Isolamento e imaging time-lapse di cellule mesenchimiche palatali embrionali di topo primarie per analizzare gli attributi del movimento collettivo

Questo protocollo consente agli sperimentatori nel campo craniofacciale di confrontare quantitativamente gli attributi di movimento collettivo nelle cellule di controllo e mutanti come mezzo per comprendere il rimodellamento mesenchimale durante l'elevazione della mensola palatale. L'uso di cellule mesenchimali palatali embrionali embrionali primarie di topo e l'imaging time-lapse forniscono un metodo proxy accessibile per valutare le dinamiche di elevazione della mensola palatale. Per raccogliere gusci palatali da un embrione di topo, utilizzare un cucchiaio perforato sterilizzato per posizionare un embrione embrionale di giorno 13,5 in un piatto sterile di 10 centimetri riempito con un terreno di coltura MEPM sterile sotto uno stereomicroscopio.

Dopo la decapitazione, inserire una punta di una pinna n. 5 sterilizzata nella bocca appena dentro la guancia e spingere la punta della pinna fino a quando non esce dalla parte posteriore del cranio. Orientare la pinzetto in modo che l'altro braccio si libra appena sopra il condotto uditivo prima di pizzicare la pinzetto chiusa per tagliare il tessuto. Ripeti l'incisione sull'altro lato della testa, continuando la procedura di taglio a pizzico fino a quando la mascella inferiore, la lingua e la parte inferiore del cranio sono state rimosse, esponendo i ripiani palatali.

Con la testa posta su un fianco, posiziona le punte di un paio di piccole forbici sterili in acciaio inossidabile davanti e dietro il cranio quasi all'altezza degli occhi dell'embrione e taglia appena sopra gli occhi per rimuovere il cranio del cranio, creando una superficie piana. Quindi, posizionare la testa a testa in giù con l'aspetto superiore appoggiato piatto sul fondo del piatto e posizionare i ripiani palatali, che dovrebbero essere visibili come due ponti rialzati su entrambi i lati della scanalatura centrale nella metà anteriore della testa. Per fissare la testa al piatto, inserire una punta di una pinna fine attraverso il tessuto vicino alla regione nasale della testa anteriore ai ripiani palatali e l'altra attraverso la base del cranio posteriore ai ripiani palatali.

Inserire entrambi i punti di una seconda coppia di pinci molto affilati e fini nel tessuto alla base della superficie laterale del ripiano e pizzicare lentamente e con attenzione per tagliare il tessuto. Ripetere l'incisione lungo la base della superficie mediale del ripiano e sia alle estremità anteriore che posteriore del ripiano per staccare il ripiano dal suo attacco alla testa, quindi sollevare delicatamente il ripiano, facendo ulteriori pizzichi se necessario per liberare completamente il guscio dal tessuto circostante. Quando il secondo ripiano palatale è stato rimosso nello stesso modo, utilizzare una pipetta di trasferimento di bulbi di plastica sterile per trasferire i ripiani in un tubo microcentrifuga sterile da 1,5 millilitri in circa 500 microlitri di PBS su ghiaccio.

Per impostare una coltura cellulare MEPM, quando tutti i ripiani sono stati raccolti, aspirare il PBS senza disturbare i tessuti e aggiungere immediatamente 200 microlitri di 37 gradi Celsius 0,25% tripsina a ciascun tubo di tessuto palatale. Utilizzare una pipetta da 1.000 microlitri per pipettare brevemente i tessuti alcune volte e incubare i tessuti per 10 minuti a 37 gradi Celsius, pipettando brevemente dopo cinque minuti. Alla fine dell'incubazione, pipettare nuovamente i tessuti prima di aggiungere 800 microlitri di terreno di coltura MEPM a ciascun tubo e centrifugare i tubi per raccogliere le cellule.

Dopo aver aspirato il surnatante, risuscidere i pellet in un millilitro di terreno di coltura MEPM fresco per tubo e placcare le cellule in singoli pozzetti di una piastra trattata con coltura di tessuto a sei pozzi contenente due millilitri per pozzetto per un totale finale di tre millilitri per pozzetto, quindi consentire alle cellule di aderire alla superficie plastica per 12 ore in un incubatore di colture cellulari sterile. Per impostare un test di migrazione collettiva 2D, rimuovere la parte superiore di un inserto sterile in silicone a due pozzetti ad un'altezza di circa un millimetro per ciascun campione da analizzare e utilizzare una pinica sterile per placcare gli inserti a due pozzetti sterili accorciati nel centro dei singoli pozzetti di una piastra a sei pozzetti. Premere verso il basso lungo tutti i bordi per assicurarsi che gli inserti siano completamente aderenti ai fondi del pozzo e seminare 300 celle MEPM per millimetro quadrato degli inserti in silicone accorciati in un volume totale da 40 a 50 microlitri di terreno di coltura MEPM in ciascun inserto per un'incubazione notturna nell'incubatore di colture cellulari.

Per impostare un test di riparazione della ferita, utilizzare una pinna sterile per posizionare un inserto sterile in silicone a due pozzetti non modificato al centro di un pozzetto di una piastra a sei pozzetti per campione e premere saldamente i bordi dell'inserto per fissare l'inserto alla piastra di coltura. Quindi seminare 1.400 cellule per millimetro quadrato in 100 microlitri di terreno di coltura MEPM in ciascun inserto e incubare le cellule per 48 ore nel terreno di coltura cellulare. Quando si esegue un test di migrazione collettiva 2D, la semina delle cellule in inserti in silicone a due pozzetti in un grande piatto di coltura fornisce in genere una migliore densità cellulare per l'imaging.

Piccoli anelli stampati in 3D collocati in una parabola da 35 millimetri possono essere utilizzati anche per l'analisi della motilità 2D. Per i saggi di riparazione delle ferite, le cellule vengono coltivate in inserti in silicone a due pozzi fino a confluenza elevata. Gli inserti vengono quindi rimossi e la ferita viene ripresa fino alla chiusura.

Le traiettorie MEPM sono persistenti e la direzione della motilità cellulare viene mantenuta per diverse ore. L'analisi dello spostamento medio rispetto al tempo indica che la persistenza sotto forma di spostamento è proporzionale al tempo trascorso. L'analisi del flusso dei dati di motilità rivela che i cluster di cellule MEPM in co-movimento hanno una dimensione di circa 300 micron.

Si osserva anche una profonda differenza di motilità tra cellule MEPM wild type e mutanti. Questa procedura potrebbe essere utilizzata su varie linee di topo transgenico e per trattare le cellule MEPM con vari reagenti biochimici per studiare i loro effetti sul movimento cellulare. Ci siamo concentrati sulle cellule mesenchimali palatali primarie, ma l'imaging time-lapse e le analisi quantitative possono anche essere utilizzate per esplorare gli attributi di migrazione di qualsiasi tipo di cellula mobile nei processi di sviluppo dinamico.