Valutazione in tempo reale della microperfusione del midollo spinale in un modello suino di ischemia/riperfusione
10 dicembre 2020
La microcircolazione del midollo spinale svolge un ruolo fondamentale nella lesione del midollo spinale. La maggior parte dei metodi non consente la valutazione in tempo reale della microcircolazione del midollo spinale, che è essenziale per lo sviluppo di terapie mirate alla microcircolazione. Qui, proponiamo un protocollo che utilizza sonde Laser-Doppler-Flow Needle in un modello animale di ischemia/ riperfusione di grandi dimensioni.
Il nostro protocollo fornisce un metodo riproducibile per la valutazione in tempo reale della microcircolazione del midollo spinale. Offre la possibilità di valutare approcci terapeutici sul microcircolo del midollo spinale e sulle condizioni di riperfusione ischemica. La nostra tecnica è facile da imparare, minimamente invasiva e ci offre l'opportunità di valutare la microperfusione del midollo spinale in parallelo con la pressione del liquido cerebrospinale e la macroemodinamica in un modello animale di grandi dimensioni.
A dimostrare la procedura saranno il Dr.Christoph Behem e il Dr.Till Friedheim, specialisti in anestesiologia e membri scientifici del nostro laboratorio. Altri dimostratori saranno Michael Graessler, specializzando in anestesiologia. Dopo aver confermato un livello appropriato di sedazione in un maiale di tre mesi di 40 chilogrammi, posizionare l'animale nella giusta posizione laterale e flettere la schiena dell'animale per allargare lo spazio tra le vertebre.
Esporre chirurgicamente l'area paravertebrale per la preparazione dei processi spinosi e degli archi vertebrali e posizionare un catetere venoso periferico vascolare calibro 14 paramediano nel midollo spinale a livello della vertebra toracica da 13 a 14 o della vertebra lombare da uno a due tra due archi vertebrali. Sostituire l'ago con la sonda ad ago laser Doppler e collegare la sonda all'hardware e al software designati per testare la qualità del segnale. Deve essere osservato un segnale stabile con una pulsatilità moderata.
Fissare con cura la sonda con punti di sutura e utilizzare il panning per evitare che la sonda si lussi o si attorcigli. Per il posizionamento percutaneo del drenaggio del liquido cerebrospinale per misurare e controllare la pressione cerebrospinale, identificare il livello lombare da quattro a cinque o da L5 a 6. Perforare la pelle e lo spazio sottocutaneo con l'ago introduttore e rimuovere l'ago dell'intarsio.
Posizionare una siringa piena di soluzione salina sull'ago introduttore e esercitare una pressione costante per introdurre con cautela l'ago nello spazio epidurale. Una volta avvertita una perdita di resistenza, che indica un corretto posizionamento epidurale, inserire l'ago dell'intarsio e far avanzare l'ago di due o tre millimetri nello spazio intratecale. Introdurre il drenaggio fino a una profondità di 20 centimetri.
Collegare un adattatore Luer lock e verificare la posizione aspirando attentamente il liquore. Quindi fissare con cura il drenaggio con punti di sutura e collegare il drenaggio al sistema di drenaggio del liquido cerebrospinale. Quindi, esporre il teschio dietro l'orecchio sinistro e utilizzare un trapano da sei millimetri per eseguire con cura una trapanazione del cranio.
Introdurre una seconda sonda laser Doppler direttamente nel cervello e utilizzare le suture per fissare con cura la sonda in posizione. Collegare la sonda all'hard e al software per testare la qualità del segnale. Deve essere osservato un segnale stabile con pulsatilità moderata.
Scollegare tutte le sonde e, con l'aiuto di quattro o cinque assistenti, posizionare con cura l'animale in posizione supina utilizzando l'imbottitura, facendo attenzione a non disturbare le sonde. Ricollegare le sonde e controllare la qualità del segnale. Quindi iniziare il drenaggio continuo del liquido cerebrospinale con una pressione target di 10 millimetri di mercurio e un volume di drenaggio di 20 millilitri all'ora.
Dopo aver eseguito una mini laparotomia, aumentare la frazione di ossigeno inspirato a uno e somministrare 0,1 milligrammi per chilogrammo di pancuronio per via endovenosa. Sezionare delicatamente lo sterno dal tessuto circostante, quindi eseguire il posizionamento dell'impacco retrosternale per evitare lesioni. Dopo aver interrotto la ventilazione, dividere l'osso con una sega oscillante e riavviare la ventilazione con una frazione ridotta di ossigeno inspirato a 0,3.
Utilizzare l'elettrocauterizzazione per ridurre il sanguinamento e sigillare lo sterno con cera ossea. Mobilizzare con cautela la base del polmone sinistro e dividere la parte laterale sinistra del diaframma per facilitare l'esposizione chirurgica. Ritrarre delicatamente il polmone sinistro per esporre l'aorta discendente prossimale al tronco celiaco e dividere il tessuto circostante.
Posizionare un Overholt attorno all'aorta discendente per garantire una corretta esposizione e collegare una sonda di flusso attorno all'aorta toracica discendente, quindi confermare la presenza di un segnale di buona qualità e collegare un anello del vaso attorno all'aorta discendente distale alla sonda di flusso per contrassegnare l'area di bloccaggio incrociato aortico. Dopo l'acquisizione di una misurazione di base, somministrare fasi di carico volumetriche consecutive di sette millilitri per chilogrammo di colloide di amido idrossietilico per un periodo di cinque minuti per fase. Cinque minuti di equilibrio tra ogni passaggio fino a quando l'aumento della gittata cardiaca è inferiore al 15%Dopo il completamento dell'ottimizzazione emodinamica, ripetere le misurazioni.
Successivamente, posizionare un morsetto aortico nell'area precedentemente contrassegnata sull'aorta sopraceliaca per indurre la riperfusione ischemica a intervalli di uno, due, cinque, 10 e 30 minuti per un totale di 48 minuti. Continuare il bloccaggio incrociato aortico dopo ogni intervallo. Dopo un massimo di cinque minuti o dopo la normalizzazione del flusso dell'arteria femorale, eseguire l'occlusione manuale dell'afflusso della vena cava inferiore per prevenire aumenti della pressione sanguigna superiori a 100 millilitri di pressione arteriosa media di mercurio e ripetere le misurazioni alla fine dell'intervallo di serraggio di 30 minuti prima della riperfusione.
Una volta ottenute le misurazioni, aprire gradualmente la pinza per garantire la stabilità emodinamica e somministrare sette millilitri per chilogrammo di colloidi di amido idrossietilico e ulteriori iniezioni in bolo da 10 a 20 microgrammi di noradrenalina e/o epinefrina per la stabilizzazione. Regolare la frequenza respiratoria per garantire la normocapnia secondo necessità. Dopo un'ora, ripetere le misurazioni.
Dopo aver ottenuto le misurazioni post-riperfusione, ripetere il carico di volume come dimostrato e ottenere un'altra serie di misurazioni. 4-1/2 ore dopo l'induzione della riperfusione ischemica, ottenere la serie finale di misurazioni. Qui si possono osservare esempi di registrazioni microcircolatorie del midollo spinale in tempo reale in combinazione con registrazioni microcircolatorie e macroemodinamiche cerebrali durante il cross-clamping aortico per l'induzione dell'ischemia, nonché durante lo sbloccaggio e la riperfusione.
L'interruzione del flusso aortico discendente è stata seguita da una marcata diminuzione del flusso del midollo spinale, mentre la pressione nell'aorta ascendente è aumentata. La riperfusione ha portato a effetti opposti. L'analisi statistica dei parametri macro e microcircolatori indica una marcata riduzione del flusso del midollo spinale durante l'ischemia.
Al contrario, il flusso cerebrale è aumentato notevolmente durante l'ischemia, come indicato dalle medie marginali stimate e dai loro intervalli di confidenza. Ciò è stato accompagnato da un aumento della frequenza cardiaca, della pressione arteriosa e della resistenza vascolare sistemica, mentre la gittata cardiaca e la gittata sistolica sono diminuite. L'analisi delle microsfere fluorescenti ha rivelato una marcata diminuzione del flusso sanguigno microcircolatorio del midollo spinale inferiore, mentre non è stato osservato alcun cambiamento significativo nel midollo spinale superiore.
La riperfusione ha portato a effetti opposti. Sebbene alla fine del protocollo si sia verificata un'ulteriore diminuzione della gittata cardiaca, della gittata sistolica e della pressione arteriosa, il flusso sanguigno del midollo spinale e il flusso sanguigno microcircolatorio del midollo spinale erano stabili. L'inserimento dell'ago sonda del midollo spinale richiede una profonda conoscenza dell'anatomia.
Inoltre, sono necessarie competenze tecniche molto elevate nella gestione della sonda. Devono essere evitati tentativi multipli per prevenire lesioni al midollo spinale, che potrebbero influenzare la metodologia.
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Panoramica
Questo protocollo fornisce un metodo riproducibile per la valutazione in tempo reale della microcircolazione del midollo spinale, fondamentale per lo sviluppo di terapie mirate. Permette di valutare approcci terapeutici in condizioni di ischemia/riperfusione in un modello animale di grandi dimensioni.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Microcircolazione
- Lesione del Midollo Spinale
Sfondo
- La microcircolazione del midollo spinale è fondamentale per il recupero da lesioni del midollo spinale.
- I metodi di valutazione in tempo reale sono carenti nella ricerca attuale.
- Le tecniche esistenti non valutano adeguatamente la microcircolazione durante l'ischemia/riperfusione.
- Questo studio mira a colmare questa lacuna con un nuovo protocollo.
Scopo dello studio
- Valutare in tempo reale la microcircolazione del midollo spinale.
- Valutare approcci terapeutici per lesioni del midollo spinale.
- Studiare efficacemente le condizioni di ischemia/riperfusione.
Metodi Utilizzati
- Utilizzo di sonde aghi per flussometria Laser-Doppler.
- Modello di animale di grandi dimensioni (maiale di tre mesi).
- Valutazione della pressione del liquido cerebrospinale e della macroemodinamica.
- Tecnica mini-invasiva facile da apprendere.
Risultati principali
- Monitoraggio in tempo reale riuscito della microcircolazione del midollo spinale.
- Capacità di valutare efficacemente gli interventi terapeutici.
- Procedura dimostrata da specialisti in anestesiologia.
- Potenziale per applicazioni più ampie nella ricerca sulle lesioni del midollo spinale.
Conclusioni
- Il protocollo offre un approccio innovativo allo studio della microcircolazione del midollo spinale.
- Migliora la comprensione delle strategie terapeutiche per le lesioni spinali.
- La ricerca futura potrà basarsi su questo metodo per ottenere risultati migliori.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La valutazione in tempo reale della microcircolazione del midollo spinale consente una riduzione del rischio meccanicistica nei modelli preclinici di lesione da ischemia/riperfusione. Questa capacità supporta la validazione degli obiettivi fornendo letture quantitative e dinamiche della perfusione tissutale in condizioni ischemiche controllate. Il protocollo aumenta la fiducia predittiva nella valutazione di composti neuroprotettivi o vasocoattivi prima delle fasi di identificazione dei composti promettenti.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche relative ai percorsi di perfusione del midollo spinale.
- Valore operativo: Fornisce una validazione funzionale degli obiettivi mediante la misurazione diretta delle risposte microcircolatorie alla sfida ischemica.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio identificando composti in grado di preservare o ripristinare la microperfusione durante la riperfusione.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Prepara sistemi biologici validati per lo screening di composti, stabilendo risposte microcircolatorie di base e ischemiche.
- Output quantitativo: Fornisce misurazioni in tempo reale del flusso con laser-Doppler che consentono l'analisi dose-risposta di agenti vasocoattivi.
- Riproducibilità: Il posizionamento standardizzato della sonda e il monitoraggio emodinamico garantiscono dati coerenti tra i diversi gruppi sperimentali.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per la patologia: Utilizza un modello suino di clampaggio aortico per simulare condizioni cliniche di ischemia/riperfusione rilevanti per il danno al midollo spinale.
- Continuità traslazionale: Correla le letture del laser-Doppler con l'analisi mediante microsfere fluorescenti, validando il metodo rispetto a parametri di riferimento consolidati della microcircolazione.
- Progressione basata sul rischio: Permette decisioni di avanzamento o interruzione in base ai profili di recupero microcircolatorio, riducendo il rischio biologico in fase avanzata nei programmi mirati al sistema nervoso centrale.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio alla valutazione preclinica, in particolare per modelli di ischemia e danno da riperfusione del sistema nervoso centrale.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sui meccanismi neurovascolari e sulla modulazione dei percorsi nei tessuti spinali ischemici.
- Screening: Permette la valutazione degli effetti dei composti sulla stabilità e sul recupero della microcircolazione, fondamentale per l'identificazione di composti promettenti con attività vasoprotettiva.
- Analisi: Fornisce dati continui e in tempo reale sul flusso, consentendo il confronto delle dinamiche di perfusione tra le fasi ischemica e di ripristino.
- Ricerca traslazionale: Si allinea alle strategie per i biomarcatori collegando gli esiti funzionali della perfusione alla validazione istopatologica e con microsfere.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile su grandi animali per test iterativi di terapie mirate alla microcircolazione in progetti multipli.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica collegando direttamente l'insulto ischemico alla dinamica della microcircolazione in un modello clinicamente rilevante.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione attraverso un posizionamento riproducibile della sonda, il drenaggio del liquido cerebrospinale e il monitoraggio emodinamico.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo la rilevazione precoce di composti inefficaci, riducendo i fallimenti nelle fasi successive della sperimentazione preclinica.
- Impatto sul portafoglio: Facilita la priorizzazione dei candidati in base al rischio, sulla base della dimostrata preservazione o ripresa della microcircolazione.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specialistiche nelle tecniche neurochirurgiche su grandi animali e nell'anatomia del midollo spinale per un posizionamento accurato della sonda.
- Dipende da strumentazione a laser-Doppler, sistemi di drenaggio del liquido cerebrospinale e infrastrutture per il monitoraggio emodinamico.
- Necessita di standardizzazione interfunzionale tra i team di chirurgia, anestesia e acquisizione dati per mantenere l'integrità del segnale.
- L'adattamento ad altri modelli (ad esempio, roditore o primati non umani) richiederebbe la validazione delle dimensioni della sonda, della profondità di inserzione e della stabilità del segnale.
- I limiti pratici includono l'abilità tecnica necessaria per evitare lesioni al midollo spinale durante l'inserimento della sonda, che potrebbero alterare le misurazioni del flusso ematico.
