Name: Analisi del tempo di permanenza di una singola molecola della scissione del DNA mediata da endonucleasi di restrizione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Scopri l'analisi del tempo di permanenza della scissione del DNA mediata da endonucleasi di restrizione a livello di singola molecola. Questo metodo multiplex consente di misurare i cicli catalitici di centinaia di REasi individuali.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato supportato dal premio numero K12GM074869 all'ECM dall'Istituto Nazionale di Scienze Mediche Generali. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali dell'Istituto Nazionale di Scienze Mediche Generali o del National Institutes of Health.

<ol><li>Roberts, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+restriction+enzymes+became+the+workhorses+of+molecular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">How restriction enzymes became the workhorses of molecular biology.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (17), 5905-5908 (2005).</li>
<li>Loenen, W. A., Dryden, D. T., Raleigh, E. A., Wilson, G. G., Murray, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highlights+of+the+DNA+cutters%3A+a+short+history+of+the+restriction+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Highlights of the DNA cutters: a short history of the restriction enzymes.</a> Nucleic Acids Research. 42 (1), 3-19 (2014).</li>
<li>Roberts, R. J., Vincze, T., Posfai, J., Macelis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((REBASE--a+database+for+DNA+restriction+and+modification%3A+enzymes%2C+genes+and+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">REBASE--a database for DNA restriction and modification: enzymes, genes and genomes.</a> Nucleic Acids Research. 43, Database issue 298-299 (2015).</li>
<li>Bonnet, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sliding+and+jumping+of+single+EcoRV+restriction+enzymes+on+non-cognate+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Sliding and jumping of single EcoRV restriction enzymes on non-cognate DNA.</a> Nucleic Acids Research. 36 (12), 4118-4127 (2008).</li>
<li>Biebricher, A., Wende, W., Escude, C., Pingoud, A., Desbiolles, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+of+single+quantum+dot+labeled+EcoRV+sliding+along+DNA+manipulated+by+double+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Tracking of single quantum dot labeled EcoRV sliding along DNA manipulated by double optical tweezers.</a> Biophysical Journal. 96 (8), 50-52 (2009).</li>
<li>Blainey, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonspecifically+bound+proteins+spin+while+diffusing+along+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Nonspecifically bound proteins spin while diffusing along DNA.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 16 (12), 1224-1229 (2009).</li>
<li>Huang, C. -F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+DNA+recognition+by+restriction+endonuclease+EcoRI%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+%26+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of DNA recognition by restriction endonuclease EcoRI.</a> Journal of Experimental & Clinical Medicine. 5 (1), 25-29 (2013).</li>
<li>Palma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+biomolecular+nanoarrays+for+parallel+single-molecule+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Selective biomolecular nanoarrays for parallel single-molecule investigations.</a> Journal of American Chemical Society. 133 (20), 7656-7659 (2011).</li>
<li>Reinhard, B. M., Sheikholeslami, S., Mastroianni, A., Alivisatos, A. P., Liphardt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+plasmon+coupling+to+reveal+the+dynamics+of+DNA+bending+and+cleavage+by+single+EcoRV+restriction+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Use of plasmon coupling to reveal the dynamics of DNA bending and cleavage by single EcoRV restriction enzymes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (8), 2667-2672 (2007).</li>
<li>van den Broek, B., Noom, M. C., Wuite, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-tension+dependence+of+restriction+enzyme+activity+reveals+mechanochemical+properties+of+the+reaction+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">DNA-tension dependence of restriction enzyme activity reveals mechanochemical properties of the reaction pathway.</a> Nucleic Acids Research. 33 (8), 2676-2684 (2005).</li>
<li>Gambino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+molecule+assay+for+measuring+site-specific+DNA+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A single molecule assay for measuring site-specific DNA cleavage.</a> Analytical Biochemistry. 495, 3-5 (2016).</li>
<li>Floyd, D. L., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+kinetic+intermediates+in+single-particle+dwell-time+distributions%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Analysis of kinetic intermediates in single-particle dwell-time distributions.</a> Biophysical Journal. 99 (2), 360-366 (2010).</li>
<li>Loparo, J. J., van Oijen, A. Single-molecule enzymology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLoparo%2C+JJ+%22Handbook+of+Single-Molecule+Biophysics%22">Handbook of Single-Molecule Biophysics</a>. Hinterdorfer, P., Oijen, A. , Springer. New York, NY. 165-182 (2009).</li>
<li>Taylor, J. D., Badcoe, I. G., Clarke, A. R., Halford, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EcoRV+restriction+endonuclease+binds+all+DNA+sequences+with+equal+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">EcoRV restriction endonuclease binds all DNA sequences with equal affinity.</a> Biochemistry. 30 (36), 8743-8753 (1991).</li>
<li>Pingoud, A., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+type+II+restriction+endonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Structure and function of type II restriction endonucleases.</a> Nucleic Acids Research. 29 (18), 3705-3727 (2001).</li>
<li>Tanner, N. A., Loparo, J. J., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+single-molecule+DNA+replication+with+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Visualizing single-molecule DNA replication with fluorescence microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (32), e1529(2009).</li>
<li>Kulczyk, A. W., Tanner, N. A., Loparo, J. J., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+enzymes+replicating+DNA+using+a+single-molecule+DNA+stretching+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Direct observation of enzymes replicating DNA using a single-molecule DNA stretching assay.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (37), e1689(2010).</li>
<li>Baldwin, G. S., Vipond, I. B., Halford, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+reaction+analysis+of+the+catalytic+cycle+of+the+EcoRV+restriction+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid reaction analysis of the catalytic cycle of the EcoRV restriction endonuclease.</a> Biochemistry. 34 (2), 705-714 (1995).</li>
<li>Winkler, F. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal-structure+of+Ecorv+endonuclease+and+of+Its+complexes+with+cognate+and+non-cognate+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">The crystal-structure of Ecorv endonuclease and of Its complexes with cognate and non-cognate DNA fragments.</a> EMBO Journal. 12 (5), 1781-1795 (1993).</li>
<li>Sioss, J. A., Stoermer, R. L., Sha, M. Y., Keating, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silica-coated%2C+Au%2FAg+striped+nanowires+for+bioanalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Silica-coated, Au/Ag striped nanowires for bioanalysis.</a> Langmuir. 23 (22), 11334-11341 (2007).</li>
</ol>

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti o altri conflitti di interesse

Il substrato di DNA per questo saggio è marcato con un punto quantico utilizzando uno schema di reazione in due fasi utilizzando sulfo-SMCC. Questo reticolante bifunzionale è costituito da una porzione estere NHS che può reagire con un'ammina primaria e da una porzione maleimmidica che può reagire con un gruppo sulfidrilico20. Gli oligonucleotidi tiolati utilizzati per preparare il substrato vengono spediti nella loro forma ossidata. È importante ridurli e purificarli, come descritto, prima di pro...

Le endonucleasi di restrizione (REasi) sono enzimi che effettuano rotture del doppio filamento sequenzia-specifiche nel DNA. La scoperta delle REasi negli anni '70 ha portato allo sviluppo della tecnologia del DNA ricombinante, e questi enzimi sono ora strumenti di laboratorio indispensabili per la modificazione e la manipolazione genetica1. Le REasi di tipo II sono gli enzimi più utilizzati in questa classe in quanto scindono il DNA in una posizione fissa all'interno o vicino alla loro sequenza di riconoscimento. Tuttavia, c'è una grande quantità di variazioni tra le REasi di Tipo II, e sono divise in diversi sottotipi in base a particolari proprietà enzimatiche piuttosto che essere classificate in base alle loro relazioni evolutive. Tra ogni sottotipo, ci sono frequenti eccezioni allo schema di classificazione e molti enzimi appartengono a più sottotipi2. Sono state identificate migliaia di REasi di Tipo II e centinaia di esse sono disponibili in commercio.
Tuttavia, nonostante la diversità tra le SI di Tipo II, pochissime SI sono studiate in dettaglio. Secondo REBASE, il database degli enzimi di restrizione istituito da Sir Richard Roberts nel 19753, i dati cinetici pubblicati sono disponibili per meno di 20 di questi enzimi. Inoltre, mentre alcune REasi sono state osservate direttamente a livello di singola molecola mentre si diffondevano lungo il DNA prima di incontrare e legarsi alla loro sequenza di riconoscimento 4,5,6,7, ci sono pochissimi studi su singole molecole della loro cinetica di reazione di scissione. Gli studi esistenti non riportano statistiche adeguate per intraprendere un'analisi dettagliata della variazione dei tempi in cui si verificano singoli eventi di scissione 8,9,10 o non sono in grado di catturare l'intera distribuzione dei tempi di scissione11. Questo tipo di analisi può rivelare la presenza di intermedi cinetici relativamente longevi e potrebbe portare a una migliore comprensione dei meccanismi di scissione del DNA mediata da REasi.
A livello di singola molecola, i processi biochimici sono stocastici: il tempo di attesa per il verificarsi di una singola istanza del processo, τ, è variabile. Tuttavia, ci si può aspettare che molte misure di τ obbediscano a una distribuzione di probabilità, p(τ), che è indicativa del tipo di processo in corso. Ad esempio, un processo a passo singolo, come il rilascio di una molecola di prodotto da un enzima, obbedirà alla statistica di Poisson e p(τ) assumerà la forma di una distribuzione esponenziale negativa:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62112/62112eq1v3.png">
dove β è il tempo medio di attesa. Si noti che la velocità del processo, k, sarà pari a 1/β, l'inverso del tempo medio di attesa. Per i processi che richiedono più di un passo, p(τ) sarà la convoluzione delle distribuzioni a singolo esponenziale per ciascuno dei singoli passaggi. Una soluzione generale per la convoluzione di N funzioni di decadimento a singolo esponenziale con identico tempo medio di attesa, β, è la distribuzione di probabilità gamma:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62112/62112eq2v3.png">
dove Γ(N) è la funzione gamma, che descrive l'interpolazione del fattoriale di N-1 a valori non interi di N. Sebbene questa soluzione generale possa essere utilizzata come approssimazione quando i tempi medi di attesa dei singoli passaggi sono simili, si deve comprendere che la presenza di passaggi relativamente veloci sarà mascherata da passaggi con tempi di attesa significativamente più lunghi. In altre parole, il valore di N rappresenta un limite inferiore al numero di passi12. Con un numero adeguato di misurazioni del tempo di attesa, i parametri β e N possono essere stimati raggruppando gli eventi e adattando la distribuzione gamma all'istogramma risultante o utilizzando un approccio di stima della massima verosimiglianza. Questo tipo di analisi può quindi rivelare la presenza di passaggi cinetici che non possono essere facilmente risolti nei saggi d'insieme e richiede un gran numero di osservazioni per stimare accuratamente i parametri12,13.
Questo articolo descrive un metodo per utilizzare il DNA marcato con punti quantici e la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) per osservare centinaia di singoli eventi di scissione del DNA mediati da REasi in parallelo. La progettazione del test consente di riunire i risultati di diversi esperimenti e può creare distribuzioni del tempo di permanenza contenenti migliaia di eventi. L'elevata fotostabilità e luminosità dei punti quantici consente una risoluzione temporale di 10 Hz senza sacrificare la capacità di osservare gli eventi di clivaggio che si verificano anche molti minuti dopo l'inizio dell'esperimento. Una buona risoluzione temporale e un ampio intervallo dinamico, combinati con la capacità di raccogliere un ampio set di dati, consentono una caratterizzazione accurata delle distribuzioni del tempo di permanenza per scoprire la presenza di più passaggi cinetici nelle vie di scissione delle REasi, che hanno tassi di turnover nell'intervallo 1 min-1 . Nel caso di EcoRV, è possibile risolvere tre passaggi cinetici, tutti identificati con altri mezzi, confermando che il test è sensibile alla presenza di tali passaggi.
I substrati di DNA duplex contenenti la sequenza di riconoscimento di interesse sono prodotti mediante ricottura di un oligonucleotide biotinilato in un filamento complementare marcato con un singolo punto quantico di nanocristalli semiconduttori attaccato covalentemente. Questi substrati vengono introdotti in un canale di flusso costruito sopra un vetrino coprioggetti con un prato di molecole di polietilenglicole (PEG) ad alto peso molecolare attaccate in modo covalente alla sua superficie. I substrati del DNA vengono catturati tramite un legame biotina-streptavidina-biotina da una frazione delle molecole PEG che hanno una biotina all'estremità libera. Nella microscopia TIRF, un'onda evanescente che decade esponenzialmente con la distanza dall'interfaccia vetro-liquido fornisce illuminazione; La profondità di penetrazione è dell'ordine della lunghezza d'onda della luce utilizzata. In queste condizioni, saranno eccitati solo i punti quantici che sono legati alla superficie da una molecola di DNA che è stata catturata sulla superficie di vetro funzionalizzato. I punti quantici che sono liberi in soluzione non saranno vincolati all'interno della regione illuminata e quindi non si illumineranno. Se il DNA che lega un punto quantico alla superficie viene tagliato, quel punto quantico sarà libero di diffondersi lontano dalla superficie e scomparirà dall'immagine a fluorescenza.
Sebbene molte RACESI di Tipo II siano note per legare il DNA in assenza di magnesio14, tutte richiedono magnesio per mediare la scissione del DNA15. Queste REasi possono legare il DNA immobilizzato in superficie in assenza di magnesio. Quando il tampone contenente magnesio viene fatto scorrere attraverso un canale con REasi prelegata al DNA, la scissione inizia immediatamente, come indicato dalla scomparsa dei punti quantici. La sincronizzazione ottenuta prelegando le molecole di REasi e quindi avviando la scissione del DNA introducendo il magnesio, facilita la misurazione del tempo di ritardo al completamento della scissione del DNA indipendentemente per ciascuna molecola nella popolazione di enzimi osservata in un esperimento. La fluoresceina è inclusa come colorante tracciante nel tampone contenente magnesio per indicare l'arrivo del magnesio nel campo visivo. Poiché nessun enzima è incluso nel tampone contenente magnesio, il tempo di ritardo dall'arrivo del tampone contenente magnesio alla scomparsa di ciascun punto quantico indica il tempo necessario a una REasi che è già legata al DNA per scindere il DNA e rilasciare il punto quantico dalla superficie di vetro. La scomparsa dei punti quantici avviene rapidamente e si traduce in una forte diminuzione della traiettoria di intensità, fornendo una chiara indicazione del tempo in cui una data molecola di DNA viene scissa. La determinazione dei tempi degli eventi viene effettuata mediante analisi matematica delle traiettorie di intensità e un tipico esperimento produce centinaia di eventi di scissione identificabili. I risultati di più esperimenti possono essere raggruppati per fornire statistiche adeguate per consentire la stima dei parametri, N e β, mediante analisi dei minimi quadrati non lineari o di massima verosimiglianza.

<table><tbody><tr><td>3-amminopropiltrietossisilano (APTS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>440140-100ML</td><td>Conservare in scatola essiccatore</td></tr><tr><td>5 minuti epossidico</td><td>Devcon</td><td>20845</td><td>utilizzare per sigillare il dispositivo microfluidico</td></tr><tr><td>acetone</td><td>Pharmco</td><td>329000ACS</td><td>utilizzare per la pulizia dei vetrini coprioggetti</td></tr><tr><td>sonicatore</td><td>da bagno Fisher Scientific</td><td>CPXH Modello 2800</td><td>numero di catalogo 15-337-410</td></tr><tr><td>Becher, vetro, 100 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td></td><td></td><td></td>da banco</tr><tr><td>Biotina-PEG-Succinimidil valerato (MW 5.000)</td><td>Laysan Bio</td><td>BIO-SVA-5K</td><td>Il succinimidil valerato ha un'emivita più lunga rispetto</td></tr><tr><td>all'oligonucleotide biotinilato</td> carbonato di succinimidil <td>Tecnologie del DNA integrate</td><td>personalizzate - vedere il protocollo per considerazioni di progettazione</td><td>Richiesta 5' Modifica della biotina e Purificazione HPLC</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>VWR</td><td>0903-5G</td><td>preparare una soluzione da 10 mg/mL (aq) e riscaldare a 95 gradi; C prima dell'uso</td></tr><tr><td>Centri-Spin-10 Colonne di spin per esclusione dimensionale</td><td>Separazioni di Princeton</td><td>CS-100 o CS-101</td><td>utilizzate per purificare gli oligonucleotidi tiolati dopo aver ridotto il legame disolfuro</td></tr><tr><td>Provette da centrifuga 1,5. mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti,</td> portavetrini <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> in vetro quadrato da 1 pollice <tr><td>ruota a punta di diamante</td><td>Dremel</td><td>7134</td><td>utilizzare per praticare fori nel topper della cella di flusso al quarzo</td></tr><tr><td>ditiotreitolo (DTT)</td><td>Thermo Scientific</td><td>A39255</td><td>Formato No-Weigh, 7,7 mg/flacone</td></tr><tr><td>trapano a colonna per lavoro utensile rotante supporto per workstation</td><td>Dremel</td><td>220-01</td><td>facilita la perforazione del quarzo</td></tr><tr><td>EcoRV (REase utilizzato per generare dati di esempio)</td><td>New England Biolabs</td><td>R0195T o R0195M</td><td>Utilizzare 100.000 unità/mL di stock per evitare l'aggiunta di glicerolo in eccesso Controllare REBASE per i fornitori di altre REasi</td></tr><tr><td>etanolo</td><td>vari</td><td>CAS 64-17-5</td><td>denaturati o al 95% sono accettabili, utilizzare per la pulizia dei vetrini coprioggetti</td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EDS</td><td>BioUltra, anidro, conservare in scatola essiccante</td></tr><tr><td>Flea Micro Spinbar</td><td>Fisherbrand</td><td>14-513-65</td><td>Dimensioni 3 mm x 10 mm per adattarsi sotto il rack del vetrino coprioggetti</td></tr><tr><td>fluoresceina</td><td>Acros Organics</td><td>17324</td><td>utilizzare per realizzare tamponi sperimentali forno</td></tr><tr><td>a convezione per gravità</td><td>Binder</td><td>9010-0131</td><td></td></tr><tr><td>multiutensile rotante portatile</td><td>Dremel</td><td>8220</td><td>utilizzare per praticare fori nel topper della cella di flusso al quarzo</td></tr><tr><td>ImagEM X2 Telecamera EM-CCD</td><td>Hamamatsu</td><td>C9100-23B</td><td>il raffreddamento ad aria è adeguato per questo esperimento, utilizzare il software HCImage o simile per controllare</td></tr><tr><td>il distanziatore di imaging, bifacciale, barattolo adesivo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, vetro con tappo a vite, (circa 50 mm di diametro per 50 mm di altezza)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cloruro di magnesio esaidrato</td> Fisher <td>Bioreagents</td><td>BP214-500</td><td>utilizzare per creare un tampone sperimentale con</td></tr><tr><td>il software</td><td></td> <td>MATLAB al magnesio</td><td>Pinzette</td></tr><tr><td>metalliche</td> per analisi dei dati <td>Fisher Brand</td><td>16-100-110</td><td></td></tr><tr><td>metossi-PEG-succinimidil valerato (MW 5.000)</td><td>Laysan Bio</td><td>M-SVA-5K</td><td>Entrambi i PEG devono avere lo stesso estere NHS in modo che la velocità di reazione sia costante</td></tr><tr><td>microcentrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>agitatore magnetico multiposizione</td><td>VWR</td><td>12621-022</td><td></td></tr><tr><td>Acido N-cicloesil-2-amminoetansolfonato (CHES)</td><td>Acros Organics</td><td>AC20818</td><td>CAS 103-47-9, utilizzato per realizzare</td></tr><tr><td>l'agitatore orbitale tampone CHES e il riscaldatore per provette per microcentrifuga</td><td>Q Instruments</td><td>1808-0506</td><td>con adattatore 1808-1061 per 24 provette da 2,0 mL o 15 provette da 0,5 mL</td></tr> Tubo in polietilene <tr><td>Parafilm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE60 (diametro interno 0,76 mm, diametro esterno 1,22 mm)</td><td>Intramedic</td><td>6258917</td><td>Gli aghi smussati da 22 g si adattano bene a tubi di questa dimensione</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 10x</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7059</td><td>Utilizzare a 1x</td></tr><tr><td>idrossido di potassio</td><td>VWR Chemicals BDH</td><td>BDH9262</td><td>utilizzare una soluzione 1 M per pulire i vetrini coprioggetti</td></tr><tr><td>Qdot 655 ITK Amino (PEG) Quantum Dots</td><td>Invitrogen</td><td>Q21521MP</td><td></td></tr><tr><td>Quartz Slide, 1 pollice quadrato, 1 mm di spessore</td><td>Microscopia elettronica Sciences</td><td>72250-10</td><td>i fori devono essere praticati negli angoli per l'inserimento dei tubi di ingresso e uscita</td></tr><tr><td>Pinzette in plastica rinforzata</td><td>Rubis</td><td>K35a</td><td>per la movimentazione di vetrini coprioggetti e la costruzione di dispositivi microfluidici</td></tr><tr><td>Fogli adesivi SecureSeal Grace</td><td>Biolabs</td><td>SA-S-1L</td><td>distanziatore tagliato per formare per dispositivo microfluidico</td></tr><tr><td>Pompa a siringa a canale singolo per microfluidica</td><td>Sistemi</td> <td>di pompaggio New EraNE-1002X-US</td><td>dotato di una siringa da 50 mL e di un ago smussato da 22 G</td></tr><tr><td>Slide-a-Lyzer MINI Dialysis Devices, 10 kDa MWCO, 0,1 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>69570 o 69572</td><td>utilizzato per lo scambio di tampone durante l'accoppiamento di punti quantici al DNA</td></tr><tr><td>bicarbonato di sodio</td><td>EMD Millipore</td><td>SX0320</td><td>utilizzato per la produzione di tampone per la funzionalizzazione della superficie; 100 mM, pH 8</td></tr><tr><td>cloruro di sodio</td><td>Macron</td><td>7581-12</td><td>utilizzare per realizzare tamponi sperimentali</td></tr><tr><td>Soluzione bibasica di fosfato di sodio (BioUltra, 0,5 M in acqua)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>94046</td><td>utilizzare per produrre 100 mM di tampone fosfato di sodio</td></tr><tr><td>Soluzione monobasica di fosfato di sodio (BioUltra, 5M in acqua)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>74092</td><td>utilizzare per regolare il pH di 100 mM di tampone fosfato di sodio</td></tr><tr><td>Streptavidina da Streptomyces avidinii</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S4762</td><td>sciogliere a 1 mg/mL e conservare 25 mL di aliqouts a -20 ?</td></tr><tr><td>Sulfosuccinimidil-4-(N-maleimidometil) cicloesano-1-carbossilato (solfo-SMCC)</td><td>Thermo Scientific</td><td>A39268</td><td>Formato No-Weigh, 2 mg/fiala</td></tr><tr><td>Siringa dotata di ago</td><td></td><td></td><td></td>smussato da 21 G</tr><tr><td>Pompa</td><td></td><td></td><td></td>a siringa</tr><tr><td>oligonucleotide tiolato</td><td>Tecnologie DNA integrate</td><td>personalizzate - vedere il protocollo per considerazioni</td> <td>di progettazioneRichiedi 5' Modificatore tiolico C6 S-S e purificazione HPLC</td></tr><tr><td>Sistema di imaging TIRF con illuminazione laser a 488 nm</td><td>vari</td><td></td><td></td></tr><tr>prodotti<td>di ricerca Tris -HCl</td><td>International</td><td>T60050</td><td>utilizzati per realizzare tamponi sperimentali</td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>JT Baker</td><td>4101</td><td>utilizzare per realizzare tamponi sperimentali</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P7949</td><td>utilizzare per effettuare il blocco tampone</td></tr><tr><td>Miscelatore a vortice</td><td></td> ad acqua <td></td> ultrapura VWR 10153-842 <td></td></tr><tr><td>Wash-N-Dry Coverslip Rack</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>70366-16</td><td>utilizzato per la funzionalizzazione superficiale dei vetrini coprioggetti</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analisi del tempo di permanenza di una singola molecola della scissione del dna mediata da endonucleasi di restrizione

Single-Molecule Dwell-Time Analysis of Restriction Endonuclease-Mediated DNA Cleavage

Questo nuovo test basato sulla microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale facilita la misurazione simultanea della lunghezza del ciclo catalitico per centinaia di singole molecole di endonucleasi di restrizione (REasi) in un unico esperimento. Questo test non richiede la marcatura delle proteine e può essere eseguito con un singolo canale di imaging. Inoltre, i risultati di più esperimenti individuali possono essere raggruppati per generare distribuzioni del tempo di permanenza ben popolate. L'analisi delle distribuzioni del tempo di permanenza risultanti può aiutare a chiarire il meccanismo di scissione del DNA rivelando la presenza di passaggi cinetici che non possono essere osservati direttamente. I dati di esempio raccolti utilizzando questo test con la ben studiata REasi, EcoRV - un'endonucleasi dimerica di restrizione di tipo IIP che slega la sequenza palindromica GAT↓ATC (dove ↓ è il sito di taglio) - sono in accordo con studi precedenti. Questi risultati suggeriscono che ci sono almeno tre passaggi nel percorso di scissione del DNA che viene avviato introducendo il magnesio dopo che EcoRV si lega al DNA in sua assenza, con un tasso medio di 0,17 s-1 per ogni passaggio.

La cella di flusso è direttamente accoppiata a un obiettivo di ingrandimento 60x ad immersione in olio ad alta apertura numerica su un microscopio invertito dotato di illuminazione laser per l'imaging TIRF attraverso l'obiettivo (Figura 5A). Dopo aver introdotto il substrato di DNA e aver lavato via il DNA in eccesso e i punti quantici, ci sono in genere migliaia di singoli punti quantici in un campo visivo (Figura 5B). Questi punti quantici sono stabilmente att...

Utilizzando il DNA marcato con punti quantici e la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale, possiamo studiare il meccanismo di reazione delle endonucleasi di restrizione utilizzando proteine non marcate. Questa tecnica a singola molecola consente l'osservazione massicciamente multiplexata delle singole interazioni proteina-DNA e i dati possono essere raggruppati per generare distribuzioni del tempo di permanenza ben popolate.

Analisi del tempo di permanenza di una singola molecola della scissione del DNA mediata da endonucleasi di restrizione

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for ...

Con questo protocollo, possiamo osservare direttamente la scissione del DNA sito-specifica mediante endonucleasi di restrizione a livello di singola molecola. Il nostro approccio multiplex ci consente di misurare il tempo necessario a centinaia di singole REasi per completare il ciclo catalitico. Il multiplexing ci consente di generare distribuzioni ben popolate del tempo di permanenza per la scissione che possiamo adattare alla distribuzione di probabilità gamma per ottenere informazioni sul meccanismo della scissione del DNA.Iniziare preparando una nuova provetta per ogni oligonucleotide risospeso a 50 microlitri di oligonucleotide e 50 microlitri di soluzione DTT appena preparata in ciascuna provetta, pipettare su e giù per mescolare e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Pipettare delicatamente l'intero volume di ogni miscela di campioni su una colonna preparata e centrifugare a 750 G per due minuti. Dopo la centrifugazione, conservare i campioni che non verranno utilizzati immediatamente a 20 gradi Celsius per prevenire l'ossidazione dei gruppi tiolici e la formazione di legami disolfuro.Pipettare un'aliquota di 50 microlitri del quantum dot stock in un dispositivo di dialisi per ogni costrutto da realizzare, facendo attenzione a non toccare la membrana con il puntale della pipetta. Dializzare con un volume di tampone CHES pari ad almeno 1.000 volte il volume del campione agitando a 100 giri/min per 15 minuti. Utilizzando un pipettatore, recuperare con cura i punti quantici sospesi dal dispositivo di dialisi e trasferirli in una provetta nuova contenente un volume uguale di soluzione Sulfo-SMCC appena preparata, pipettando su e giù per mescolare.Incubare per 1 ora a temperatura ambiente agitando a 1.000 giri/min per consentire al Sulfo-SMCC di reagire con le ammine primarie sui punti quantici. Quindi, utilizzare un pipettatore per trasferire con cura ogni campione in un nuovo dispositivo di dialisi. Per rimuovere l'eccesso di Sulfo-SMCC, dializzare con un volume di tampone CHES che sia almeno 1.000 volte il volume contenuto nel dispositivo di dialisi agitando per 15 minuti.Sostituire il tampone due volte ed eseguire la dialisi con un tampone CHES fresco tre volte in totale, consentendo alla dialisi di procedere per 15 minuti dopo ogni sostituzione del tampone. Quindi ripetere la dialisi con PBS. Utilizzando un pipettatore, recuperare con cura la soluzione contenente i punti quantici dal dispositivo di dialisi e trasferire ogni campione in una nuova provetta contenente una quantità equimolare di oligonucleotide dilatato diluito in PBS.Incubare per 2 ore a temperatura ambiente agitando a 1.000 giri/min. Aggiungere BSA a ciascun campione per una concentrazione finale di 0,5 milligrammi per millilitro. Quindi utilizzare un pipettatore per trasferire con cura ogni campione in un nuovo dispositivo di dialisi e dializzare contro il tampone di conservazione.Dopo la dialisi, recuperare con cura ogni campione e inserirlo in una nuova provetta. Conservare i campioni a 4 gradi Celsius. Combinare un campione di oligonucleotidi marcati con punti quantici con un eccesso molare di dieci volte di oligonucleotide biotinilato.Scaldare il composto in un blocco termico a 75 gradi Celsius e mantenerlo a quella temperatura per 5 minuti. Quindi spegnere il blocco di calore e lasciare raffreddare lentamente il composto. Conservare il costrutto completato a 4 gradi Celsius Utilizzando un multiutensile rotante portatile dotato di una punta a punta di diamante conica, praticare due fori negli angoli opposti della slitta di quarzo per fungere da ingresso e uscita.Assicurarsi di fissare la slitta in posizione, lubrificare la punta e scorrere costantemente con acqua durante la perforazione. Dopo ogni esperimento, recuperare il vetrino di quarzo preparato immergendo il dispositivo usato nell'acetone per sciogliere l'adesivo e la resina epossidica. Eliminare i componenti rimanenti.Combina 25 microlitri di soluzione di streptavidina con 80 microlitri di PBS e 20 microlitri di tampone bloccante. Rivestire un vetrino coprioggetti trattato con PEG con questa miscela e incubare in un ambiente umido per 30 minuti. Durante l'incubazione del vetrino coprioggetti, preparare il distanziatore di imaging per creare un canale di flusso.Tagliare un pezzo quadrato da 1 pollice di materiale distanziatore per immagini, quindi segnare un canale largo 2 millimetri allineato alle estremità dei fori praticati nel vetrino di quarzo. Taglia il canale dal materiale distanziatore con un bisturi. Pulire accuratamente il vetrino di quarzo con acetone per rimuovere eventuali residui di adesivo da esperimenti precedenti.Staccare un lato del supporto dal distanziatore dell'immagine e posizionarlo con cura sul vetrino al quarzo, facendo attenzione a non coprire i fori di ingresso e uscita. Lavare il vetrino coprioggetto con acqua e asciugarlo con aria compressa. Rimuovere l'altro lato del supporto dal distanziatore di imaging e inserirlo tra il vetrino al quarzo e il vetrino coprioggetti rivestito di streptavidina funzionalizzato utilizzando una pinzetta di plastica per premere insieme il gruppo e rimuovere le bolle d'aria dall'adesivo.Tagliare l'estremità del tubo ad angolo per garantire il libero flusso della soluzione. Quindi inserire un tubo di polietilene lungo 30 centimetri in ogni foro del vetrino di quarzo. Tenere le provette in posizione con una rastrelliera, quindi utilizzare la resina epossidica per sigillare le provette in posizione e i bordi del dispositivo assemblato.Una volta che la resina epossidica è stata fissata, inserire l'ago smussato su una siringa vuota nel tubo di uscita del dispositivo e immergere l'estremità del tubo di ingresso in un contenitore riempito con il tampone di bloccaggio. Tirare indietro lo stantuffo della siringa per riempire il dispositivo con il tampone di bloccaggio. Quindi lasciare incubare il dispositivo per almeno 30 minuti prima dell'uso.Fissare il dispositivo microfluidico alla piastra del tavolino del microscopio con del nastro adesivo. Portare l'obiettivo a contatto con la parte inferiore del dispositivo e posizionare l'obiettivo in modo che il campo visivo si trovi all'interno del canale microfluidico. Dopo aver collegato il tubo di uscita alla pompa a siringa, lavare il canale microfluidico con un nuovo tampone di blocco tirando indietro lo stantuffo della siringa.Verificare che non vi siano bolle intrappolate nel tubo o nel canale. Diluire 1 microlitro del substrato di DNA preparato in 1 millilitro di tampone bloccante. Posizionare il tubo di ingresso nel substrato di DNA diluito e far fluire 800 microlitri della soluzione di substrato attraverso il canale a una velocità di 200 microlitri al minuto.Lasciare incubare la soluzione di DNA nel canale per 15 minuti dopo l'arresto del flusso. Dopo l'incubazione, far fluire almeno 800 microlitri di tampone bloccante attraverso il canale a una velocità di 200 microlitri al minuto per risciacquare il DNA non legato fuori dal canale. Regolare la messa a fuoco del microscopio in modo che i punti quantici legati alla superficie siano chiaramente visibili.Lavare il dispositivo microfluidico con 800 microlitri di tampone sperimentale senza magnesio a una portata di 200 microlitri al minuto. Aggiungere la REasi a un'aliquota di tampone sperimentale senza magnesio e mescolare delicatamente mediante pipettaggio. Flusso 800 microlitri da 400 unità per millilitro di EcoRV attraverso il canale ad una portata di 200 microlitri al minuto.Inizia l'esperimento facendo scorrere il tampone sperimentale contenente magnesio e fluoresceina a una velocità di flusso di 200 microlitri al minuto. Iniziare a raccogliere i dati immediatamente dopo aver avviato la pompa a siringa. Interrompere l'acquisizione dei dati dopo aver fatto scorrere 800 microlitri di tampone.Dopo aver introdotto il substrato di DNA nella cella a flusso e aver lavato via il DNA in eccesso e i punti quantici, ci sono in genere migliaia di singoli punti quantici in un campo visivo. Sono fissati stabilmente alla superficie del vetro e non subiscono un oscuramento evidente o uno sbiancamento significativo durante l'esperimento. Quando la REasi ha fluito attraverso il canale in assenza di magnesio, almeno il 95% dei punti quantici presenti all'inizio dell'esperimento può ancora essere visto alla fine del periodo di osservazione.Tuttavia, quando il tampone contenente magnesio viene fatto scorrere immediatamente dopo la REasi, fino alla metà dei punti quantici scompare entro la fine del periodo di osservazione, in modo simile a quanto si osserva quando REasi e magnesio vengono fatti scorrere insieme attraverso il canale. La scomparsa dei punti quantici avviene rapidamente e si traduce in una forte diminuzione della traiettoria di intensità, fornendo una chiara indicazione del tempo in cui una data molecola di DNA viene scissa. Questo esperimento è stato eseguito con la ben studiata P REase EcoRV di tipo II.Per estrarre i valori di n e beta dai dati sono stati utilizzati sia l'adattamento non lineare della curva dei minimi quadrati che la stima dei parametri di massima verosimiglianza. I due metodi di stima dei parametri erano in accordo. Utilizzando l'adattamento dei minimi quadrati non lineare, n era 3,52 e beta era 5,78 secondi.Utilizzando la stima della massima verosimiglianza, n era 3,41 e beta era 6,06 secondi. Questo test può fornire la prova della presenza di passaggi intermedi lungo la via di scissione. L'esecuzione di questo test in condizioni di reazione variabili può aiutare a stabilire la natura degli intermedi di reazione che non possono essere osservati direttamente.

single-molecule-dwell-time-analysis-restriction-endonuclease-mediated

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biochemistry

Biochimica

Descriviamo un metodo per osservare la replicazione in tempo reale di singole molecole di DNA mediate da proteine ​​del sistema di replica batteriofago.

Osservazione diretta del DNA Enzimi Replica utilizzando un singolo-molecola di DNA Stretching Assay

Corsi a tempo per l'attività glicosilasi di 8-oxoguanine glicosilasi DNA sono bifasica esibendo una raffica di formazione del prodotto e una fase a regime lineare. Utilizzando tecniche di quench-flow, lo scoppio e le tariffe di stato stazionario possono essere misurati, che corrispondono ad escissione di 8-oxoguanine e rilascio della glicosilasi dal DNA prodotto, rispettivamente.

Allo steady-state, Pre-steady-state, e Single-fatturato di misura cinetica per il DNA Glycosylase Activity

Le esonucleasi svolgono un ruolo fondamentale nel garantire la stabilità del genoma. La perdita della funzione dell'esonucleasi WRN provoca un invecchiamento precoce. Lo studio dei substrati e di altri requisiti della nucleasi in vitro può aiutare a chiarire il suo ruolo in vivo. Qui dimostriamo un saggio rapido e riproducibile basato sulla fluorescenza per misurare la sua attività nucleasica.

Un saggio di esonucleasi basato sulla fluorescenza per caratterizzare DmWRNexo, ortologo dell'esonucleasi WRN progeroide umana, e la sua applicazione ad altre nucleasi

Fluorescenza risonanza energia basati su trasferimento osservazione in tempo reale sistemi del DNA strand reazione di scambio mediato da Rad51 sono stati sviluppati. Utilizzando i protocolli presentati qui, siamo in grado di rilevare la formazione di intermedi di reazione e loro conversione in prodotti, mentre si analizza anche la cinetica enzimatica della reazione.

Osservazione in tempo reale della DNA Strand Exchange reazione mediata da Rad51

Presentato qui è un protocollo per l'esecuzione di trasferimento di energia di risonanza monomolecola di Fàrster per studiare la risoluzione HJ. L'eccitazione alternata a due colori viene utilizzata per determinare le costanti di dissociazione. Il time lapse a colori singolo smFRET viene quindi applicato nei saggi di scissione in tempo reale per ottenere la distribuzione del tempo di dimora prima della risoluzione HJ.

Metodi di trasferimento di energia di risonanza a singola molecola per l'analisi in tempo reale della risoluzione dello svincolo di Holliday da gen1

Viene descritto un metodo altamente parallelo per misurare la scissione specifica del sito del DNA a livello di singola molecola. Questo protocollo illustra la tecnica utilizzando la restrizione endonuclease NdeI. Il metodo può essere facilmente modificato per studiare qualsiasi processo che si traduce in scissione del DNA specifica del sito.

Analisi cinetica ad alta velocità ad alto rendimento parallela per cleavage del DNA specifico del sito

Questo articolo descrive un protocollo per lo studio delle interazioni DNA-proteina utilizzando un sistema di interferometria a biostrato (BLI) basato su streptavidina. Delinea i passaggi e le considerazioni essenziali per l'utilizzo della cinetica di legame di base o avanzata per determinare l'affinità di legame all'equilibrio (KD) dell'interazione.

Analisi delle interazioni DNA-proteina con l'interferometria a biostrato basata su streptavidina

Questo studio presenta un saggio FRET raziometrico semplice e di facile utilizzo per il rilevamento e la valutazione quantitativa dell'attività della DNasi e dimostra la sua applicazione nell'analisi di una nucleasi debole.

Valutazione dell'attività della DNasi mediante trasferimento di energia di risonanza a fluorescenza raziometrica

Questo protocollo dimostra l'esecuzione di un saggio a singola molecola per la visualizzazione dal vivo dello svolgimento del DNA mediante elicasi CMG. Descrive (1) la preparazione di un substrato di DNA, (2) la purificazione dell'elicasi CMG di Drosophila melanogaster marcata in fluorescenza, (3) la preparazione di una cella a flusso microfluidico per la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) e (4) il saggio di svolgimento del DNA a singola molecola.

Visualizzazione in tempo reale a singola molecola dello svolgimento del DNA mediante elicasi CMG

Questo protocollo delinea un saggio di replicazione del DNA a singola molecola basato su microscopia a fluorescenza, che consente la visualizzazione in tempo reale delle interazioni tra le DNA polimerasi e gli ostacoli come le strutture G-quadruplex.

Visualizzazione a fluorescenza a singola molecola della dinamica della DNA polimerasi ai G-quadruplex

Scopri l'analisi del tempo di permanenza della scissione del DNA mediata da endonucleasi di restrizione a livello di singola molecola. Questo metodo multiplex consente di misurare i cicli catalitici di centinaia di REasi individuali.

Analisi del tempo di permanenza di una singola molecola della scissione del DNA mediata da endonucleasi di restrizione

Esplora altri video