Preparazione rapida della griglia per la microscopia crioeletletnica risolta nel tempo

Ciao, e benvenuto in questo video di JoVE. Vogliamo presentarvi la configurazione che abbiamo qui per la creazione rapida della griglia, uno studio risolto nel tempo che stiamo sviluppando a Leeds. Tieni presente che questo non è un sistema standard, ma speriamo che dandoti un resoconto dettagliato di tutte le cose e dei parametri che facciamo, sarai in grado di sviluppare sistemi simili nei tuoi laboratori.

Una descrizione dettagliata del dispositivo è fornita nel protocollo Richmond. Qui, forniremo una guida passo-passo per la preparazione rapida della griglia e l'EM risolta nel tempo. Nella nostra esperienza, la concentrazione di proteine dovrebbe essere di due milligrammi per millilitro o superiore. Il protocollo richiede un volume minimo di circa 50 microlitri.

Accendi il dispositivo. Quindi accendere il PC di controllo e avviare il software di controllo. Inizializzare tutte le pompe a siringa premendo il pulsante di inizializzazione su ciascuna pompa a siringa.

Accendere l'alimentatore del potenziometro, impostarlo su nove volt e avviare il software di controllo dell'oscilloscopio. Il gas azoto pressurizzato è necessario per generare lo spray. Aprire il cilindro di azoto e impostare la pressione su 2 bar.

Assicurarsi che tutte le valvole della pompa a siringa siano in posizione di carico. Per fare ciò, commutare tutte le valvole per erogare nel software di controllo e quindi tornare a caricare. Impostare tutte le siringhe a zero.

Eventuali bolle d'aria presenti nel sistema devono essere rimosse in questa fase. Per fare ciò le siringhe potrebbero dover essere svitate, le bolle rimosse manualmente e le siringhe montate di nuovo quando non contengono più bolle. Il sistema di gestione dei liquidi viene solitamente immagazzinato in acqua.

Prima di caricare il campione, il sistema viene bilanciato con il buffer. Questo viene fatto lavando il tubo con un eccesso di buffer. Posizionare un tubo contenente almeno 200 microlitri di tampone su una siringa.

La parte superiore del tubo deve essere forata per fissarlo. Aspirare una quantità adeguata di tampone, tra 50 e un centinaio di microlitri con siringa uno utilizzando il software di controllo. Interruttore valvola uno per erogare.

Erogare tutto il liquido in una siringa uno. Riportare la valvola uno alla posizione di carico e premere il pulsante di inizializzazione sulla siringa uno per preparare il sistema per il ciclo di lavaggio successivo. Questi passaggi vengono solitamente ripetuti tre volte per garantire un lavaggio accurato del tubo.

Successivamente, viene posizionato l'ugello di spruzzatura. Posizionare una griglia EM nel braccio di immersione. Posizionare la griglia davanti all'ugello di spruzzatura.

Erogare il buffer utilizzando il software di controllo. Se l'ugello e la griglia sono allineati, il liquido dovrebbe accumularsi dopo la spruzzatura per un lungo periodo di tempo. Se necessario, regolare la posizione dell'ugello e quindi controllare nuovamente dove il liquido si accumula sulla griglia.

Quindi, regolare la posizione della tazza di etano. La punta delle pinzette dovrebbe raggiungere approssimativamente il centro della tazza di etano. Eseguire un'esecuzione di test per assicurarsi che tutte le impostazioni siano corrette.

Chiudere la camera di umidità. Assicurarsi che il percorso dello stantuffo sia chiaro. Aspirare il volume di tampone necessario per una singola corsa in una siringa.

Interruttore valvola uno per erogare. Avviare la corsa premendo run'in nel software di controllo. Controllare che la pompa della siringa uno si muova, due secondi in questo caso, e che la griglia sia immersa dopo un ritardo appropriato, 1,5 secondi qui.

Al termine della corsa, impostare la pressione sul braccio dello stantuffo sul valore desiderato. Premere OK'in nel software di controllo per rilasciare la pressione dal braccio di immersione. Ora la tazza di etano è fresca e piena di etano liquido.

Glow-scarica le griglie prima dell'uso. Una tipica scarica di bagliore è di 90 secondi a 10 milliampere in 0,1 millibar di aria. Il tubo viene quindi bilanciato con il campione.

Se il volume del campione disponibile è basso, il tubo può essere bilanciato con un solo volume morto. Aspirare il campione. In genere il volume morto è di circa 30 microlitri.

Interruttore valvola uno per erogare. Erogare il campione attraverso tubi e ugelli. Quindi aspirare la quantità di campione necessaria per una singola esecuzione.

Interruttore valvola uno per erogare. Verificare che l'umidità relativa abbia raggiunto il valore desiderato. In genere prepariamo le griglie al 60% o superiore.

Questa lattina può richiedere alcuni minuti. Posizionare le pinzette tenendo una griglia a scarica luminosa nel braccio di immersione. Posizionare la slitta del potenziometro nella posizione di partenza, pronta per la misurazione della velocità.

Impostare il trigger per la misurazione della velocità nel software dell'oscilloscopio. Posizionare la tazza di etano liquido e vicino alla camera di umidità. Assicurarsi che il percorso dello stantuffo sia chiaro.

Avviare l'esecuzione nel software di controllo. Al termine della corsa, premere OK'in nel software di controllo per rilasciare la pressione dal braccio di immersione. Aprire la camera di umidità, allentare la connessione tra braccio tuffante e pinzette.

Spostare verso l'alto il braccio di immersione mantenendo la griglia in etano liquido. Quindi trasferire le griglie all'azoto liquido e allo stoccaggio. Salvare la misurazione dell'oscilloscopio.

Reimpostare manualmente la posizione del cursore del potenziometro e dello stantuffo. Ripetere il protocollo per preparare le griglie di replica. Gli esperimenti risolti nel tempo vengono eseguiti in modo simile.

Sono necessarie concentrazioni di stock più elevate per gli esperimenti risolti nel tempo a causa della diluizione nella fase di miscelazione. Per un esperimento risolto nel tempo, utilizzare tutte e tre le siringhe. Il tubo è fissato alle pompe a siringa e all'ugello di spruzzatura.

L'ugello di spruzzatura microfluidica utilizzato qui contiene anche un elemento di miscelazione. Si noti che i tubi più lunghi daranno un volume morto maggiore e le fasi di bilanciamento del lavaggio richiedono più tampone e campione. Equilibrare tutte le siringhe con tampone e campione separatamente.

Tipicamente, la siringa uno viene utilizzata per il campione A e le siringhe due e tre vengono utilizzate per il campione B'Dopo che il tubo è stato equilibrato, caricare il campione A nella siringa uno e il campione B nelle siringhe due e tre. Quindi, passare le valvole da una a tre per erogare. Avviare l'esecuzione nel software di controllo.

Si noti che è necessario uno script di esecuzione diverso per un esperimento risolto nel tempo. Ritardi diversi possono essere raggiunti in due modi. Regolando la velocità dello stantuffo, è possibile modificare il ritardo temporale dalla miscelazione al congelamento.

Una maggiore velocità di immersione porterà a un ritardo temporale più breve. In alternativa, la distanza dell'etano di spruzzatura viene modificata regolando la posizione verticale dell'ugello di spruzzatura. L'aumento della distanza comporterà un ritardo temporale più lungo.

Nel microscopio elettronico a basso ingrandimento, una griglia tipica assomiglia a questa. Le aree di ghiaccio sottile, come indicato, sono adatte per l'acquisizione dei dati. A ingrandimenti più elevati, le particelle dovrebbero essere chiaramente visibili.

Con un campione di prova come l'apoferrittina, un set di dati relativamente piccolo da una singola griglia è sufficiente per una ricostruzione con una risoluzione di tre o quattro angstrom. Per gli esperimenti risolti nel tempo, raccogliamo set di dati da diversi punti temporali o griglie. È utile combinare i dati per la classificazione 3D e quindi tracciare le particelle fino ai loro punti temporali.

In questo modo i dati possono fornire informazioni strutturali e informazioni sulla cinetica di reazione. In conclusione, speriamo che il video ti sia piaciuto. Speriamo che con le descrizioni dettagliate nel documento JoVE insieme al video, sarai in grado di condurre i tuoi esperimenti tramite la creazione rapida della griglia, che ha dimostrato di alleviare alcuni dei problemi derivanti dalla mutazione o di aiutare con le interazioni all'interfaccia aria-acqua, tutto ciò di cui hai bisogno per condurre i tuoi studi risolti nel tempo per cercare di intrappolare alcuni di quegli stati di non equilibrio.

Quindi, felice creazione della griglia.