Gonfiaggio dell'aria dei polmoni murini con perfusione-fissazione vascolare

Questo è un metodo economico che combina i vantaggi del gonfiaggio dell'aria e della fissazione della perfusione vascolare per preservare i polmoni per analisi strutturali e funzionali. Il principale vantaggio di questa tecnica è la conservazione sia della morfologia cellulare che della posizione all'interno degli spazi aerei del polmone. Prestare attenzione quando si posiziona l'adattatore per l'esca nella trachea e l'ago di perfusione nel ventricolo destro per garantire un gonfiaggio e una fissazione adeguati.

Per impostare l'apparato di gonfiaggio dell'aria, posizionare una siringa per la colonna d'acqua in un supporto ad anello e misurare un'altezza verticale di 25 centimetri dalla piattaforma animale a 25 centimetri sulla colonna d'acqua. Fissare all'estremità del tubo della colonna d'acqua al rubinetto sulla camera d'aria e collegare un tubo dall'esca femmina della camera d'aria al rubinetto sul contenitore di lavorazione degli animali. Verificare che il tappo della camera d'aria e il rubinetto all'esterno del contenitore per la lavorazione degli animali siano chiusi e che il rubinetto sul tubo che porta dalla colonna d'acqua alla camera di gonfiaggio dell'aria sia aperto.

Quindi riempire la siringa con acqua fino al segno di 25 centimetri. L'acqua scorrerà attraverso la siringa e il tubo nella camera d'aria. Una volta equalizzata la pressione, l'acqua smetterà di scorrere.

Per preparare i polmoni all'inflazione fare un'incisione laterale nella parete addominale sotto la gabbia toracica del topo eutanasizzato e una seconda incisione laterale della parete addominale sopra i fianchi. Tagliare lungo la linea mediana dall'incisione interna verso l'incisione superiore e usare forbici smussate per praticare con cura un'incisione nel lato laterale del diaframma. I polmoni dovrebbero collassare non appena il diaframma viene perforato.

Tagliare trasversalmente lungo il diaframma per aprire la cavità toracica e tagliare superiormente lungo lo sterno dal processo xifoide alla tacca del giocoliere, e lateralmente sopra la gabbia toracica per esporre completamente il cuore e i polmoni. Fissare i lati della gabbia toracica e fare un'incisione della linea mediana nel collo, sopra la trachea. Rimuovere la pelle, il muscolo, la ghiandola tiroidea e il tessuto connettivo che circonda la trachea e utilizzare una pinna curva per far scorrere due pezzi di sutura sotto la trachea posteriore.

Utilizzare un pezzo di sutura per tenere in posizione l'adattatore per l'esca di gonfiaggio e utilizzare un ago da 18 gauge per un pollice per fare un piccolo foro nella trachea. Inserire un adattatore per esca calibro 20 nel foro e legare la sutura attorno alla trachea immediatamente distale nel punto in cui l'adottante dello stub dell'esca entra nel foro. Quindi trasferire l'animale nel contenitore di lavorazione degli animali e collegare l'adattatore per stub dell'esca all'esca femminile all'interno del contenitore di lavorazione degli animali.

Per gonfiare i polmoni, posizionare l'ago da 25 gauge per 5/8 di pollice attaccato al tubo dell'apparato di perfusione nel ventricolo destro del cuore e tagliare l'aorta addominale per consentire al sangue di defluire dal cuore e per promuovere il flusso di perfusare attraverso i polmoni. Aprire il rubinetto all'esterno del contenitore di lavorazione degli animali e gonfiare i polmoni a 25 centimetri di acqua per cinque minuti, facendo attenzione che il livello dell'acqua nella siringa non diminuisca troppo rapidamente. Durante l'ultimo minuto di gonfiaggio polmonare, accendere la pompa peristaltica a una portata di 10 millilitri al minuto.

La soluzione di eparina dovrebbe fluire dalla bottiglia attraverso il tubo nell'animale. Dopo aver gonfiato i polmoni per cinque minuti, spegnere la pompa e passare il perfusato dall'eparina al fissativo. Abbassare la siringa a colonna d'acqua a 20 centimetri.

È normale che le bolle d'aria si muova all'interno della colonna d'acqua al cambio di pressione. Controllare il livello dell'acqua nella siringa. Dovrebbe essere al segno di 25 centimetri.

Quindi attendere un minuto per consentire ai polmoni di sgonfiarsi da 25 a 20 centimetri di pressione dell'acqua prima di riavviare la pompa a una portata di 6,5 millilitro al minuto per 10-15 minuti, perfusione fissativa vascolare. Per l'estrazione del tessuto polmonare gonfiato e fisso, legare strettamente il secondo pezzo di filo attorno alla trachea, distale all'adattatore per stub esca e rimuovere l'adattatore per stub esca dalla trachea. Rimuovere l'ago dal cuore e utilizzare forbici smussate per tagliare il tessuto connettivo, posteriore al mediastino, per liberare i polmoni e il cuore dalla cavità toracica avendo cura di evitare di perforare i polmoni.

Rimuovere con attenzione il cuore dai polmoni e posizionare i polmoni in 20-25 millilitri di fissativo in un tubo conico da 50 millilitri. Tirare la sutura che tiene la trachea attraverso l'apertura nel tubo conico e fissare la sutura con i fili del cappuccio. Quindi invertire il tubo per garantire che i polmoni galleggianti e gonfiati ad aria rimangano completamente immersi in fissativo ed elaborino i polmoni per studi istologici secondo protocolli standard.

Quando il diaframma viene inserito durante la dissezione, l'integrità dello spazio pleurico sarà abolita e i polmoni dovrebbero collassare. Dopo l'applicazione di 25 centimetri di pressione dell'acqua, l'aria entrerà nei polmoni attraverso la trachea e l'inflazione dovrebbe essere facilmente osservata. Una volta che i polmoni si sono completamente espansi, la pressione di gonfiaggio può essere ridotta a 20 centimetri per mantenere i polmoni gonfiati senza sovradistensione.

I polmoni devono rimanere gonfiati dopo la legatura tracheale e la rimozione dal torace. La deflazione può verificarsi se i polmoni vengono perforati durante la preparazione dell'animale o l'estrazione polmonare. L'analisi istologica delle sezioni polmonari gonfiate rivela che pochissime cellule immunitarie sono presenti nel lume delle vie aeree dei tessuti fissati utilizzando il tradizionale gonfiaggio a base liquida.

Al contrario, le cellule infiammatorie sono conservate all'interno degli spazi aerei dei tessuti fissati tramite perfusione vascolare con gonfiaggio dell'aria. Dopo l'inflazione dell'aria con fissazione della profusione, il tessuto polmonare può essere incorporato nella formalina per il sezionamento del tessuto e la successiva analisi tramite tecniche istologiche, tra cui colorazione, immunoistochimica e imaging immunofluorescente.