Determinazione semi-quantitativa della densità neuronale dopaminergica nella Substantia Nigra dei modelli di roditori utilizzando l'analisi automatizzata delle immagini
February 2nd, 2021
Qui presentiamo un metodo automatizzato per la determinazione semi-quantitativa del numero di neuroni dopaminergici nella substantia nigra pars compacta del ratto.
La stima del numero di neuroni dopaminergici nella substantia nigra è una misura chiave del risultato nella ricerca sul morbo di Parkinson. Questo protocollo riduce significativamente il carico di lavoro necessario per stimare il numero di neuroni. Questo metodo fornisce un processo efficiente in termini di tempo e accurato per rilevare i cambiamenti nel numero di neuroni dopaminergici ed è adatto per determinare l'effetto degli interventi sulla sopravvivenza cellulare.
Questo metodo potrebbe essere facilmente adattato per fornire conteggi accurati dei neuroni in diverse regioni cerebrali mantenendo al contempo vantaggi in termini di costi e tempo rispetto ai metodi stereologici tradizionali. Per acquisire immagini IHC utilizzare il software accoppiato a un microscopio confocale con ingrandimento 10X. Aprire il foro del perno a 1,5 unità di area per catturare un piano largo per un totale di 1,5 micrometri e impostare la messa a fuoco sul lato iniettato del cervello.
Nella scheda acquisizione controllare l'opzione di imaging della scansione dei riquadri e impostare le dimensioni su 10 per quattro. Nel pannello modalità di acquisizione impostare lo zoom su 1.1 per evitare segni di cucitura tra le immagini di scansione del riquadro. Impostare le dimensioni del fotogramma su 1024 per 1024 pixel e la media su due per garantire un'acquisizione di immagini di alta qualità.
Nel pannello canali impostare traccia uno su Alexa 488 e traccia due ad Alexa 555. Caricare la diapositiva sul palco e scegliere una sezione con una forte colorazione TH. Clicca in diretta sul pannello di acquisizione.
Nel pannello canali impostare la forza e il guadagno del laser su livelli che massimizzano il segnale e limitano il rumore di fondo. Utilizzare l'indicatore di intervallo per assicurarsi che i segnali non siano sovraesposti. Ripetere questa situazione con più diapositive.
Nella scheda acquisizione selezionare la casella posizioni. Per iniziare l'imaging, utilizzare l'oculare e scegliere la prima sezione che mostra la colorazione TH positiva. Quindi impostare lo stato attivo nel punto di interesse e spostare lo stage sulla linea mediana della sezione.
In questo modo viene salvata la posizione negli assi X, Y e Z e verrà etata una scansione del riquadro che cattura l'intera sezione. Ripetere questa ripetizione per tutte le altre diapositive, incluso un sito non iniettato. Separare i file di immagine utilizzando il software appropriato e importarli in un software di analisi automatica delle immagini.
Definite una regione di interesse selezionando lo strumento di annotazione a penna per disegnare un'annotazione attorno alla substantia nigra pars compacta. Passare alla scheda analisi e selezionare Ottimizzazione in tempo reale dal menu di analisi a discesa. In questo modo viene aperta una finestra separata sull'immagine della sezione che consente la modifica in tempo reale dei parametri di analisi.
Nella sezione ingrandimento analisi selezionare lo zoom dell'immagine appropriato. Nella sezione di rilevamento delle cellule selezionare il colorante nucleare come colorante utilizzato per la colorazione TH. Regolare la soglia di contrasto nucleare, l'intensità nucleare minima, l'aggressività della segmentazione nucleare e le impostazioni delle dimensioni nucleari, osservando attentamente la finestra di sintonizzazione del tempo.
Ripetere questo processo con più campioni. Una volta che un numero appropriato di immagini è stato campionato e l'ottimizzazione in tempo reale è stata regolata di conseguenza, salvare le impostazioni di analisi nel menu a discesa delle azioni delle impostazioni. Selezionare tutte le immagini da analizzare e fare clic su analizza.
Scegliete l'impostazione di analisi appena salvata e nella finestra area di analisi selezionare la casella livelli di annotazione, quindi selezionare il livello uno e fare clic su analizza. Una volta completati, esportare i dati di analisi di riepilogo per tutte le sezioni selezionando l'opzione per esportare i dati di analisi degli oggetti. Questo set di dati potrebbe essere utilizzato per esaminare i cambiamenti nelle dimensioni delle cellule in risposta a una tossina o terapeutica.
Sei settimane dopo l'adeno associato al virus o alle iniezioni di AAV, l'iniezione stereotassica di AAV che esprime la sinuleina alfa A53T mutante nella substantia nigra nel cervello del ratto ha portato a una significativa riduzione della densità dei neuroni dopaminergici. Il numero medio di neuroni th positivi per millimetro al quadrato nella substantia nigra dei ratti iniettati con AAV-A35T è stato significativamente diminuito rispetto a quello dei ratti iniettati con il vettore vuoto AAV. Osservazioni simili sono state fatte usando una stereologia imparziale.
Quando si tenta questo protocollo tenere a mente il software è utile solo quanto viene addestrato ad essere. Pertanto, è necessario prestare tempo e attenzione per garantire che una singola cellula sia identificata come una singola cellula. Il software può essere adattato per misurare un'intensità di fluorescenza di altre proteine di interessi come l'alfa-sinucleina per determinare se i trattamenti possono modulare i livelli proteici.
Questa tecnica ha permesso una maggiore efficienza durante il test dell'effetto di molteplici potenziali terapie sulla densità dei neuroni dopaminergici.
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Panoramica
Questo studio presenta un metodo automatizzato per la determinazione semi-quantitativa del numero di neuroni dopaminergici nella substantia nigra pars compacta del ratto. Il protocollo riduce significativamente il carico di lavoro e migliora l'accuratezza nella stima del conteggio dei neuroni, il che è cruciale nella ricerca sulla malattia di Parkinson.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neuroscienze
- Psichiatria
- Biologia cellulare
Sfondo
- La stima del numero di neuroni dopaminergici è vitale per la ricerca sulla malattia di Parkinson.
- I metodi tradizionali possono essere dispendiosi in termini di tempo e meno accurati.
- I metodi automatizzati possono offrire un vantaggio in termini di efficienza temporale e costi.
- I cambiamenti quantitativi nel numero di neuroni possono valutare gli effetti terapeutici.
Obiettivo dello studio
- Presentare un metodo per il rilevamento efficiente e accurato del numero di neuroni dopaminergici.
- Consentire ai ricercatori di analizzare i cambiamenti nel conteggio dei neuroni dovuti a vari interventi.
- Semplificare il processo di imaging e analisi dei dati per i neuroni dopaminergici.
Metodi utilizzati
- Metodo di imaging automatizzato utilizzando la microscopia confocale.
- Focus sulla substantia nigra pars compacta in un modello di ratto.
- Il protocollo prevede la cattura di immagini IHC a 10X di ingrandimento con impostazioni di imaging specifiche.
- Sintonizzazione e analisi in tempo reale delle immagini neuronali tramite software automatizzato.
- Analisi dei dati inclusa per i cambiamenti nella densità dei neuroni dopo l'intervento.
Risultati principali
- Questo metodo ha mostrato significative riduzioni nella densità dei neuroni TH positivi dopo le iniezioni di AAV che esprimono l'alfa-sinucleina mutante A53T.
- I risultati hanno indicato una diminuzione del conteggio dei neuroni dopaminergici rispetto ai gruppi di controllo.
- È stata utilizzata la stereologia imparziale per validare i risultati.
- Consente il rilevamento di cambiamenti morfologici in risposta agli interventi terapeutici.
Conclusioni
- Lo studio convalida un metodo efficiente per quantificare i neuroni dopaminergici.
- Questa tecnica migliora la comprensione della perdita neuronale nei modelli di malattia di Parkinson.
- I metodi presentati possono facilitare l'esplorazione degli impatti terapeutici sulla densità neuronale.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of dopaminergic neuron density in the substantia nigra is critical for preclinical Parkinson's disease research and therapeutic evaluation. Automated image analysis offers a scalable, time-efficient alternative to traditional stereology, enabling rapid assessment of neuroprotective interventions. This approach supports robust target validation and accelerates decision-making at key discovery inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative assessment of neuronal loss or protection in disease-relevant models.
- Supports functional validation of therapeutic targets by measuring intervention effects on cell survival.
- Facilitates mechanistic de-risking by providing objective, reproducible neuron counts.
Screening & Assay Development
- Prepares validated brain region assays for compound screening workflows.
- Standardizes neuron quantification, improving reproducibility and assay comparability.
- Delivers quantitative outputs suitable for high-throughput evaluation of multiple interventions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical readouts with disease-relevant endpoints for translational continuity.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on robust neuronal survival data.
- Supports biomarker development by quantifying protein expression changes alongside neuron counts.
Pipeline & Workflow Integration
This automated quantification method integrates from early discovery through preclinical validation, bridging target validation, screening, and translational research phases.
- Discovery Biology: Provides objective neuron density measurements for hypothesis testing and pathway analysis.
- Screening: Offers reproducible, scalable quantification for compound evaluation and assay development.
- Analytics: Generates exportable datasets for statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Maintains continuity of disease-relevant endpoints across the pipeline.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other brain regions and protein markers, supporting broad R&D applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neurodegeneration studies.
- Operational Value: Streamlines workflows with automation, improving throughput and reproducibility.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions and more efficient resource allocation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of therapeutic candidates based on robust quantitative data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal imaging and image analysis parameter optimization.
- Needs access to compatible microscopy and automated analysis software infrastructure.
- Demands careful cross-team standardization of imaging and analysis protocols.
- Adaptable across different brain regions and protein targets with appropriate validation.
- Accuracy depends on rigorous training and tuning of analysis software for single-cell identification.
