presentato è un sistema di nuova sviluppo che supera i limiti dei modelli precedenti consente la valutazione di BC nel suo ambiente HBT nativo. Questo sistema può essere utilizzato con linee...

Ogni anno, più di 40.000 donne negli Stati Uniti muoiono di cancro al seno (BC)1. Nonostante oltre 700 milioni di dollari investiti nella ricerca BC ogni anno, il 97% dei farmaci BC candidati fallisce gli studiclinici 2,3. Sono necessari nuovi modelli per migliorare la pipeline di sviluppo dei farmaci e la nostra comprensione di BC. Il programma NIH Microphysiological (MPS) ha delineato le caratteristiche necessarie per modelli rivoluzionari per migliorare la traduzione della scienza di base in successo clinico4. Questi includevano l'uso di cellule o tessuti umani primari, stabili in coltura per 4 settimane, e l'inclusione dell'architettura dei tessuti nativi e della risposta fisiologica.
Gli attuali modelli BC in vitro, come la coltura bidimensionale delle linee cellulari BC, la co-coltura dell'inserto a membrana e gli sferoidi tridimensionali e gli organoidi, non soddisfano i criteri delle MPS del NIH perché nessuno di questi riassume l'architettura nativa del tessuto mammario. Quando a questi sistemi viene aggiunta una matrice extracellulare (ECM), l'ECM mammario non viene utilizzato; invece, vengono utilizzati gel di collagene e matrici di membrana basale.
Gli attuali sistemi in vivo, come gli xenoinnesti derivati dal paziente (PDX), allo stesso modo non soddisfano i criteri delle MPS del NIH perché i tessuti mammari murini differiscono notevolmente dal seno umano. Inoltre, le interazioni sistema immunitario-BC sono sempre più riconosciute come chiave nello sviluppo tumorale, ma i modelli murini immunocompro compromessi utilizzati per generare tumori PDX mancano di cellule T mature, cellule B e cellule natural killer. Inoltre, mentre pdx consente di mantenere ed espandere i tumori del seno primario, i tumori PDX risultanti vengono infiltrati con cellule stromali murine primarie e ECM5.
Per superare queste sfide, abbiamo sviluppato una nuova MPS mammario umano tridimensionale, ex vivo, che soddisfa i criteri NIH MPS. Il fondamento della nostra MPS mammario è costituito dall'incastro del tessuto mammario umano primario (HBT) tra due fogli di cellule staminali derivate da adiposi (ASC), anche isolate dall'HBT(Figura 1). I pistoni per il trasferimento dei fogli cellulari per sandwich l'HBT può essere stampato in 3D o realizzato con semplici plastiche acriliche (Figura 1H, I). Questa tecnica adatta il nostro approccio precedentemente descritto per coltivare il tessuto adipocite bianco umano primario6,7. La MPS mammario può quindi essere seminata da un modello bc di scelta, che va dalle linee cellulari BC standard ai tumori al seno umani primari. Qui mostriamo che questi BC-MPS sono stabili in coltura per più settimane(Figura 2); includere elementi nativi dell'HBT come adipociti mammari, ECM, endotelio, cellule immunitarie (Figura 3); e ricapitolare le interazioni fisiologiche tra BC e HBT come il crosstalk metabolico (Figura 4). Infine, mostriamo che BC-MPS consente lo studio del movimento ameboide delle cellule BC in tutta l'HBT(Figura 5).

<table><tbody><tr><td>Accumax</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>1333</td><td>Soluzione di dissociazione cellulare per la separazione di BC-MPS</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Corning</td><td>25-058-CI</td><td>Soluzione di distacco cellulare per il passaggio di cellule</td></tr><tr><td>Contenitore BioStor 16oz</td><td>National Scientific Supply Co</td><td>MPCE-T016</td><td>Per il trasporto di tessuti sterili</td></tr><tr><td>Colture cellulari Fiasche da 75 cm</td><td>Corning</td><td>430641U</td><td>Per la coltura di ASC</td></tr><tr><td>Provette coniche 15mL&nbsp;</td><td>ThermoScientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>Pinze curve</td><td>ThermoScientific</td><td>1631T5</td><td>Per manovrare i tessuti durante la macinazione&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM a basso contenuto di glucosio, con Glutamax</td><td>Gibco</td><td>10567-014</td><td>Per la coltura di ASC e BC-MPS</td></tr><tr><td>FBS Qualificato</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 10x</td><td>Gibco</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>221465</td><td></td></tr><tr><td>Nunc UpCell Piastre a 6 pozzetti</td><td>ThermoScientific</td><td>174901</td><td>Top foglio cellulare ASC</td></tr><tr><td>PBS</td><td>GIBCO</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Penna/Strep 5.000U</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri 150 cm</td><td>FisherBrand</td><td>FB0875714</td><td>Per trattenere i tessuti durante la macinazione&nbsp;</td></tr><tr><td>Lamette da barba</td><td>VWR</td><td>55411-055</td><td>Filo singolo per tritare il tessuto</td></tr><tr><td>Filtro 250um&nbsp;</td><td>ThermoScientific</td><td>87791</td><td>Per la separazione di</td></tr><tr><td>piastre a 6 pozzetti per colture tissutali</td> BC-MPS <td>Corning</td><td>3506</td><td>Celle ASC inferiori Pesi</td></tr><tr><td>/Rondelle Elementi</td><td>di fissaggio BCP BCP672</td><td></td><td>Per pesare pistoni con diametro interno di 1/2"</td></tr></tbody></table>

modellazione del cancro al seno nel tessuto mammario umano utilizzando un sistema microfisiologico

Modeling Breast Cancer in Human Breast Tissue using a Microphysiological System

Il cancro al seno (BC) rimane una delle principali cause di morte per le donne. Nonostante oltre 700 milioni di dollari investiti nella ricerca BC ogni anno, il 97% dei farmaci BC candidati fallisce gli studi clinici. Pertanto, sono necessari nuovi modelli per migliorare la nostra comprensione della malattia. Il programma NIH Microphysiological Systems (MPS) è stato sviluppato per migliorare la traduzione clinica delle scoperte scientifiche di base e promettendo nuove strategie terapeutiche. Qui presentiamo un metodo per generare MPS per i tumori al seno (BC-MPS). Questo modello adatta un approccio precedentemente descritto di coltivare il tessuto adiposo bianco umano primario (WAT) incattando WAT tra fogli di cellule staminali derivate da adiposi (ASC). Nuovi aspetti della nostra BC-MPS includono la semina di cellule BC in tessuto mammario umano non danneggiato (HBT) contenente matrice extracellulare nativa, adipociti maturi, fibroblasti residenti e cellule immunitarie; e l'incastro dell'admixture BC-HBT tra fogli ASC derivati da HBT. Il BC-MPS risultante è stabile in coltura ex vivo per almeno 14 giorni. Questo sistema modello contiene più elementi del microambiente che influenzano BC tra cui adipociti, cellule stromali, cellule immunitarie e matrice extracellulare. Quindi BC-MPS può essere usato per studiare le interazioni tra BC e il suo microambiente. 
Dimostriamo i vantaggi della nostra BC-MPS studiando due comportamenti BC noti per influenzare la progressione del cancro e la metastasi: 1) motilità BC e 2) crosstalk metabolico BC-HBT. Mentre la motilità BC è stata precedentemente dimostrata utilizzando l'imaging intravitale, BC-MPS consente l'imaging time-lapse ad alta risoluzione utilizzando la microscopia a fluorescenza per diversi giorni. Inoltre, mentre il crosstalk metabolico è stato precedentemente dimostrato utilizzando cellule BC e pre-adipociti murini differenziati in adipociti immaturi, il nostro modello BC-MPS è il primo sistema a dimostrare questo crosstalk tra adipociti mammari umani primari e cellule BC in vitro.

Stabilità nella cultura BC-MPS è un sistema microfisiologico stabile che può essere coltivato in vitro per un massimo di almeno 14 giorni. Un'immagine a campo luminoso dei fogli cellulari ASC è stata scattata con ingrandimento 100x per visualizzare il modello striato del foglio confluente (Figura 2A). I fogli cellulari ASC sono stabili in coltura per almeno 4 settimane. BC-MPS a 14 giorni di coltura in un pozzo di una piastra a 6 poggiaso ...

Questo protocollo descrive la costruzione di un sistema microfisiologico in vitro per lo studio del cancro al seno utilizzando il tessuto mammario umano primario con materiali di prima qualità.

Modellazione del cancro al seno nel tessuto mammario umano utilizzando un sistema microfisiologico

Breast cancer (BC) remains a leading cause of death for women. Despite more than $700 million invested in BC research annually, 97% of candidate BC drugs ...

Questo è il primo protocollo che consente al tessuto mammario umano di essere mantenuto vivo ex vivo per lunghi periodi di tempo consentendo direttamente lo studio delle interazioni tra il tessuto mammario umano e il cancro al seno umano. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente di mantenere in vita ex vivo pezzi macroscopici del tessuto mammario umano tra cui adipociti mammari, cellule immunitarie, strutture vascolari, strutture duttali e matrice extracellulare. Questa tecnica ha importanti implicazioni per diverse aree della ricerca sul cancro al seno tra cui la medicina personalizzata, lo sviluppo farmaceutico e la fisiopatologia dell'iniziazione al tumore e processi di cancro al seno più lenti come la fibrosi e il rimodellamento della matrice extracellulare.A dimostrare questa procedura sono Katherine Hebert, una studentessa di tulane e Rakesh Gurrala una studentessa di medicina Tulane del mio laboratorio. Per iniziare, sciogliere la soluzione di gelatina preparata in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius. Utilizzare una pipetta sierologica a cinque o 10 millilitri per erogare 2,5 millilitri di questa soluzione su ogni pistone per pozzi di una piastra a sei pozzetti.Una volta che la gelatina si è solidificata, spostare le piastre ASC codificate pNIPAAm nell'armadio di biosicurezza. Posizionare delicatamente i pistoni nei pozzi di questi piatti in modo che la gelatina contatti gli ASC. Posizionare una rondella metallica sullo stantuffo per appesantirla in modo che la gelatina sia a diretto contatto con la lastra ASC per 30 minuti a temperatura ambiente.Spostare delicatamente la piastra con i pistoni nella scatola sterile nell'armadio di biosicurezza e posizionare il coperchio su di essa. Spostare la scatola in un frigorifero di quattro gradi o posizionare la piastra sul ghiaccio e un secchio di ghiaccio nell'armadio di biosicurezza per 30 minuti. In un armadio di biosicurezza, lavare il tessuto mammario umano tre volte con 10 millilitri di PBS sterile.Utilizzare forcelle sterili e una lama di rasoio per tritare grossolanamente la BC-MPS e cercare di rimuovere quanta più fascia e tessuto connettivo possibile. Una volta rimosso il tessuto connettivo, utilizzare una lama sterile per tritare finalmente il tessuto fino a quando non ha una consistenza liquida omogenea. Tagliare la punta di una punta della pipetta P1000 per facilitare la pipettazione del tessuto tritato.In un tubo da 1,5 millilitri, unire il tessuto tritacanza, le linee cellulari tumorali e i supporti BC-MPS come descritto nel manoscritto testuale. Spostare la piastra ACS che verrà utilizzata per il foglio di celle inferiori dall'incubatore all'armadio di biosicurezza e aspirare il supporto dalla piastra. Pipettare la miscela di tessuto mammario preparata al centro del pozzo della piastra ACS inferiore utilizzando la punta della pipetta tagliata, spostare la scatola contenente la piastra ACS superiore con pistoni nell'armadio di bio-sicurezza.Rimuovere delicatamente i pistoni di gelatina dalla piastra rivestita pNIPAAm e posizionarli sopra la miscela di tessuto. Aggiungere i supporti BC-MPS al pozzo e spostare con attenzione le piastre ACS inferiori con la miscela BC-MPS e i pistoni nella scatola di plastica sterile. Posizionare il coperchio della scatola per il trasporto, facendo attenzione ad evitare la contaminazione della coltura.Incubare la piastra inferiore nella scatola e l'incubatore di 37 gradi Celsius fino a quando la gelatina non viene sciolta e lo strato ACS superiore ha iniziato ad aderire allo strato inferiore. Quindi spostare la scatola con le piastre nell'armadio di biosicurezza, rimuovere delicatamente i pistoni dalle piastre inferiori per osservare il tessuto con le cellule tumorali ancorate sul fondo del pozzo. Riposizionare il coperchio della piastra a sei pozzi sulla piastra inferiore e incubare a 37 gradi per sciogliere completamente la gelatina e consentire allo strato superiore di ancorarsi allo strato inferiore.Spostare delicatamente le piastre in un armadio di biosicurezza e aspirare il supporto dal bordo del pozzo con una pipetta sierologica da 10 millilitri. Aggiungere due millilitri di mezzi freschi sul bordo di ogni pozzo per evitare di slogare il tessuto. Mantenere il BC-MPS a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per il periodo di tempo desiderato.Cambiare i media ogni due o tre giorni. Spostare la piastra nell'armadio di biosicurezza quando bc-MPS è pronto per essere analizzato. Rimuovere i supporti con una pipetta sierologica per evitare lo slogaggio accidentale di qualsiasi tessuto.Aggiungere un volume di PBS a ciascun pozzo. Quindi rimuovere il PBS con una pipetta sierologica. Aggiungere un millilitro di soluzione di dissociazione cellulare ad ogni pozzo e spostare la piastra nell'incubatrice per cinque minuti per consentire a queste cellule di staccarsi.Dopo l'incubazione, utilizzare un raschietto cellulare per staccare completamente le cellule e il tessuto dalla piastra di coltura in un armadio di biosicurezza. Trasferire la soluzione con il tessuto in un tubo conico da 15 millilitri e raccogliere tutte le cellule rimanenti aggiungendo due millilitri di PBS. Avvolgere il tubo con un foglio di alluminio se le celle sono fluorescenti.Incubare il tubo a 37 gradi sotto agitazione costante in uno shaker orbitale in una volta G per 10-20 minuti per dissociare completamente le cellule dal tessuto. In un armadio di biosicurezza, utilizzare una pipetta sierologica per interrompere eventuali grumi rimanenti di cellule nel tubo. E filtrare il campione attraverso un colino tissutale da 250 micro metri in un nuovo tubo da 15 millilitri.Risciacquare il colino con un millilitro di PBS per raccogliere eventuali cellule rimanenti. Centrifugare i campioni a 500 volte g a temperatura ambiente per cinque minuti per separare gli adipociti che galleggiano nello strato superiore dalle cellule tumorali e dagli ASC mescolati insieme in un pellet. Trasferire lo strato di adipocite su un nuovo tubo utilizzando una punta di pipetta con taglio smussato.Centrifugare nuovamente il campione e utilizzare una siringa e un ago per rimuovere la soluzione rimanente dal basso degli adipociti. Aspirare la soluzione rimanente dal tubo contenente gli ASC e le cellule tumorali senza interrompere il pellet cellulare. Sospendere di nuovo il pellet nei supporti PBS o BC-MPS e utilizzare la citometria di flusso per ordinare le cellule in base alla fluorescenza.Il modello stri-aided del foglio ASC confluente è mostrato qui. Il tessuto mammario umano vivace era ancorato stabile dai fogli cellulari ASC sul fondo del pozzo dopo 14 giorni di coltura. Le immagini di microscopia fluorescente dimostrano la stabilità del BC-MPS con MDA-MB-231 che esprime linee cellulari RFP dopo 14 giorni e con triplo tumore negativo espianta PDX per almeno sei giorni.Bc-MPS contenente tessuto mammario è stato coltivato in vitro per 14 giorni, macchiato e immagine per dimostrare gli elementi nativi del tessuto con ingrandimento 100X e 20X. La colorazione dei marcatori dei macrofagi è stata utilizzata per mostrare la conservazione dei macrofagi primari dopo tre e sette giorni di coltura. L'analisi citometrica del flusso delle cellule MDA-MB-231 macchiate di Bodipy dopo 14 giorni indica un minimo accumulo lipidico nella coltura 2D e un ampio accumulo lipidico e BC-MPS.La proporzione di cellule MDA-MB-231 lipidiche positive era 26,2 volte maggiore in BC-MPS rispetto alla coltura 2D. Le cellule coltivate in BC-MPS visualizzate aumentano le goccioline lipidiche rispetto alle cellule coltivate in coltura 2D standard. Le immagini time-lapse di RFP etichettate BC-MPS con cellule MDA-MB-231 mostravano un movimento ameboide di 231 cellule con pseudo pod e alta motilità.Il tessuto mammario deve essere tritato abbastanza piccolo e separato abbastanza da essere distribuito sul fondo del pozzo. Il tessuto mammario è molto vivace e se i pezzi sono troppo grandi o raggruppati troppo strettamente insieme, i fogli cellulari ASC non saranno in grado di ancorare il tessuto mammario al fondo del pozzo. I costrutti di cancro al tessuto mammario risultanti possono subire una digestione enzimatica per isolare particolari tipi di cellule di interesse.Ciò consentirà di rispondere a domande chiave come come le cellule tumorali nel tessuto mammario rispondono in modo diverso alla chemioterapia rispetto alla coltura 2D tradizionale o agli organoidi.

modeling-breast-cancer-human-breast-tissue-using-microphysiological

Research

Ricerca

JoVE Journal

Cancer Research

Ricerca sul cancro

A lungo termine Cultura di campioni umani cancro al seno e la loro analisi utilizzando la tomografia ottica di proiezione

Nei metodi standard di coltura le cellule sono presi dal loro ambiente fisiologico e cresciute sulla superficie di plastica di un piatto. Per studiare il comportamento delle cellule primarie midollo osseo umano è stato creato un sistema di coltura 3-D in cui le cellule sono coltivate in condizioni riassumono il microambiente nativo del tessuto.

A Three-dimensional Tissue Culture modello per studiare Primario Osso Osseo e le sue Malignità

Il cancro è una malattia complessa che è influenzata dal tessuto circostante il tumore nonché pro- locale e anti-infiammatori mediatori. Pertanto, modelli iniezione ortotropici, anziché modelli sottocutanee possono essere utili per studiare la progressione del cancro in un modo che imita migliori patologia umana.

Iniezione ortotopico di cellule di carcinoma mammario nel mammaria Fat Pad di Mice per studiare la crescita del tumore.

Abbiamo sviluppato un nuovo modello di ex vivo per studiare l'azione di ormoni nel seno umano. Si basa su microstrutture tessuti isolati da campioni di tessuto del seno chirurgici che conservano l'architettura del tessuto, le interazioni intercellulari, e segnalazione paracrina.

Un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modello per studiare Hormone azione in seno umano

I protocolli sono descritti per studiare la migrazione delle cellule del cancro al seno, la proliferazione e la colonizzazione in un tessuto osseo sistema modello espianto umana.

Metodi per la coltura di femore umano espianti di tessuto di studio sul carcinoma della mammella cellulare colonizzazione della nicchia metastatico

Per studiare la progressione del tumore ovarico in un modello fisiologicamente rilevanti, sferoidi multicellulari sono state coltivate in un Microdevice sotto flusso del fluido simulato. Questo modello 3D dinamica emula l'ambiente intraperitoneale con i componenti cellulari e meccanici in cui si verifica metastasi del cancro ovarico.

Modellazione Comportamento Ovarian Cancer multicellulare Spheroid in un Microdevice dinamica 3D peritoneale

Qui, presentiamo un protocollo per impiantare cellule di cancro al seno nel cuscinetto grasso mammario in modo semplice, meno invasiva e facile da maneggiare, e questo modello di cancro al seno ortotopico del topo con un ambiente adeguato cuscinetto grasso mammario può essere utilizzato per approfondire vari aspetti della cancro.

Orthotopic iniezione delle cellule di cancro al seno in topi cuscinetto grasso mammario

L'obiettivo di questo protocollo è descrivere un nuovo approccio di modellazione del cancro al seno basato sull'iniezione intraduttiva di adenovirus che esprime Cre nelle ghiandole mammarie dei topi. Questo approccio consente la manipolazione sia di tipo cellulare che di un organo degli eventi oncogeni in modo controllato temporaneamente.

Modellare il cancro al seno tramite un'iniezione intraduttiva di adenovirus che esprime la creminazione nella ghiandola mammaria del topo

La diafonia tra cellule epiteliali mammarie e cellule endoteliali contribuisce in modo importante alla progressione del cancro al seno, alla crescita del tumore e alle metastasi. In questo studio, gli sferoidi sono stati realizzati da cellule di cancro al seno insieme a cellule endoteliali vascolari e / o linfatiche e dimostrano la loro applicabilità come sistema in vitro per la ricerca sul cancro al seno.

Sferoidi epiteliali ed endoteliali mammari come potenziale modello funzionale in vitro per la ricerca sul cancro al seno

Questo protocollo presenta un modello tumore-on-a-chip fisiologicamente rilevante per eseguire ricerche di base e traslazionali sul cancro umano ad alto rendimento, facendo progredire lo screening dei farmaci, la modellazione delle malattie e gli approcci di medicina personalizzata con una descrizione delle procedure di carico, manutenzione e valutazione.

Creazione di un modello fisiologico di microtumore vascolarizzato umano per la ricerca sul cancro

Questo protocollo descrive un metodo definito a base di idrogel per generare organoidi mammari umani che riproducono caratteristiche chiave della morfogenesi mammaria in un sistema di coltura tridimensionale controllato.

Un metodo definito a base di idrogel per generare organoidi mammari umani tridimensionali che riproducono la morfogenesi mammaria

Scopri la modellazione del cancro al seno utilizzando un sistema microfisiologico con tessuto mammario umano primario. Questo metodo consente di mantenere il tessuto vivo ex vivo per studiare le interazioni tumorali.

Modellazione del cancro al seno nel tessuto mammario umano utilizzando un sistema microfisiologico

Esplora altri video