Fluorimetro in miniatura open source per monitorare le reazioni di amplificazione dell'acido nucleico isotermico in tempo reale in impostazioni limitate alle risorse

Questo metodo consente a individui senza esperienza elettronica di costruire strumenti come questo fluorimetro per l’amplificazione e il rilevamento dell’acido nucleico isotermico, che è fondamentale per la diagnostica molecolare. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il sistema può essere completamente assemblato da materiali disponibili in commercio e software open source a basso costo. Questo fluorimetro può essere utilizzato con più metodi di amplificazione isotermica.

Ciò è importante perché i metodi di amplificazione isotermica sono sempre più utilizzati per rilevare un’ampia gamma di malattie infettive ed ereditarie. Per assemblare l’alloggiamento ottico, posizionare un inserto filettato lungo 4-40 pollici nel foro sopra il pezzo STL inferiore dell’involucro ottico e posizionare un inserto filettato lungo 4-40 da 1/4 pollice in tutti gli altri fori del pezzo. Inserire la scheda di prova centrale, nella cavità superiore dell’alloggiamento con i cinque perni rivolti verso la parte superiore e più vicina all’asse centrale del dispositivo e fissare la scheda di prova con una vite 4-40 lunga 3/16 pollici.

Posizionare uno degli obiettivi di lunghezza focale di 20 millimetri nella sezione sotto la scheda di prova centrale con il lato convesso rivolto verso la parte inferiore del dispositivo e lontano dalla scheda di prova. Per creare la prima configurazione, posizionare il filtro passa lungo nella sezione successiva sotto l’obiettivo di lunghezza focale di 20 millimetri. Per creare la seconda configurazione, posizionare due fogli filtranti a emissione gialla nella sezione sotto l’obiettivo.

Per creare la prima configurazione, posizionare lo specchio dicroico nella sezione diagonale vicino al centro della carcassa osservando l’orientamento del filtro specificato dal produttore. Per creare la seconda configurazione, posizionare lo splitter del fascio nella sezione diagonale. Posizionare una seconda lente di lunghezza focale di 20 millimetri nella sezione sotto lo specchio dicroico o lo splitter del fascio a seconda della configurazione, con il lato convesso rivolto verso la parte superiore del dispositivo.

Per creare la prima configurazione, posizionare il filtro di eccitazione nella sezione a destra dello specchio dicroico, assicurandosi che la freccia punti verso lo specchio dicroico. Per creare la seconda configurazione, posizionare un foglio di filtro di eccitazione blu nella sezione a destra dello splitter del fascio. Posizionare l’obiettivo di lunghezza focale di 15 millimetri a destra del filtro di eccitazione con il lato convesso rivolto verso lo specchio dicroico.

E posizionare un LED nella sezione rimanente della stampa con il LED rivolto verso lo specchio dicroico o lo splitter del fascio, a seconda della configurazione. Assicurarsi che i due fili che conducono dal LED siano inseriti nei canali di incasso in modo che la stampa si conchichi saldamente. E ripetere la configurazione per l’altro lato della parte di stampa 3D.

Quindi posizionare le porzioni estruse della metà superiore della carcassa nelle scanalature incassate della metà inferiore della carcassa per chiudere il lato vuoto del pezzo con i componenti ottici. E fissare le parti insieme a viti lunghe 4-40 da 3/8 pollici. Per assemblare l’elettronica e il touch screen, collegare le due mini breadboard e posizionare il microcontrollore in una delle breadboard, assicurando che la porta micro-USB del microcontroller sia rivolta verso l’esterno.

Per collegare la modulazione LED, collegare il pin CTL del led+driver a un pin digitale del microcontroller. E il pin LED del driver LED a un pin GND del microcontroller. Rimuovere i coperchi di plastica sul retro delle breadboard e premere il supporto adesivo dei pannelli della parte stampata in 3D per attaccare le breadboard combinate all’interno della parte posteriore del pezzo stampato STL del supporto dello schermo LCD.

Fissare il portasci lcd con le breadboard assemblate all’interno dell’involucro ottico con viti lunghe 4-40 pollici. Per collegare l’alimentatore a LED, collegare il pin LED positivo del driver LED al filo positivo del primo LED. E collegare il filo negativo del primo LED al filo positivo del secondo LED sulla breadboard.

Collegare il filo negativo del secondo LED al pin LED del driver LED. Per collegare l’alimentatore a LED, utilizzare un jack a canna all’adattatore a 2 pin per collegare i fili positivi e negativi dell’alimentatore da 10 volt rispettivamente ai pin VIN+ e VIN del driver LED. Per collegare l’alimentatore della scheda di prova del sensore e il trasferimento dei dati, utilizzare un cavo jumper da femmina a maschio a 4 pin per collegare i pin SCK, SDA, VDUT e GND sulle schede di prova del sensore da luce a digitale alla mini breadboard attraverso lo spazio nella parte superiore destra della stampa del supporto LCD.

Sul breadboard, verificare che il pin da 3,3 volt del microcontrollore e il pin VDUT di entrambe le schede di prova, il pin GND del microcontroller e il pin GND di entrambe le schede di prova, il 4 pin analogico del microcontrollore e il pin SDA di entrambe le schede di prova e il pin analogico a 5 pin del microcontrollore e il pin SCK di entrambe le schede di prova sono tutti collegati. Utilizzare quattro viti M2.5 per fissare il computer a scheda singola sul supporto dello schermo LCD, con le porte HDMI e dell’adattatore di alimentazione del computer a scheda singola rivolto verso l’alto e il computer a scheda singola centrato sulla parte stampata in 3D. Quindi collegare il display touch screen al computer a scheda singola in base alle istruzioni del touchscreen.

E collegare la porta HDMI del computer a scheda singola alla porta HDMI del touch screen. Per registrare i dati di fluorescenza in tempo reale, dopo che il blocco termico è stato acceso e ha raggiunto la temperatura appropriata, alimentare il computer a scheda singola e utilizzare un cavo micro-USB-USB per collegare il computer a scheda singola al microcontroller. Apri lo script Python fornito sul touch screen e modifica il tempo di misurazione.

Modificare il percorso del file di output della variabile in base al nome del file di dati generato dal programma. E modificare le variabili porta seriale in base ai valori desiderati. Posizionare due tubi PCR contenenti le reazioni da monitorare nel blocco termico.

E posizionare il fluorimetro sul blocco termico con i tubi PCR ici direttamente tra i quattro pioli che estrudeno da ogni canale ottico. Dopo aver confermato che il fluorimetro stampato in 3D è collegato, collegare l’adattatore di alimentazione per i LED e avviare il programma Python. Sullo schermo LCD apparirà un’interfaccia utente grafica per misurare la fluorescenza in tempo reale in entrambi i tubi PCR.

Al termine dell’esperimento, visualizzare le misure e i file di dati di output salvati nel percorso definito dall’utente. Una volta assemblato, le prestazioni del fluorimetro possono essere convalidate misurando la fluorescenza da una serie di diluizione di colorante FITC. In questa analisi rappresentativa, entrambi i canali del fluorimetro mostravano una risposta lineare attraverso l’intervallo desiderato.

Qui sono mostrate la fluorescenza sottratta al basale dell’amplificazione della ricombinasi polimerasi positiva e le reazioni di controllo negative di un kit commerciale standard misurate sulla seconda configurazione del fluometro. Le misurazioni in tempo reale della fluorescenza di una reazione di amplificazione isotermica mediata da loop di trascrizione inversa personalizzata per l’RNA SARS-COVID-2 sulla prima configurazione del fluorimetro mostrano che l’amplificazione si verifica come previsto su una gamma clinicamente rilevante di numeri di copia dell’RNA. In un momento in cui le catene di approvvigionamento globali sono molto stressate, pezzi di equipaggiamento open source come questo fluorimetro possono aiutarci a ridurre alcune delle disuguaglianze sanitarie associate alla pandemia.