Name: Accorciamento sarcomere dei cardiomiociti pluripotenti derivati dalle cellule staminali utilizzando proteine sarcomere con tag fluorescenti. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Scopri come misurare l'accorciamento del sarcomero nei cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti utilizzando proteine del sarcomero con tag fluorescenti. Questo metodo consente la valutazione in vitro della funzione sarcomerica per la ricerca cardiologica.

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Vorremmo ringraziare tutti i membri del laboratorio della Divisione di Medicina Rigenerativa dell'Università medica di Jichi per l'utile discussione e assistenza tecnica. Questo studio è stato sostenuto dalle sovvenzioni dell'Agenzia giapponese per la ricerca e lo sviluppo medico (AMED; JP18bm0704012 e JP20bm0804018), la Japan Society for the Promotion of Science (JSPS; JP19KK0219), e la Japanese Circulation Society (la Grant for Basic Research) a H.U.

<ol><li>Mensah, G. A., Roth, G. A., Fuster, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Global+Burden+of+Cardiovascular+Diseases+and+Risk+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The Global Burden of Cardiovascular Diseases and Risk Factors.</a> Journal of the American College of Cardiology. 74 (20), 2529-2532 (2019).</li>
<li>Wexler, R. K., Elton, T., Pleister, A., Feldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyopathy%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22American+Family+Physician%22%5BJournal%5D)">Cardiomyopathy: an overview.</a> American Family Physician. 79 (9), 778-784 (2009).</li>
<li>Parrotta, E. I., Lucchino, V., Scaramuzzino, L., Scalise, S., Cuda, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Cardiac+Disease+Mechanisms+Using+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes%3A+Progress%2C+Promises+and+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Modeling Cardiac Disease Mechanisms Using Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Progress, Promises and Challenges.</a> International Journal of Molecular Sciences. , 30(2020).</li>
<li>Carvajal-Vergara, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell-derived+models+of+LEOPARD+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome.</a> Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).</li>
<li>Lan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+calcium+handling+properties+underlie+familial+hypertrophic+cardiomyopathy+pathology+in+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).</li>
<li>Kim, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+arrhythmogenic+right+ventricular+dysplasia+with+patient-specific+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs.</a> Nature. 494 (7435), 105-110 (2013).</li>
<li>Gramlich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisense-mediated+exon+skipping%3A+a+therapeutic+strategy+for+titin-based+dilated+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Antisense-mediated exon skipping: a therapeutic strategy for titin-based dilated cardiomyopathy.</a> EMBO Molecular Medicine. 7 (5), 562-576 (2015).</li>
<li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+mitochondrial+cardiomyopathy+of+Barth+syndrome+with+induced+pluripotent+stem+cell+and+heart-on-chip+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Modeling the mitochondrial cardiomyopathy of Barth syndrome with induced pluripotent stem cell and heart-on-chip technologies.</a> Nature Medicine. 20 (6), 616-623 (2014).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Dysfunctions+Contribute+to+Hypertrophic+Cardiomyopathy+in+Patient+iPSC-Derived+Cardiomyocytes+with+MT-RNR2+Mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Dysfunctions Contribute to Hypertrophic Cardiomyopathy in Patient iPSC-Derived Cardiomyocytes with MT-RNR2 Mutation.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 808-821 (2018).</li>
<li>Cho, G. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+Transplantation+Confers+Maturation+of+PSC-Derived+Cardiomyocytes+Conducive+to+Modeling+Cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Neonatal Transplantation Confers Maturation of PSC-Derived Cardiomyocytes Conducive to Modeling Cardiomyopathy.</a> Cell Reports. 18 (2), 571-582 (2017).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tri-iodo-l-thyronine+promotes+the+maturation+of+human+cardiomyocytes-derived+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 296-304 (2014).</li>
<li>Ribeiro, A. J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-Imaging+Method+to+Assay+the+Contractile+Mechanical+Output+of+Micropatterned+Human+iPSC-Derived+Cardiac+Myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Multi-Imaging Method to Assay the Contractile Mechanical Output of Micropatterned Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes.</a> Circulation Research. 120 (10), 1572-1583 (2017).</li>
<li>Sewanan, L. R., Campbell, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+sarcomeric+cardiomyopathies+with+human+cardiomyocytes+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Modelling sarcomeric cardiomyopathies with human cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells.</a> The Journal of Physiology. 598 (14), 2909-2922 (2020).</li>
<li>Kopljar, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+drug-induced+effects+on+contractile+motion+properties+and+cardiac+biomarkers+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Chronic drug-induced effects on contractile motion properties and cardiac biomarkers in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> British Journal of Pharmacology. 174 (21), 3766-3779 (2017).</li>
<li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifeact%3A+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).</li>
<li>Ribeiro, A. J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractility+of+single+cardiomyocytes+differentiated+from+pluripotent+stem+cells+depends+on+physiological+shape+and+substrate+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (41), 12705-12710 (2015).</li>
<li>Roberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Gene+Tagging+of+Transcriptionally+Silent+Genes+in+hiPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Gene Tagging of Transcriptionally Silent Genes in hiPSCs.</a> Stem Cell Reports. 12 (5), 1145-1158 (2019).</li>
<li>Chanthra, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Fluorescent+Reporter+System+Identifies+Laminin-511%2F521+as+Potent+Regulators+of+Cardiomyocyte+Maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A Novel Fluorescent Reporter System Identifies Laminin-511/521 as Potent Regulators of Cardiomyocyte Maturation.</a> Scientific Reports. 10 (1), 4249(2020).</li>
<li>Ribeiro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cardiomyocyte+show+of+force%3A+A+fluorescent+alpha-actinin+reporter+line+sheds+light+on+human+cardiomyocyte+contractility+versus+substrate+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).</li>
<li>Yamanaka, S., Zahanich, I., Wersto, R. P., Boheler, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Proliferation+of+Monolayer+Cultures+of+Embryonic+Stem+%28ES%29+Cell-Derived+Cardiomyocytes+Following+Acute+Loss+of+Retinoblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Enhanced Proliferation of Monolayer Cultures of Embryonic Stem (ES) Cell-Derived Cardiomyocytes Following Acute Loss of Retinoblastoma.</a> PLoS ONE. 3 (12), 3896(2008).</li>
<li>Miyazaki, T., Isobe, T., Nakatsuji, N., Suemori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Adhesion+Culture+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Using+Laminin+Fragments+in+an+Uncoated+Manner%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient Adhesion Culture of Human Pluripotent Stem Cells Using Laminin Fragments in an Uncoated Manner.</a> Scientific Reports. 7 (1), 41165(2017).</li>
<li>Prasad, K. -M. R., Xu, Y., Yang, Z., Acton, S. T., French, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+cardiomyocyte-specific+gene+expression+following+systemic+injection+of+AAV%3A+in+vivo+gene+delivery+follows+a+Poisson+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Robust cardiomyocyte-specific gene expression following systemic injection of AAV: in vivo gene delivery follows a Poisson distribution.</a> Gene Therapy. 18 (1), 43-52 (2011).</li>
<li>Arakawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+evolution+by+hypermutation+and+selection+in+the+B+cell+line+DT40%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Protein evolution by hypermutation and selection in the B cell line DT40.</a> Nucleic Acids Research. 36 (1), e1(2007).</li>
<li>Konno, A., Hirai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+whole+brain+transduction+by+systemic+infusion+of+minimally+purified+AAV-PHP.eB%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Efficient whole brain transduction by systemic infusion of minimally purified AAV-PHP.eB.</a> Journal of Neuroscience Methods. 346, 108914(2020).</li>
<li>Anzai, T., et al. Generation of Efficient Knock-in Mouse and Human Pluripotent Stem Cells Using CRISPR-Cas9. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAnzai%2C+T+%22Methods+of+Molecular+Biology%22">Methods of Molecular Biology</a>. Yoshida, Y., et al. , (2020).</li>
<li>Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Brief+Review+of+Current+Maturation+Methods+for+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells-Derived+Cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">A Brief Review of Current Maturation Methods for Human Induced Pluripotent Stem Cells-Derived Cardiomyocytes.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178(2020).</li>
<li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell+models+for+long-QT+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).</li>
<li>Flores, L. R., Keeling, M. C., Zhang, X., Sliogeryte, K., Gavara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifeact-GFP+alters+F-actin+organization%2C+cellular+morphology+and+biophysical+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Lifeact-GFP alters F-actin organization, cellular morphology and biophysical behaviour.</a> Scientific Reports. 9 (1), 3241(2019).</li>
<li>Sparrow, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Myofilament-Localized+Calcium+Dynamics+in+Adult+Cardiomyocytes+and+the+Effect+of+Hypertrophic+Cardiomyopathy+Mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Measurement of Myofilament-Localized Calcium Dynamics in Adult Cardiomyocytes and the Effect of Hypertrophic Cardiomyopathy Mutations.</a> Circulation Research. 124 (8), 1228-1239 (2019).</li>
</ol>

H.U. ha depositato un brevetto relativo a questo manoscritto.

I PSC-CRM hanno un grande potenziale per essere utilizzati come piattaforma in vitro per modellare le malattie cardiache e testare gli effetti dei farmaci. Tuttavia, è necessario prima stabilire un metodo accurato e unificato per valutare le funzioni PSC-CMs. La maggior parte dei test funzionali funziona con PSC-MC, ad esempio elettrofisiologia, transitore di calcio e metabolismo26,e uno dei primi studi PSC-CM derivati dal paziente riguardava la sindrome del QT lungo27</...

Le malattie cardiovascolari sono la principale causa di mortalità intutto il mondo 1 e la cardiomiopatia rappresenta la terza causa di decessi cardiaci2. La cardiomiopatia è un gruppo collettivo di malattie che colpiscono i muscoli cardiaci. I recenti sviluppi delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPS) e la differenziazione diretta delle cellule iPS verso i cardiomiociti (PSC-CMs) hanno aperto la porta allo studio dei cardiomiociti con il genoma del paziente come modello in vitro di cardiomiopatia. Queste cellule possono essere utilizzate per comprendere la fisiopatologia delle malattie cardiache, per chiarire i loro meccanismi molecolari e per testare diversi candidati terapeutici3. C'è un enorme interesse, quindi sono state generate cellule iPS derivate dal paziente (ad esempio, cardiomiopatia ipertrofica [HCM]4,5, cardiomiopatia ventricolare destra aritmogena [ARVC]6, cardiomiopatia dilatata [DCM]7e cardiomiopatie mitocondrialicorrelate 8,9). Poiché una delle caratteristiche della cardiomiopatia è la disfunzione e l'interruzione dei sarcomeri, è necessario uno strumento valido che misura uniformemente la funzione sarcomere.
L'accorciamento del sarcomero è la tecnica più utilizzata per valutare la funzione del sarcomero e la contrattilità dei cardiomiociti adulti derivati da modelli animali e umani. Per eseguire l'accorciamento del sarcomero, sono necessari sarcomer ben sviluppati visibili sotto il contrasto di fase. Tuttavia, i PSC-PM coltivati in vitro mostrano sarcomeres sottosviluppati e disorganizzati e, pertanto, non possono essere utilizzati per misurare correttamente l'accorciamento del sarcomero10. Questa difficoltà di valutare correttamente la contrattilità dei PSC-CRM ne ostacola l'utilizzo come piattaforma per valutare le funzioni cardiache in vitro. Per valutare indirettamente la contrattilità PSC-CMs, sono state utilizzate microscopie a forza atomica, array di micro-post, microscopia a forza di trazione e misurazioni dell'impedenza per misurare gli effetti del movimento esercitato da queste cellulesull'ambiente circostante 11,12,13. Registrazioni video-microscopie più sofisticate e meno invasive del moto cellulare effettivo (ad esempio, SI8000 di SONY) possono essere utilizzate per valutare in alternativa la loro contrattilità, tuttavia, questo metodo non misura direttamente il movimento del sarcomero o la cinetica di generazione di forza14.
Per misurare direttamente il movimento del sarcomero nei PSC-CRM, stanno emergendo nuovi approcci, come il tagging fluorescente alle proteine sarcomere. Ad esempio, Lifeact viene utilizzato per etichettare l'actina filamentosa (F-actin) per misurare il movimento del sarcomero15,16. Le cellule iPS geneticamente modificate sono un'altra opzione per etichettare le proteine del sarcomero (ad esempio, α-actina [ACTN2] e Miomesina-2 [MYOM2]) dalla proteina fluorescente17,18,19.
In questo documento, descriviamo come eseguire l'imaging time-lapse per misurare l'accorciamento del sarcomero utilizzando Myom2-TagRFP (cellule staminali embrionali di topo [ES]) e ACTN2-mCherry (cellule iPS umane). Mostriamo anche che una cultura modellata facilita l'allineamento dei sarcomei. Inoltre, descriviamo un metodo alternativo di etichettatura dei sarcomei, utilizzando virus associati ad adeno (AAV), che possono essere ampiamente applicati alle cellule iPS derivate dal paziente.

<table><tbody><tr><td>1-Tioglicerolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6145-25</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanolo (55mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>2-metacriloilossietilfosforilcolina (MPC) polimero,NOF</td> <td>Corp.</td><td>LIPIDURE-CM5206</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Fujifilm wako</td><td>166-04836</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di imaging da 35 mm con vetrino coprioggetti in polimero (&micro;-Piatto 35 mm, altezza)</td><td>ibidi</td><td>81156</td><td></td></tr><tr><td>AAVproR Helper Free System (AAV6) (vettori; pHelper, pRC6, pAAV-CMV-Vector)</td><td>Takara</td><td>6651</td><td></td></tr><tr><td>ACTN2-mCherry (AR12, AR21) hiPSCs</td><td>N.A.</td><td></td><td>Abbiamo inserito una casette resistente all'IRES-puromicina a 3' UTR del locus TNNT2 e mCherry attorno al codone di stop di ACTN2 nella linea 610B1 hiPSC, seguendo un metodo descritto altrove (Anzai, Methods Mol Biol, in stampa)</td></tr><tr><td>B-27 Supplement (50X), senza siero</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement, meno insulina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A18956-01</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement (50X), meno Vitamina A</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase (25 U/&micro; L)</td><td>Merck Millipore</td><td>70746</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidina S cloridrato</td><td>Fujifilm wako</td><td>029-18701</td><td></td></tr><tr><td>BMP-4, umano, ricombinante,</td> <td>R & D Sistemi, Inc.</td><td>314-BP-010</td><td></td></tr><tr><td>Albumina di siero bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503-100g</td><td></td></tr><tr><td>C59, antagonista Wnt (WntC59)</td><td>abcam</td><td>ab142216</td><td></td></tr><tr><td>Software di disegno CAD,</td> <td>Robert McNeel and Associates, WA, USA</td> Unità di ultrafiltrazione centrifuga <td>Rhinoceros 6.0</td><td></td></tr><tr><td>(100k MWCO), Vivaspin-20</td><td>Sartorius</td><td>VS2042</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Cayman</td><td>13122</td><td></td></tr><tr><td>Mordenzante al cromo</td><td>Nihon Kagaku Sangyo Co., Ltd., Giappone</td><td>N14B</td><td></td></tr><tr><td>Maschera al cromo rivestita con AZP1350</td><td>Clean Surface Technology Co., Giappone</td><td>CBL2506Bu-AZP</td><td></td></tr><tr><td>Dr. GenTLE Precipitation Carrier (20mg/mL di glicogeno, 3 M di acetato di sodio (pH 5.2))</td><td>Takara</td><td>9094</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Aquila modificata' s Medio (DMEM) - alto glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429-500</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Aquila modificata' s Medio (DMEM) - alto glucosio, senza piruvato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo (99,5)</td><td>Fujifilm wako</td><td>057-00456</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Moregate</td><td>59301104</td><td></td></tr><tr><td>FGF-10, umano, ricombinante,</td> <td>R& D Sistemi, Inc.</td><td>345-FG-025</td><td></td></tr><tr><td>Fattore di crescita dei fibroblasti (basico), umano, ricombinante</td><td>Fujifilm wako</td><td>060-04543</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina da polvere di pelle suina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890-100g</td><td></td></tr><tr><td>Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5154-500</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di coltura con fondo in vetro</td><td>MatTek</td><td>P24G-1.5-13-F/H</td><td></td></tr><tr><td>Ham& rsquo; s F-12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11765-062</td><td></td></tr><tr><td>Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12440-061</td><td></td></tr><tr><td>L-alanina-L-glutammina (GlutaMAX Supplement, 200mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt</td><td>Fujifilm wako</td><td>196-01252</td><td></td></tr><tr><td>Laminin-511 E8 fragment ( LN511-E8, iMatrix-511)</td><td>Allineatore</td> per maschere Nippi <td>892012</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Union Optical Co., Ltd., Giappone</td><td>PEM-800</td><td></td></tr><tr><td>Strumento per litografia senza maschera</td><td>NanoSystem Solutions, Inc., Giappone</td> Soluzione di aminoacidi non essenziali <td>D-Light DL-1000</td><td></td></tr><tr><td>MEM (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Unità filtro per siringa Millex-HV, 0,45 &; m, PVDF (0,45-&micro; Merck</td> <td>Millipore</td><td>SLHVR33RS</td><td></td></tr><tr><td>Myom2-RFP (SMM18)</td><td>N.A.</td><td></td><td>Sviluppato nel nostro precedente articolo (Chanthra, Sci Rep, 2020)</td></tr><tr><td>Supplemento N-2 (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>ORCA-Flash4.0 V3 fotocamera CMOS digitale</td><td>Hamamatsu</td><td>C13440-20CU</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Stemgent</td><td>04-0006-10</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri</td><td>Sansei medical co. Ltd</td><td>01-004</td><td></td></tr><tr><td>Fenolo/Cloroformio/Alcool isoamilico (25:24:1)</td><td>Nippon Gene</td><td>311-90151</td><td></td></tr><tr><td>Polidimetilsilossano (PDMS) elastomero</td><td>Dow Corning Corp., MI, USA</td><td>SILPOT 184</td><td></td></tr><tr><td>polietilenimmina MAX (MW. 40.000)</td><td>Polyscience</td><td>24765-1</td><td></td></tr><tr><td>Sviluppatore di fotoresist positivo</td><td>Tokyo Ohka Kogyo Co. , Ltd., Giappone</td><td>NMD-3</td><td></td></tr><tr><td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A25742</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>Takara</td><td>9034</td><td></td></tr><tr><td>Puromicina Dicloridrato</td><td>Fujifilm wako</td><td>166-23153</td><td></td></tr><tr><td>Activina A ricombinante umana/topo/ratto Proteina R</td><td>& D Sistemi, Inc.</td><td>338-AC-050</td><td></td></tr><tr><td>Proteasi ricombinante tripsina-simile (rTrypsin; </td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12604-039</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>Medium Thermo Fisher Scientific</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>Wafer di silicone</td><td>Matsuzaki Seisakusyo Co., Ltd., Giappone</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio (100 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Spin-coater</td><td>Mikasa Co., Ltd., Giappone</td><td>MS-A100</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia confocale a rotazione</td><td>Oxford Instruments</td><td>Andor Dragonfly Spinning Disk System</td><td></td></tr><tr><td>StemSure LIF, Mouse, ricombinante, Soluzione (10^6U)</td><td>Fujifilm wako</td><td>195-16053</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3010</td><td>Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA</td><td>SU-8 3010</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 sviluppatore</td><td>Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA</td><td>SU-8 sviluppatore</td><td></td></tr><tr><td>Tris-EDTA</td><td>Nippon Gene</td><td>314-90021</td><td></td></tr><tr><td>Vascular Endothelial Growth Factor-A165(VEGF), umano, ricombinante</td><td>Fujifilm wako</td><td>226-01781</td><td></td></tr></tbody></table>

accorciamento sarcomere dei cardiomiociti pluripotenti derivati dalle cellule staminali utilizzando proteine sarcomere con tag fluorescenti.

Sarcomere Shortening of Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes using Fluorescent-Tagged Sarcomere Proteins.

I cardiomiociti pluripotenti derivati dalle cellule staminali (PSC-CMs) possono essere prodotti sia da cellule staminali pluripotenti embrionali che indotte (ES/iPS). Queste cellule forniscono fonti promettenti per la modellazione delle malattie cardiache. Per le cardiomiopatie, l'accorciamento del sarcomero è una delle valutazioni fisiologiche standard che vengono utilizzate con cardiomiociti adulti per esaminare i loro fenotipi di malattia. Tuttavia, i metodi disponibili non sono appropriati per valutare la contrattilità dei PSC-CRM, in quanto queste cellule hanno sarcomer sottosviluppati che sono invisibili sotto microscopia a contrasto di fase. Per risolvere questo problema e per eseguire l'accorciamento del sarcomero con PSC-CMs, sono state utilizzate proteine sarcomere con tag fluorescenti e imaging vivo fluorescente. Le linee Z sottili e una linea M risiedono rispettivamente ad entrambe le estremità e al centro di un sarcomero. Le proteine della linea Z - α-actinin (ACTN2), telethonin (TCAP), e proteina LIM associata all'actina (PDLIM3) - e una proteina M-line - Miomesin-2 (Myom2) - sono state taggate con proteine fluorescenti. Queste proteine taggate possono essere espresse da alleli endogeni come knock-in o da virus adeno-associati (AAV). Qui introduciamo i metodi per differenziare le cellule staminali pluripotenti del topo e dell'uomo dai cardiomiociti, per produrre AAV e per eseguire e analizzare l'imaging dal vivo. Descriviamo anche i metodi per la produzione di francobolli in polidimetilsiloxano (PDMS) per una coltura modellata di PSC-CRM, che facilita l'analisi dell'accorciamento del sarcomero con proteine con tag fluorescenti. Per valutare l'accorciamento del sarcomero, le immagini time-lapse delle cellule che battono sono state registrate a un framerate elevato (50-100 fotogrammi al secondo) sotto stimolazione elettrica (0,5-1 Hz). Per analizzare la lunghezza del sarcomero nel corso della contrazione cellulare, le immagini time-lapse registrate sono state sottoposte a SarcOptiM, un plug-in per ImageJ /Fiji. La nostra strategia fornisce una semplice piattaforma per indagare i fenotipi di malattie cardiache nei PSC-CRM.

Misurazione dell'accorciamento del sarcomere mediante linee di reporter PSC-CMs knock-in. Le PSC-CRM con etichetta sarcomere sono state utilizzate per misurare l'accorciamento del sarcomero. Le linee esprimono Myom2-RFP e ACTN2-mCherry da loci endogeni. TagRFP è stato inserito in Myom2, codificando le M-proteine che si localizzano sulla linea M, mentre mCherry è stato inserito in ACTN2, codificando α-Actinin, che si localizza sulla linea Z<sup class="xre...

Questo metodo può essere utilizzato per esaminare l'accorciamento del sarcomero utilizzando cardiomiociti pluripotenti derivati dalle cellule staminali con proteine sarcomere con tag fluorescente.

Accorciamento sarcomere dei cardiomiociti pluripotenti derivati dalle cellule staminali utilizzando proteine sarcomere con tag fluorescenti.

Pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (PSC-CMs) can be produced from both embryonic and induced pluripotent stem (ES/iPS) cells. These cells ...

È difficile valutare la funzione del sarcomero nei cardiomiociti pluripotenti derivati dalle cellule staminali a causa del loro sarcomero sottosviluppato e disorganizzato. Utilizzando proteine sarcomere con tag fluorescenti, ora possiamo accedere all'accorciamento del sarcomero. Possiamo visualizzare i sarcomer e valutare la loro funzione in vitro utilizzando cardiomiociti derivati da cellule staminali e proteine sarcomere con tag fluorescenti.Utilizzando la trasduzione basata su AAV, possiamo espandere il metodo a qualsiasi cellula staminale pluripotente indotta derivata dal paziente. Questo metodo può essere esteso allo sviluppo della terapia della cardiomiopatia, in quanto può essere utilizzato per valutare direttamente la disfunzione sarcomere correlata alla malattia in vitro. Questo metodo è utile nel campo della cardiologia, incluso lo studio di cardiologia pediatrica.Tuttavia, può anche essere applicato allo studio della disfunzione muscolare scheletrica, come la miopatia. Il giorno meno quattro di induzione di differenziazione, rivestire una piastra a sei porri con 0,5 microgrammi per centimetro quadrato di laminina-511 E8 diluita in PBS per un'incubazione di 30 minuti a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Verso la fine dell'incubazione, trattare le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo con tripsidenza ricombinante per tre minuti a 37 gradi Celsius.Quando le cellule si sono staccate, raccogliere le cellule a medio integrato con il 10%FBS per il conteggio e rimescolare le cellule a un inibitore 1,25 volte 10 alla quinta cella per due millilitri di mezzo AK02N integrato con laminina-511 E8 e inibitore ROCK dopo la centrifugazione. Successivamente, aspirare la soluzione di rivestimento da ogni pozzo della piastra a sei pozzi e seminare due millilitri di cellule in ogni pozzo. Riportare il piatto all'incubatore di coltura cellulare.Dopo quattro giorni, le celle raggiungono l'80% di confluenza. Sostituire il supernatante in ogni pozzo con due millilitri di RPMI più B27 senza mezzo di insulina integrato con inibitore GSK-3 per pozzo per indurre la differenziazione. Dopo due giorni di differenziazione, sostituire delicatamente il mezzo con due millilitri di RPMI più B27 senza mezzo di insulina integrato con inibitore dell'istrice per pozzo.Le celle avrebbero dovuto raggiungere la confluenza al 100%. Il quarto giorno di differenziazione, sostituire delicatamente i supernatanti con due millilitri di RPMI più B27 senza insulina per pozzo. Le cellule dovrebbero rimanere ad alta densità, e alcune potrebbero aver iniziato a galleggiare.Il settimo e il nove giorno di differenziazione, sostituire il supernatante in ogni pozzo con due millilitri di RPMI più B27 con insulina integrata con puromicina per la coltura cardiomiocitaria pluripotente selettiva derivata dalle cellule staminali. A questo punto, le cellule che battono dovrebbero essere osservate all'interno delle colture. Per impostare una coltura di cardiomiociti pluripotente con pattern, utilizzare prima il nastro adesivo per rimuovere qualsiasi polvere dalla superficie di un timbro PDMS su misura e immergere brevemente il timbro nel 70% di etanolo.Utilizzare uno spolverino d'aria per rimuovere l'etanolo dalla superficie del timbro e trattare la superficie con da cinque a 10 microlitri di polimero ed etanolo 0,5%MPC. Quando il polimero si è completamente asciugato, posizionare il timbro su un coprisciuga polimerico in un piatto di imaging da 35 millimetri e posizionare un peso sul timbro. Dopo 10 minuti, utilizzare un microscopio a luce per confermare che il motivo è stato trasferito sul copripavimenti e lavare il piatto e il coverslip due volte con PBS.Dopo il secondo lavaggio, rivestire il coverslip con 0,5 a un microgrammo per centimetro quadrato di laminina-511 E8 diluito in gelatina allo 0,1% per un'incubazione da due a quattro ore a temperatura ambiente. Il giorno 10 di differenziazione, lavare le cellule due volte con PBS, seguito da un trattamento con un millilitro di tripina ricombinante per pozzo per tre o cinque minuti a 37 gradi Celsius. Dopo il conteggio, rimostrare le cellule a un 2,5-5 per 10 alla quinta cellule per millilitro di RPMI più B27 con insulina integrata con concentrazione di puromicina e seminare un millilitro di cellule sulla piastra per un'incubazione notturna a 37 gradi Celsius.La mattina seguente, sostituire il supernatante con RPMI fresco più B27 con insulina integrata con puromicina e riportare le cellule nell'incubatore di coltura cellulare, rinfrescando il mezzo da due a tre volte a settimana fino ai giorni da 21 a 28 per l'imaging. Per l'imaging time-lapse dell'accorciamento del sarcomero nelle colture PCCSM, applicare l'olio sulla lente 100 volte obiettiva di un microscopio confocale fluorescente e selezionare le condizioni di imaging dal vivo nel software associato. Per ottenere dati rappresentativi affidabili, selezionare la frequenza fotogrammi più elevata, impostare l'otturatore in modo che si apra e applicare un binning quattro per quattro in un ritaglio dell'area di acquisizione per ottenere gli intervalli più brevi tra le immagini durante l'imaging time-lapse.Se la velocità di battiaggio delle cellule è bassa, evocare le cellule mediante stimolazione del campo elettrico e avviare la registrazione time-lapse, facendo attenzione che il campo immaginato rimanga a fuoco durante l'imaging. Alla fine del periodo di imaging, salvare le immagini time-lapse in una cartella appropriata. Per analizzare le immagini time-lapse, aprire una serie di immagini time-lapse in ImageJ e regolare la luminosità e il contrasto delle immagini fino a quando il modello di sarcomere non può essere chiaramente osservato.Nel menu Altri strumenti selezionare SarcOptiM e premere Ctrl MAIUSC P e un pulsante micron sulla barra degli strumenti per utilizzare le istruzioni per calibrare il programma. Quindi tracciare una linea attraverso la regione del sarcomero da utilizzare per misurare l'accorciamento del sarcomero, quindi fare clic su AVI a cella singola per iniziare l'analisi di accorciamento del sarcomero. L'imaging time-lapse di cardiomiociti pluripotenti con etichetta sarcomere e modellati può essere utilizzata per misurare l'accorciamento del sarcomero in diversi punti di tempo.Per superare la disorganizzazione del sarcomero tipicamente osservata nelle colture di cardiomiociti pluripotenti a cellule staminali modellate, specifici timbri PDMS possono essere utilizzati per colturare cardiomiociti pluripotenti derivati da cellule staminali modellati in un modello a strisce, che promuove una forma cellulare allungata e un modello di sarcomero più organizzato rispetto alle cellule coltivate in un'area non modello. Le colture modellate promuovono anche una migliore contrazione cellulare e forniscono un profilo di lunghezza del sarcomero liscio rispetto alle cellule coltivate non modello. I cardiomiociti pluripotenti derivati dalle cellule staminali aAV esprimono segnali sarcomerici GFP lungo i cardiomiociti pluripotenti derivati dalle cellule staminali modellati già tre giorni dopo la trasduzione e possono anche essere utilizzati per misurare i profili di contrazione del sarcomero.Inoltre, l'aggiunta di un gene resistente alla blasticidina durante la trasduzione può anche essere utilizzata per facilitare la selezione di cardiomiociti pluripotenti a modelli derivati dalle cellule staminali a una purezza superiore al 90%Per facilitare un'analisi delle immagini più semplice e di qualità superiore, è essenziale identificare un'area con sarcomeri che si muovono linearmente e ottenere immagini alla massima frequenza fotogrammi. Utilizzando questo metodo, possiamo valutare il ruolo della maturazione nelle proteine sarcoma per studiare la disfunzione sarcomere nel cardiomiocita di laboratorio derivato da cellule iPS specifiche della malattia derivate dal paziente.

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L&#39;isolamento e la manipolazione genetica di adulti miociti cardiaci per confocale Imaging

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Accorciamento sarcomere dei cardiomiociti pluripotenti derivati dalle cellule staminali utilizzando proteine sarcomere con tag fluorescenti. (Video) | JoVE Journal

Accorciamento sarcomere dei cardiomiociti pluripotenti derivati dalle cellule staminali utilizzando proteine sarcomere con tag fluorescenti.

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