Name: Isolamento, coltura e ingegneria genetica delle cellule epiteliali pigmentate primarie dei mammiferi per la terapia genica non virale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Impara l'isolamento e la trasfezione di cellule epiteliali pigmentate primarie da cinque specie di mammiferi per la terapia genica oculare non virale con alta vitalità cellulare.

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Un ringraziamento merita Gregg Sealy e Alain Conti per l'eccellente assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Commissione europea nell'ambito del Settimo programma quadro, della Fondazione nazionale svizzera per le scienze e della Fondazione Schmieder-Bohrisch. Z.I. ha ricevuto finanziamenti dal Consiglio europeo della ricerca, ERC Advanced [ERC-2011-ADG 294742] e B.M.W. da una borsa di ricerca Fulbright e da una borsa di studio di eccellenza del governo svizzero.

I protocolli in cui gli animali sono stati coinvolti sono stati eseguiti da personale certificato e previa autorizzazione del Dipartimento cantonale della sécurité, de l'emploi et de la santé (DSES), Domaine de l'expérimentation animale di Ginevra, Svizzera, e secondo la Dichiarazione ARVO per l'uso degli animali nella ricerca oftalmica e visiva (approvazione n. GE/94/17). Ratti adulti sani brown norway, topi C57BL/6 e conigli bianchi neozelandesi sono stati eutanasizzati da un sovradosaggio di Pentobarbital (150 mg/kg) diluito in NaCl iniettato allo 0,9% intraperitoneale e gli occhi sono stati enucleati immediatamente dopo il sacrificio. Occhi suini e bovini sono stati ottenuti da un macello locale entro 6 ore dal sacrificio e sono stati trasportati in laboratorio su ghiaccio.
1. Prima della preparazione
<ol><li>Preparare un mezzo completo (DMEM / F12 di Ham integrato con 10% di siero bovino fetale (FBS), 80 U / mL di penicillina / 80 μg / mL di streptomicina e 2,5 μg / mL di amfotericina B). Riscaldare il mezzo, 1x PBS e 0,25% di tripsina (se necessario) a bagnomaria a 37 °C.</li>
	<li>Metti un drappo sterile nel cappuccio per preparare un posto di lavoro asettico. Introdurre tutti gli strumenti e i materiali sterili necessari all'interno della cappa. NOTA: Solo l'enucleazione degli occhi e la pulizia del tessuto muscolare e della pelle rimanenti sono le procedure eseguite all'esterno del cappuccio, il resto dei passaggi deve essere eseguito all'interno del cappuccio.</li>
</ol>2. Isolamento delle cellule PE di ratto/topo
<ol><li>Usa forbici curve e pinza Colibri per enucleare gli occhi dopo l'eutanasia dell'animale. Pulire il tessuto muscolare rimanente e la pelle dagli occhi usando forbici e pinza (non sterili). NOTA: La dimensione delle forbici e delle pinza utilizzate per l'enucleazione e la pulizia degli occhi dipende dalla specie (ad esempio, per ratti e topi gli strumenti saranno più piccoli di quelli utilizzati per suini e bovini) (vedi Figura S1).<ol>
<li>Raccogliere gli occhi in un tubo da 50 ml riempito con PBS non sterile e trasferire il tubo nella cappa a flusso laminare. Disinfettare gli occhi immergendoli per 2 minuti in una soluzione a base di iodio, quindi trasferirli in una capsula di Petri riempita con PBS sterile.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Apertura della lampadina<ol>
<li>Dopo aver trasferito gli occhi su una capsula di Petri sterile, tenerne uno saldamente vicino al nervo ottico con Colibri o pinna appuntita. Perforare un foro vicino al limite dell'iride (tra pars plana e ora serrata) con un ago da 18 G. Inserire piccole forbici nel foro e tagliare intorno all'iride. Rimuovere il segmento anteriore (cornea, lente e iride) e metterlo in una capsula di Petri. Lasciare il bulbo con il vitreo fino a quando le cellule RPE non sono isolate.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isolamento delle cellule IPE<ol>
<li>Rimuovere la lente e con una pince fine estrarre delicatamente l'iride contenente le cellule IPE. Mettere l'iride in una capsula di Petri, lavare con PBS sterile e lasciarlo in PBS fino a quando non viene preparata più iride.</li>
		<li>Ripeti i passaggi da 2.2.1 a 2.3.1 affinché tutti gli occhi siano preparati quel giorno.</li>
		<li>Aggiungere 50 μL di tripsina allo 0,25% per iride e incubare per 10 minuti a 37 °C. Rimuovere la tripsina, aggiungere 150 μL di mezzo completo per iride e raschiare delicatamente l'IPE con una pipetta Pasteur piatta lucidata a fuoco; utilizzare pinze sottili per immobilizzare il tessuto. Raccogliere la sospensione cellulare e inserire un tubo da 1,5 ml. Utilizzare 10 μL della sospensione cellulare diluita 1:3 con tripano blu per contare le cellule nella camera neubauer34,35.</li>
		<li>Se non trasfettato immediatamente, seminare 200.000 cellule/pozzetti in una piastra a 24 pozzetti (100.000 cellule/cm2)in 1 mL di terreno completo (10% FBS) (per la semina vedi Tabella 1). Posizionare la piastra in un'incubatrice e coltivata a 37 °C, 5% CO2. NOTA: Potrebbe essere necessario raggruppare più occhi insieme per avere abbastanza cellule per la semina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isolamento delle celle RPE<ol>
<li>Rimuovere l'umore vitreo e la retina dal segmento posteriore con una pinna sottile. Evitare di danneggiare l'epitelio pigmentato retinico.</li>
		<li>Taglia il segmento a metà con un bisturi #10 per avere il globo completamente aperto e lavalo con PBS sterile.</li>
		<li>Aggiungere 50 μL di tripsina allo 0,25% per occhio e incubare per 10 minuti a 37 °C. Rimuovere la tripsina e aggiungere 150 μL di mezzo completo per globo e raschiare delicatamente le cellule RPE con un bisturi rotondo; utilizzare pinze sottili per immobilizzare il tessuto. Raccogliere la sospensione cellulare e metterla in un tubo da 1,5 ml. Prendere 10 μL della sospensione cellulare; diluire 1:4 con tripano blu per contare le cellule nella camera di Neubauer.</li>
		<li>Vedere il passaggio 2.3.4. NOTA: Potrebbe essere necessario raggruppare più occhi insieme per avere abbastanza cellule per la semina.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Isolamento delle cellule di PE di coniglio
<ol><li>Eseguire la pulizia e la disinfezione come descritto nei passaggi da 2.1 a 2.1.1.</li>
	<li>Metti un occhio su un impacco di garza sterile e tienilo saldamente vicino al nervo ottico. Aprire l'occhio con il bisturi #11 e le forbici a circa 2 mm sotto il limbus. Rimuovere il segmento anteriore (cornea, lente e iride) e metterlo in una capsula di Petri. Lasciare il bulbo con il vitreo fino a quando le cellule RPE non sono isolate.</li>
	<li>Isolamento delle cellule IPE<ol>
<li>Eseguire il passaggio 2.3.1. Rimuovere il corpo ciliare dall'iride tagliando con un bisturi #10.</li>
		<li>Dopo la preparazione di 2 iris, incubare con 1 mL di tripsina allo 0,25 % a 37 °C per 10 minuti; durante questo periodo, le celle RPE possono essere isolate (vedere il passaggio 3.4). Rimuovere la tripsina e aggiungere 1 mL di mezzo completo all'iride e isolare le cellule grattando accuratamente con una pipetta Pasteur piatta lucidata al fuoco. Risuscimere accuratamente le cellule mediante pipettaggio e trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 1,5 ml. Prendere 10 μL della sospensione cellulare e diluire 1:3 con tripano blu per contare le cellule nella camera di Neubauer.</li>
		<li>Vedere il passaggio 2.3.4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isolamento delle celle RPE<ol>
<li>Eseguire il passaggio 2.4.1.</li>
		<li>Metti una garza sterile in un piatto da 12 pozzetti e metti il bulbo sopra la garza.</li>
		<li>Lavare con PBS ed eseguire il passaggio 2.4.3. NOTA: utilizzare una pipetta Pasteur curva lucidata a fuoco.</li>
		<li>Centrifugare le celle 10 min a 120 x g.</li>
		<li>Vedere il passaggio 2.3.4.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Isolamento delle cellule PE suine
<ol><li>Eseguire la pulizia come descritto nel passaggio 2.1. Lavare con PBS e disinfettare gli occhi immergendo per 2 minuti in soluzione a base di iodio, risciacquare con PBS. Continuare con il passaggio 3.2.</li>
	<li>Isolamento delle cellule IPE<ol>
<li>Eseguire il passaggio 3.3.1. Dopo la preparazione di 2 iris, aggiungere 1 mL di mezzo completo e isolare le celle grattando accuratamente con una pipetta Pasteur piatta lucidata al fuoco. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 1,5 ml. Prendere 10 μL della sospensione cellulare e diluire 1:4 con tripano blu per contare le cellule nella camera di Neubauer.</li>
		<li>Vedere il passaggio 2.3.4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isolamento delle celle RPE<ol>
<li>Eseguire il passaggio 2.4.1. Posizionare la lampadina in una capsula di Petri e lavare con PBS. Riempire la lampadina con 1 mL di mezzo completo.</li>
		<li>Utilizzando una pipetta Pasteur curva lucidata al fuoco, rimuovere con cura le celle RPE. Assicurati di raschiare dal basso verso l'alto per evitare di scivolare verso il basso del complesso di membrana coroide-Bruch. Raccogliere la sospensione cellulare all'interno del bulbo utilizzando una pipetta da 1.000 μL e trasferirla in un tubo da 1,5 mL per la ricaspensione. Prendere 10 μL della sospensione cellulare e diluire 1:8 con tripano blu per contare le cellule nella camera di Neubauer.</li>
		<li>Vedere il passaggio 2.3.4.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Isolamento delle cellule di EP bovina
<ol><li>Eseguire la pulizia come descritto nel passaggio 2.1. Lavare con PBS e disinfettare gli occhi immergendo per 2 minuti in soluzione a base di iodio, risciacquare con PBS. Continuare con il passaggio 3.2.</li>
	<li>Isolamento delle cellule IPE<ol>
<li>Eseguire il passaggio 3.3.1. Dopo la preparazione di due iris, incubare con 2 ml di tripsina allo 0,25% a 37 °C per 10 min. Durante questo periodo, le celle RPE possono essere isolate (vedere il passaggio 5.3).</li>
		<li>Rimuovere la tripsina e aggiungere 2 mL di mezzo completo all'iride e isolare le cellule graffiando accuratamente con una pipetta Pasteur piatta lucidata a fuoco. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 ml. Centrifugare le celle 10 min a 120 x g. Prendere 10 μL della sospensione cellulare e diluire 1:4 con tripano blu per contare le cellule nella camera di Neubauer.</li>
		<li>Se non trasfettato immediatamente, seminare 320.000 cellule/pozzetti in una piastra a 6 pozzetti in 3 ml di terreno completo (10% FBS) (per la semina vedere Tabella 1). Posizionare la piastra in un'incubatrice e coltivata a 37 °C, 5% CO2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isolamento delle celle RPE<ol>
<li>Seguire il passaggio 2.4.1. Posizionare la lampadina in una capsula di Petri e lavare con PBS. Dopo la preparazione di 2 occhi riempire il bulbo circa 3/4 con tripsina e incubare per 25 minuti a 37 °C con il coperchio della capsula di Petri sopra i bulbi.</li>
		<li>Rimuovere la tripsina e aggiungere 1 mL di mezzo completo. Eseguire il passaggio 4.3.2. Centrifugare le celle 10 min a 120 x g.</li>
		<li>Vedere il passaggio 5.2.3.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Coltivazione - cambio medio
<ol><li>Coltura le cellule in DMEM /Ham's F12, integrato con 10% FBS, 80 U / mL penicillina / 80 μg / mL streptomicina e 2,5 μg / mL amfotericina B, a 37 ° C e 5% CO2 in un incubatore umidificato. Dopo 3-4 giorni pipettare su e giù per raccogliere le cellule non aderenti e mettere metà del volume in un altro pozzo. Riempire fino a 1 ml con mezzo completo. NOTA: in questo modo è possibile avere una superficie sufficientemente grande da consentire a tutte le celle isolate di collegarsi e massimizzare l'output.</li>
	<li>Dopo altri 3-4 giorni ripetere la raccolta cellulare, ma questa volta mettendo insieme le cellule non aderenti da due pozzeli in un unico pozzo (ad esempio, A1 + B1 in C1). Aggiungi medio a tutti i pozzi. Osservare le cellule e cambiare il mezzo 2 volte a settimana (per le piastre a 6 e 24 pozzi utilizzare rispettivamente 3 e 1 ml / pozzo). Quando le cellule raggiungono la confluenza, passare al mezzo completo con l'1% di FBS o utilizzare le cellule per esperimenti (ad esempio, trasfezione). NOTA: le cellule RPE e IPE sono confluenti rispettivamente dopo 3-4 e 4-5 settimane dopo l'isolamento. La purezza della coltura cellulare è stata corroborata controllando la morfologia cellulare (cellule pigmentate) e marcatori specifici come descritto da Johnen e colleghi36.</li>
</ol>7. Elettroporazione di celle primarie in PE
<ol><li>Eseguire l'elettroporazione come descritto prima1,37.</li>
	<li>A seconda del numero di cellule trasfettate utilizzare piastre a 6, 24 o 48 polizze (vedi Tabella 2)per seminare le cellule in mezzo senza antibiotici o antimicotici. Per le successive 2 settimane aggiungere gocce con penicillina media contenente (80 U / mL), streptomicina (80 μg / mL) e amfotericina B (2,5 μg / mL) due volte a settimana. Sostituire completamente il mezzo 2 settimane dopo la trasfezione.</li>
	<li>Per determinare la crescita cellulare, l'efficienza della trasfezione e la secrezione proteica, monitorare le cellule settimanalmente al microscopio e analizzare il surnatante di coltura cellulare mediante western blot. Prima della fine della coltura, prendere un surnatante di coltura cellulare di 24 ore per quantificare la secrezione proteica tramite ELISA, contare le cellule, misurare la fluorescenza mediante citometria basata su immagini (nel caso di cellule trasfettate da Venere)seguendo le istruzioni dei produttori (vedere Tabella dei materiali)e raccogliere il pellet cellulare per l'analisi dell'espressione genica basata su RT-qPCR. NOTA: Questi metodi non sono inclusi nel presente documento poiché non è lo scopo di spiegare in dettaglio l'analisi delle cellule, ma piuttosto il loro isolamento. La densità di semina cellulare è la stessa per tutte le specie (100.000 cellule/cm2)ma poiché il numero di cellule isolate varia, sono state utilizzate piastre diverse. Inoltre, per topi, ratti e conigli potrebbe essere necessario mettere in comune 2-3 occhi per avere abbastanza cellule per la semina.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Specie</td>
			<td>Trattamento con tripsina</td>
			<td>N° celle IPE</td>
			<td>N° celle RPE</td>
			<td>Piastra per semina (100.000 celle/cm2)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Topo/ratto</td>
			<td>Sì</td>
			<td>~50.000</td>
			<td>~150.000</td>
			<td>Piastre a 24 pozzi</td>
		</tr>
<tr>
<td>Coniglio</td>
			<td>Sì</td>
			<td>~350.000</td>
			<td>~2.500.000</td>
			<td>Piastre a 24 pozzi</td>
		</tr>
<tr>
<td>Maiale</td>
			<td>No</td>
			<td>~1.000.000</td>
			<td>~3.000.000</td>
			<td>Piastre a 24 pozzi</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bovino</td>
			<td>Sì</td>
			<td>~1.700.000</td>
			<td>~5.000.000</td>
			<td>Piastre a 6 pozzi</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Numero di cellule PE primarie isolate da occhi di specie diverse.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Nome</td>
			<td>Area</td>
			<td>Volume medio</td>
			<td>Tripsina</td>
			<td>Volume medio per fermare l'azione della tripsina</td>
			<td>Densità di semina</td>
		</tr>
<tr>
<td>Piastra a 6 pozzi</td>
			<td>9,6 cm²</td>
			<td>3,0 ml</td>
			<td>0,5 ml</td>
			<td>1,0 ml</td>
			<td>3x105
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Piastra a 24 pozzi</td>
			<td>2,0 cm²</td>
			<td>1,0 ml</td>
			<td>0,2 ml</td>
			<td>0,8 ml</td>
			<td>5x104
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Piastra a 48 pozzi</td>
			<td>1,1 cm²</td>
			<td>0,5 ml</td>
			<td>0,1 ml</td>
			<td>0,4 ml</td>
			<td>0,5-1x104
</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: Volumi di coltura cellulare e densità di semina.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Avere metodi standardizzati per isolare e colturare le cellule PE è fondamentale nello sviluppo di nuovi approcci terapeutici per le malattie degenerative della retina. Con i protocolli qui presentati, le cellule PE possono essere isolate con successo da diverse specie e coltivate per lunghi periodi (fino ad ora, la coltura più lunga è stata mantenuta per 2 anni1,38); è stata osservata la morfologia, la pigmentazione e la funzione tipiche delle cellule PE (<stron...

Il nostro gruppo si sta concentrando sullo sviluppo di approcci rigenerativi per il trattamento della degenerazione neuroretinica, cioè AMD, mediante terapia genica non virale basata su RPE e IPE. L'istituzione pre-clinica di tali terapie richiede modelli in vitro trasferibili agli esseri umani. Pertanto, l'obiettivo dello studio qui presentato è quello di fornire protocolli per l'isolamento, la coltura e l'ingegneria genetica delle cellule PRIMARIE RPE e IPE. Il razionale per stabilire l'isolamento delle cellule PE da più specie è quello di confermare in modo robusto la sicurezza e l'efficienza dell'approccio e aumentarne la riproducibilità e la trasferibilità. La linea cellulare RPE umana disponibile ARPE-19 differisce dalle cellule primarie (ad esempio, sono meno pigmentate) ed è, quindi, solo di valore limitato per le analisi pre-cliniche1. Inoltre, le cellule di mammifero non umane possono essere acquistate a costi inferiori e in quantità maggiori; il tessuto del donatore umano può essere ottenuto da varie banche oculari, ma la disponibilità è limitata e costosa. Infine, i nuovi medicinali per terapie avanzate (ATMP, cioè cellule, tessuti o medicinali per terapia genica) devono essere applicati in almeno due specie diverse prima di essere testati nei pazienti e questi studi in vivo richiedono la preparazione di trapianti di cellule allogeniche.
Le malattie neurodegenerative della retina sono la principale causa di cecità nei paesi industrializzati, comprendendo malattie comuni come l'AMD, così come malattie rare come la retinite pigmentosa, in cui la morte delle cellule retiniche alla fine porta alla cecità. Il danno alle cellule RPE, ai fotorecettori e alle cellule gangliari retiniche (RGC) può in alcuni casi essere rallentato, ma attualmente non sono disponibili terapie curative. Gli ATMP offrono il potenziale per correggere i difetti genetici, integrare geni terapeutici o sostituire le cellule degenerate, consentendo così lo sviluppo di terapie rigenerative e curative per malattie come l'AMD; 13 terapie geniche hanno già ottenuto l'approvazione alla commercializzazione, inclusa una terapia per il trattamento della degenerazione retinica associata alla mutazione RPE652,3. Tra gli anziani (>60 anni), ~ 30 milioni di persone in tutto il mondo sono affette da AMD4neovascolare (nvAMD) o avascolare (aAMD). Entrambe le forme sono indotte da fattori scatenanti associati all'età tra cui danno ossidativo, compromissione della funzione e perdita di cellule RPE seguita da degradazione dei fotorecettori, tra gli altri (ad esempio alleli di rischio genetico, fumo, ipertensione)5,6. In nvAMD, la patogenesi è aggravata da uno squilibrio di fattori angiogenici e anti-angiogenici a favore del fattore di crescita endoteliale vascolare angiogenico (VEGF) che induce la neovascolarizzazione coroidale (CNV). Ad oggi, solo nvAMD è curabile con iniezioni intravitreali mensili di inibitori della proteina VEGF per sopprimere il CNV; nessun trattamento efficace è ancora disponibile per aAMD6,7.
Diversi studi hanno valutato terapie cellulari per sostituire la terapia anti-VEGF: gli studi condotti da Binder et al., in cui cellule RPE autologhe appena raccolte sono state trapiantate in pazienti con nAMD8,9,10,hanno mostrato un moderato miglioramento visivo, ma solo un piccolo gruppo di pazienti ha raggiunto un'acuità visiva finale abbastanza alta da consentire la lettura. Recentemente, uno studio clinico di fase I ha utilizzato un cerotto RPE derivato da cellule staminali embrionali per trattare l'AMD con risultati promettenti; vale a dire, efficacia, stabilità e sicurezza del cerotto RPE per un massimo di 12 mesi in 2 dei 10 pazienti trattati11. Inoltre, diversi gruppi hanno pubblicato studi in cui i cerotti autologhi RPE-Bruch membrana-coroide sono stati prelevati dalla retina periferica e trapiantati nella macula12,13,14; e per il trapianto sono stati generati cerotti RPE derivati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC)15. Per l'aAMD, gli anticorpi mirati alla via del complemento sono stati testati in studi clinici6,16 e uno studio di fase I utilizzando una singola iniezione intravitreale di un vettore virale adeno-associato (AAV) che codifica il gene per il fattore CD59 (AAVCAGsCD59) in pazienti con atrofia geografica (GA) è stato completato17; lo studio di fase II è stato recentemente avviato e mira a reclutare 132 pazienti con aAMD avanzata e a valutare l'esito a 2 anni dopo l'intervento18. Infine, il gruppo di studio FocuS ha avviato uno studio clinico multicentrico di fase I/II che valuta la sicurezza, la risposta alla dose e l'efficacia di un vettore AAV ricombinante non replicante che codifica un fattore del complemento umano19.
In primo luogo, l'obiettivo di una terapia rigenerativa AMD è il trapianto di cellule RPE funzionali, che sono state danneggiate o perse. Tuttavia, le cellule IPE e RPE condividono molte somiglianze funzionali e genetiche (ad esempio, fagocitosi e metabolismo del retinolo) e, poiché le cellule IPE sono raccolte in modo più fattibile, sono state proposte come sostituto RPE20. Anche se è stato precedentemente dimostrato che il trapianto di cellule IPE ritarda la degenerazione dei fotorecettori nei modelli animali21,22 e stabilizza la funzione visiva nei pazienti con nvAMD allo stadio finale, non è stato osservato alcun miglioramento significativo in questipazienti 23. La mancanza di efficacia può essere dovuta al basso numero di cellule trapiantate e/o allo squilibrio dei fattori retinici neuroprotettivi. Un approccio alternativo sarebbe quello di trapiantare cellule epiteliali pigmentate trasfettate che sovraesprimono fattori neuroprotettivi per ripristinare l'omeostasi retinica, mantenere le cellule RPE rimanenti e proteggere i fotorecettori e gli RGC dalla degenerazione. Di conseguenza, proponiamo una nuova terapia che comprende il trapianto di cellule funzionali RPE o IPE che sono state sottoposte a ingegneria genetica per secernere proteine neuroprotettive e anti-angiogeniche, come PEDF, GM-CSF o fattori di crescita insulino-simili (IGF). Il vantaggio di sviluppare e analizzare questo approccio in diverse specie invece di utilizzare una linea cellulare, una sola specie, o tessuto umano è: 1) aumentata riproducibilità e trasferibilità dei risultati come dimostrato da numerosi studi realizzati in laboratori indipendenti e diverse specie1,24,25; 2) le cellule suine o bovine sono fattibilmente usa e getta senza il sacrificio di altri animali; 3) la disponibilità soprattutto di cellule suine e bovine consente a grandi serie di test di produrre risultati robusti; 4) la conoscenza di isolare, colturare e modificare geneticamente le cellule dai modelli maggiormente utilizzati consente analisi in vivo in più specie24,25,26 e offre quindi un migliore rapporto rischio-beneficio per i primi pazienti trattati; 5) la flessibilità del protocollo presentato ne consente l'utilizzo in vari modelli e set up sperimentali e per tutte le terapie cellulari oculari con e senza ingegneria genetica. Al contrario, tecniche alternative come le linee cellulari o il tessuto umano sono solo di limitata trasferibilità e/ o disponibilità limitata. Le linee cellulari come l'ARPE-19 sono ideali per esperimenti preliminari; tuttavia, la bassa pigmentazione e l'alta proliferazione differiscono significativamente dalle cellule primarie1. Le cellule RPE e IPE, isolate dal tessuto umano del donatore, offrono una preziosa fonte per esperimenti in vitro trasferibili; tuttavia, otteniamo tessuto umano da una Banca degli occhi statunitense-americana, il che significa che il tessuto ha almeno due giorni (dopo l'enucleazione) e richiede un trasporto lungo e costoso, ma il tessuto del donatore locale non è disponibile in quantità sufficienti per una ricerca produttiva. Il vantaggio dell'uso di cellule primarie è confermato da molteplici studi di altri gruppi27,28.
Per lo sviluppo di una terapia genica non virale a base cellulare utilizzando il sistema di trasposoni SB100X per trasfettare cellule primarie RPE e IPE con i geni che codificano per PEDF e/o GM-CSF per trattare nvAMD e aAMD, rispettivamente29,30,31,32,abbiamo prima stabilito la trasfezione delle cellule ARPE-191 . Successivamente, i protocolli di isolamento e trasfezione sono stati stabiliti in cellule primarie bovine e sucine facilmente accessibili. Ora, è stato stabilito l'isolamento e la trasfezione di cellule primarie RPE e IPE da cinque diverse specie, da piccoli (come topi) a grandi mammiferi (come bovini). È stato confermato in cellule primarie RPE e IPE derivate da occhi di donatori umani30. La produzione conforme alle buone pratiche di fabbricazione (GMP) dell'ATMP è stata convalidata utilizzando anche tessuto di donatore umano33. Infine, sia la sicurezza che l'efficienza dell'approccio sono state valutate in vivo in tre diverse specie per le quali il protocollo è stato adattato: topo, ratto e coniglio. Nel set-up clinico, una biopsia dell'iride sarà prelevata dal paziente e le cellule IPE saranno isolate e trasfettate nella camera bianca, prima che le cellule vengano trapiantate subretinamente nello stesso paziente. L'intero processo si svolgerà durante una singola sessione chirurgica della durata di circa 60 minuti. Lo sviluppo dell'approccio terapeutico e la valutazione della sua efficienza hanno richiesto eccellenti modelli in vitro ed ex vivo per implementare metodi di consegna genica robusti ed efficienti, per analizzare l'efficienza della consegna genica, la produzione terapeutica di proteine e gli effetti neuroprotettivi e per produrre trapianti di cellule per testare l'approccio in vivo1,24,25,29,30 . Vale la pena ricordare che la terapia ha l'approvazione etica per uno studio clinico di fase Ib/IIa da parte della commissione etica per la ricerca del Cantone di Ginevra (n. 2019-00250) e attualmente gli ultimi dati pre-clinici richiesti per l'autorizzazione dalle autorità di regolamentazione svizzere sono raccolti utilizzando il protocollo presentato. A questo proposito, i dati pre-clinici in vivo hanno dimostrato una significativa riduzione del CNV e un'ottima sicurezza24,25,31.
Qui viene descritto l'isolamento e la coltura di cellule RPE / IPE da bovini, suini, conigli, ratti e topi e l'uso del sistema di trasposone integrativo SB100X combinato con l'elettroporazione come metodo efficiente di consegna genica. In particolare, le cellule PE primarie sono state trasfettate per sovraesprimere PEDF e GM-CSF. La raccolta di questi protocolli consente di eseguire gli studi in vitro e in vivo in tutte le fasi pre-cliniche dello sviluppo di ATMP. Inoltre, il set-up ha il potenziale per essere adattato ad altri geni di interesse e malattie.

<table><tbody><tr><td>Piastre a 12 pozzetti</td><td>Corning</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>Piastre a 24 pozzetti</td><td>Corning</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Piastre a 48 pozzetti</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>150687</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 6 pozzetti</td><td>Greiner</td><td>7657160</td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Mundipharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bonn micro pinze piatte</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinze Colibri (sterile)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CytoTox-Glo Saggio di citotossicità</td><td>Promega</td><td>G9291</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/Ham's F12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8062</td><td></td></tr><tr><td>Drappeggio (sterile)</td><td>M&ouml; lnlycke Health Care</td><td>800530</td><td></td></tr><tr><td>Tampone per elettroporazione 3P.14</td><td>3P Farmaceutico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Brunschwig</td><td>P40-37500</td><td></td></tr><tr><td>Pinze (diverse dimensioni) (sterile)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Impacco di garza</td><td>PROMEDICAL AG</td><td>25403</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (0,9%)</td><td>Laboratorium Dr. Bichsel AG</td><td>1000090</td><td></td></tr><tr><td>Ago (18G)&nbsp;</td><td>Terumo</td><td>TER-NN1838R</td><td></td></tr><tr><td>Kit di Trasfezione Neon 10 & micro; L</td><td>ThermoFisher Scientific MPK1096</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema di trasfezione al neon</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK5000S</td><td></td></tr><tr><td>Camera Neubauer</td><td>Marienfeld-superior</td><td>640010</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta Pasteur (lucidante a fuoco)</td><td>Witeg</td><td>4100150</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781-100</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital (Tiopental Inresa)</td><td>Ospedalia AG</td><td>31408025</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>150288</td><td></td></tr><tr><td>pFAR4-PEDF</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pFAR4-SB100X</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pFAR4-Venus</td><td></td><td></td><td>Pastor et al., 2018. Gentilmente fornito dal Prof. Scherman e dalla Prof.ssa Marie</td></tr><tr><td>pSB100X (250 ng/&micro; L)</td><td></td><td></td><td>M&aacute; t&eacute; s et al., 2009. Fornito dal Prof. Izsvak</td></tr><tr><td>pT2-CAGGS-Venus</td><td></td><td></td><td>Johnen et al., 2012</td></tr><tr><td>pT2-CMV-GMCSF-His plasmide DNA (250 ng/&micro; L)</td><td></td><td></td><td>Clonato nel nostro laboratorio</td></tr><tr><td>pT2-CMV-PEDF-His DNA plasmidico (250 ng/&micro; L)</td><td></td><td></td><td>Pastor et al., 2018</td></tr><tr><td>scarpel n. 10</td><td>Swann-Morton</td><td>501</td><td></td></tr><tr><td>scarpel n. 11</td><td>Swann-Morton</td><td>503</td><td></td></tr><tr><td>Forbici Bonn extra fini curve a punta affilata (sterile)&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Punta affilata-affilata dritta Forbici Bonn extra fini (sterili)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tali Citometro a immagine</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T10796</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina 0,25%&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25050014</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina 5%/EDTA 2%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>Vannas forbici a molla curve (sterili)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento, coltura e ingegneria genetica delle cellule epiteliali pigmentate primarie dei mammiferi per la terapia genica non virale

Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy

La degenerazione maculare legata all'età (AMD) è la causa più frequente di cecità nei pazienti >60 anni, che colpisce circa 30 milioni di persone in tutto il mondo. L'AMD è una malattia multifattoriale influenzata da fattori ambientali e genetici, che portano a compromissione funzionale della retina a causa della degenerazione cellulare epiteliale pigmentata retinica (RPE) seguita dalla degradazione dei fotorecettori. Un trattamento ideale includerebbe il trapianto di cellule RPE sane che secernono fattori neuroprotettivi per prevenire la morte delle cellule RPE e la degenerazione dei fotorecettori. A causa delle somiglianze funzionali e genetiche e della possibilità di una biopsia meno invasiva, il trapianto di cellule epiteliali pigmentate dell'iride (IPE) è stato proposto come sostituto dell'RPE degenerato. La secrezione di fattori neuroprotettivi da parte di un basso numero di cellule trapiantate subretinamente può essere ottenuta mediante trasfezione mediata da trasposoni(SB100X)con geni che codificano per il fattore derivato dall'epitelio pigmentato (PEDF) e / o il fattore stimolante le colonie di macrofagi dei granulociti (GM-CSF). Abbiamo stabilito l'isolamento, la coltura e la trasfezione mediata da SB100Xdi cellule RPE e IPE di varie specie tra cui roditori, maiali e bovini. I globi vengono espiantati e la cornea e la lente vengono rimosse per accedere all'iride e alla retina. Utilizzando una spatola su misura, le celle IPE vengono rimosse dall'iride isolata. Per raccogliere le cellule RPE, può essere necessaria un'incubazione di tripsina, a seconda della specie. Quindi, utilizzando la spatola personalizzata RPE, le celle vengono sospese nel mezzo. Dopo la semina, le cellule vengono monitorate due volte a settimana e, dopo aver raggiunto la confluenza, trasfettate dall'elettroporazione. L'integrazione genica, l'espressione, la secrezione proteica e la funzione sono state confermate da qPCR, WB, ELISA, immunofluorescenza e saggi funzionali. A seconda della specie, 30.000-5 milioni (RPE) e 10.000-1,5 milioni (IPE) di cellule possono essere isolate per occhio. Le cellule geneticamente modificate mostrano una significativa sovraespressione di PEDF/GM-CSF con la capacità di ridurre lo stress ossidativo e offrono un sistema flessibile per analisi ex vivo e studi in vivo trasferibili all'uomo per sviluppare approcci di terapia genica oculare.

Isolamento dell'EP da diverse specie di mammiferi Utilizzando i protocolli di cui sopra, le cellule IPE e RPE sono state isolate e coltivate con successo da cinque specie diverse. Il numero di cellule ottenute da ciascuna procedura dipende dalla specie e dalle dimensioni dell'occhio (Tabella 1). Come mostrato nella Figura 1,le cellule mostrano la morfologia e la pigmentazione tipiche delle cellule PE (ad eccezione delle cellule di coniglio mostrate, deriv...

Qui viene presentato un protocollo per isolare e trasfezionare le cellule epiteliali primarie dell'iride e del pigmento retinico da vari mammiferi (topi, ratti, conigli, suini e bovini). Il metodo è ideale per studiare approcci di terapia genica oculare in vari set-up per analisi ex vivo e studi in vivo trasferibili all'uomo.

Isolamento, coltura e ingegneria genetica delle cellule epiteliali pigmentate primarie dei mammiferi per la terapia genica non virale

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a ...

Il protocollo è significativo poiché mostra l'isolamento e la trasfezione di cellule epiteliali pigmentate da cinque mammiferi come un sistema ottimale per studiare la terapia genica oculare in varie configurazioni. Il vantaggio principale di questo metodo è la sua flessibilità, trasferibilità, alta resa cellulare, vitalità e tasso di trasfezione a causa delle cinque specie e del sistema di trasposone SB100X non virale utilizzato. Queste tecniche sono state sviluppate per studiare approcci di terapia genica mirati alle cellule epiteliali pigmentate della retina e dell'iride, che sono isolate e trasfettate nel presente protocollo, ma sono utilizzabili per qualsiasi ricerca oculare.A dimostrare la procedura sarà Gregg Sealy, un tecnico del laboratorio. Dopo l'eutanasia dell'animale, utilizzare forbici curve e pinza Colibri per enucleare gli occhi, quindi pulire il tessuto muscolare rimanente e la pelle dagli occhi. Raccogliere gli occhi in un tubo da 50 millilitro riempito con PBS non sterile e trasferire il tubo nella cappa a flusso laminare.Disinfettarli immergendoli in una soluzione a base di iodio per due minuti, quindi trasferire gli occhi in un tubo da 50 millilitro riempito con PBS sterile. Metti un occhio su una garza sterile e tieni saldamente l'occhio vicino al nervo ottico. Quindi tagliare vicino al limite dell'iride con un bisturi numero 11.Usando le forbici, tagliare intorno all'iride e rimuovere il segmento anteriore e metterlo in una capsula di Petri, lasciando il bulbo con il vitreo fino a quando l'epiteliale pigmentato retinico, o cellule RPE, sono isolati. Per isolare l'epiteliale pigmentato dell'iride, o cellule IPE, rimuovere la lente con una pinciglia fine ed estrarre delicatamente l'iride contenente le cellule IPE. Mettere l'iride in una capsula di Petri e lavarla con PBS sterile.Aggiungere 500 microlitri di tripsina allo 0,25% e incubare per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Rimuovere la tripsina, aggiungere 500 microlitri di mezzo completo e raschiare delicatamente l'IPE con una pipetta Pasteur piatta e lucidata a fuoco. Raccogliere la sospensione cellulare e metterla in un tubo da 1,5 millilitro.Contare le cellule usando la camera neubauer e seminare 0,2 milioni di cellule per pozzetto in una piastra da 24 pozzetti con un millilitro di mezzo completo. Posizionare la piastra in un'incubatrice e coltivata a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Per isolare le cellule RPE, rimuovere l'umore vitreo e la retina dal segmento posteriore con una pinna sottile.Mettere le lampadine nella piastra a 24 pozzetti e aggiungere 500 microlitri da 0,25% di tripsina per occhio e incubare per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Rimuovere la tripsina, aggiungere 500 microlitri di mezzo completo per globo e raschiare delicatamente le celle RPE con una pipetta Pasteur curva e lucidata a fuoco. Raccogliere la sospensione cellulare e metterla in un tubo da 1,5 millilitro.Contare le cellule usando la camera di Neubauer e seminare le cellule come descritto in precedenza. Posizionare il piatto nell'incubatrice. Pulire il tessuto muscolare e la pelle rimanenti dagli occhi e disinfettare gli occhi in una soluzione a base di iodio e risciacquarli con PBS.Per isolare le cellule IPE, rimuovere la lente ed estrarre l'iride come descritto in precedenza. Dopo aver preparato due iris, aggiungere un millilitro di mezzo completo e isolare le cellule graffiando con una pipetta Pasteur piatta e lucidata a fuoco, quindi contare e seminare le cellule. Posizionare il piatto nell'incubatrice.Per isolare le cellule RPE, rimuovere il vitreo e la retina dal segmento posteriore e posizionare il bulbo in una capsula di Petri. Riempire il bulbo con un mezzo completo da un millilitro. Utilizzando una pipetta Pasteur curva e lucidata a fuoco, rimuovere le celle RPE.Raccogliere la sospensione cellulare all'interno del bulbo utilizzando una pipetta da 1.000 microlitri e trasferirla in un tubo da 1,5 millilitro per la ricasuspensione. Quindi contare e seminare le cellule e incubare la piastra come precedentemente dimostrato. Dopo la pulizia, aprire l'occhio e tagliare intorno all'iride per rimuovere il segmento anteriore, quindi inserire una capsula di Petri.Lasciare il bulbo con il vitreo fino a quando le cellule RPE non sono isolate. Per isolare le cellule IPE, se la lente viene fornito con il segmento anteriore, rimuovere la lente e utilizzare una pinzo fine per estrarre delicatamente l'iride contenente le cellule IPE. Mettere l'iride in una capsula di Petri e lavarla con PBS sterile.Tagliare il corpo ciliare con un bisturi numero 10. Dopo aver preparato le iridi, incubarle con due millilitri di tripsina allo 0,25% a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Rimuovere la tripsina e aggiungere due millilitri di mezzo completo, quindi isolare le celle graffiando con una pipetta Pasteur piatta e lucidata a fuoco.Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da due millilitri e centrifugare le cellule per 10 minuti a 120 volte G.Scartare il surnatante e risospentare le cellule in due millilitri di mezzo completo. Semina 0,32 milioni di cellule per pozzo in una piastra a sei pozzetti in tre millilitri di mezzo completo. Posizionare la piastra in un'incubatrice e coltivata a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica.Per isolare le cellule RPE, rimuovere l'umore vitreo e la retina dal segmento posteriore con una pinca. Evitare di danneggiare l'epitelio pigmentato retinico. Lavare la lampadina con PBS.Dopo aver preparato entrambi gli occhi, riempire il bulbo di circa tre quarti pieno di tripsina e incubare per 25 minuti a 37 gradi Celsius con la palpebra della capsula di Petri sulla parte superiore dell'occhio del bulbo. Rimuovere la tripsina e aggiungere un millilitro di mezzo completo. Utilizzando una pipetta Pasteur curva e lucidata a fuoco, rimuovere le celle RPE.Raccogliere la sospensione cellulare all'interno del bulbo e trasferirla in un tubo da 1,5 millilitro per la ricaspensione. Centrifugare le cellule per 10 minuti a 120 volte G.Seed 0,32 milioni di cellule per pozzetti in una piastra a sei pozzetti in tre millilitri di mezzo completo. Posizionare la piastra in un'incubatrice e coltivata a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica.Coltura le cellule a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica in un incubatore umidificato. Dopo tre o quattro giorni, pipettare su e giù per raccogliere cellule non aderenti e mettere metà del volume in un altro pozzo. Riempire il pozzo a un millilitro con un mezzo completo.Dopo altri tre o quattro giorni, ripeti la raccolta delle cellule, questa volta combinando le cellule non aderenti da due pozzeli in uno. Aggiungi medio a tutti i pozzi. Osservare le cellule e cambiare il mezzo due volte a settimana.Quando le celle raggiungono la confluenza, passare al mezzo completo con l'1% di FBS. Utilizzando i protocolli di cui sopra, le cellule IPE e RPE sono state isolate e coltivate con successo da cinque specie diverse. Il modello di espressione di RPE è stato confermato nelle cellule IPE bovine primarie mediante immunofluorescenza per RPE65.La vitalità cellulare è stata studiata per escludere una potenziale tossicità del tampone di elettroporazione utilizzando un kit di analisi della citotossicità disponibile in commercio e un controllo elettroporato del nodo. Non è stato osservato alcun impatto sulla vitalità cellulare. Le cellule epiteliali pigmentate precolturate di diverse specie sono state trasfettate con la proteina Di Venere fluorescente gialla.Le cellule RPE19 trasfettate sono state utilizzate come controllo positivo. La quantificazione dell'efficienza di trasfezione nell'RPE dei suini precolturati è mostrata qui. Le cellule epiteliali del pigmento di coniglio appena isolate sono state trasfettate con la proteina fluorescente gialla Venere e sono state monitorate al microscopio.Le cellule epiteliali pigmentate sono state trasfettate con il fattore derivato dall'epitelio pigmentato e la secrezione proteica è stata monitorata da Western blot. Il segnale per le cellule trasfettate era più alto rispetto alle cellule non trasfettate per tutte le specie e i giorni studiati, e non è stata osservata alcuna diminuzione della secrezione proteica entro questo periodo. È fondamentale evitare di raschiare le cellule con strumenti affilati.Qui vengono utilizzate pipette Pasteur lucidate a fuoco, tranne che nei piccoli occhi di topo, dove deve essere usato un bisturi rotondo. Le cellule epiteliali pigmentate possono essere utilizzate per sviluppare approcci di terapia genica e per simulare condizioni patologiche, ad esempio danni da stress ossidativo. Questi modelli possono anche essere utilizzati per testare farmaci terapeutici.

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In questo video, mostriamo una procedura per ottenere cellule epiteliali pigmentate oculari da un modello di coniglio. Le cellule sono utili nello sviluppo di strategie terapeutiche per le malattie degenerative della retina.

Isolamento delle cellule IPE e RPE: una tecnica per ottenere cellule epiteliali del pigmento oculare dall'occhio di coniglio

In questo video descriviamo una tecnica per isolare le cellule epiteliali pigmentate dell'iride e della retina dagli occhi dei suini per ottenere le loro colture primarie per studi in vivo ed ex vivo. Queste cellule pigmentate potrebbero essere geneticamente modificate per studiare approcci rigenerativi per il trattamento dei disturbi oculari.

Isolamento di cellule IPE e RPE: una tecnica per ottenere cellule epiteliali pigmentate da occhio suino isolato

Questo video mostra la procedura per isolare le cellule epiteliali pigmentate retiniche, o RPE, e le cellule epiteliali pigmentate dell'iride, o IPE, dagli occhi bovini raccolti. Le cellule isolate possono essere coltivate per studiare il loro ruolo nel trattamento delle malattie oculari.

Isolamento delle cellule RPE e IPE dall'occhio bovino: una procedura per raccogliere e coltivare cellule epiteliali pigmentate primarie bovine

Pulcino colture di cellule della retina embrionali costituiscono validi strumenti per lo studio della biologia dei fotorecettori. Abbiamo sviluppato una tecnica di trasferimento genico efficace sulla base di ex ovo plasmide elettroporazione delle retine precedenti alla cultura. Questa tecnica aumenta considerevolmente l'efficienza di transfezione su protocolli attualmente disponibili, rendendo la manipolazione genetica fattibile per questo sistema.

Trasferimento efficiente Gene in Chick retine per cellulari primarie Cultura Studies: An Ex-ovo Elettroporazione Approach

Abbiamo sviluppato un protocollo per trasfettare le cellule epiteliali pigmentate umane primarie mediante elettroporazione con il gene che codifica il fattore derivato dall'epitelio pigmentato (PEDF) utilizzando il sistema di trasposone della Bella Addormentata (SB). Il successo della trasfezione è stato dimostrato mediante reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR), immunoblotting e saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA).

Modificazione genetica basata sull'elettroporazione delle cellule epiteliali pigmentate umane primarie utilizzando il sistema di trasposone della bella addormentata nel bosco

Questo manoscritto descrive un protocollo semplificato per l'isolamento delle cellule dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) dagli occhi dei topi in modo graduale. Il protocollo include l'enucleazione e la dissezione degli occhi di topo, seguita dall'isolamento, dalla semina e dalla coltura delle cellule RPE.

Isolamento delle cellule primarie dell'epitelio pigmentato retinico del topo

Qui viene presentato un metodo facile da seguire per la coltura in vitro di cellule epiteliali primarie del pigmento retinico suino.

Coltura primaria di cellule epiteliali pigmentate retiniche suine

Descriviamo un metodo semplice ed efficiente per isolare le cellule dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) dagli occhi di giovani cavie pigmentate. Questa procedura consente studi di biologia molecolare di follow-up sull'RPE isolato, comprese le analisi di espressione genica.

Isolamento delle cellule epiteliali pigmentate retiniche da occhi di porcellino d'India

Questo protocollo delinea la procedura per ottenere e coltivare cellule epiteliali pigmentate retiniche primarie (RPE) da occhi suini di provenienza locale. Queste cellule rappresentano un'alternativa di alta qualità alle cellule staminali e sono adatte per la ricerca retinica in vitro .

Isolamento di cellule epiteliali pigmentate retiniche primarie suine per la modellazione in vitro

L'epitelio pigmentato retinico (RPE) agisce come una barriera cruciale tra la coroide e la retina, promuovendo la salute e la funzione dei tipi di cellule retiniche, come i fotorecettori. In questo articolo, descriviamo un protocollo semplice ed efficace per isolare e coltivare l'EPR murino adulto.

Un metodo semplificato per l'isolamento e la coltura di cellule epiteliali pigmentate retiniche da topi adulti

Impara l'isolamento e la trasfezione di cellule epiteliali pigmentate primarie da cinque specie di mammiferi per la terapia genica oculare non virale con alta vitalità cellulare.

Isolamento, coltura e ingegneria genetica delle cellule epiteliali pigmentate primarie dei mammiferi per la terapia genica non virale (Video) | JoVE Journal

Isolamento, coltura e ingegneria genetica delle cellule epiteliali pigmentate primarie dei mammiferi per la terapia genica non virale

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