Immunofluorescenza a doppia marcatura utilizzando anticorpi della stessa specie per studiare le interazioni ospite-patogeno
10 luglio 2021
Qui, il protocollo descrive come eseguire l'immunofluorescenza a doppia marcatura utilizzando anticorpi primari allevati nella stessa specie per studiare le interazioni ospite-patogeno. Inoltre, può includere il terzo anticorpo di un ospite diverso in questo protocollo. Questo approccio può essere fatto in qualsiasi tipo di cellula e agenti patogeni.
In questo protocollo, due anticorpi dello stesso ospite possono essere utilizzati insieme nel test di immunofluorescenza per studiare le interazioni tra cellule ospiti e patogeni. Poiché ci sono solo pochi anticorpi commerciali disponibili per riconoscere specifiche strutture cellulari e proteine nei parassiti, questo protocollo può essere molto utile. Si tratta di un protocollo di immunofluorescenza a doppia marcatura facile da eseguire che utilizza anticorpi policlonali e monoclonali allevati nella stessa specie.
Molti ricercatori potrebbero non essere consapevoli del fatto che questo è possibile. Questo approccio aiuta quando la fonte di anticorpi è limitata. Può essere utilizzato per rilevare gli agenti patogeni nelle proteine delle cellule ospiti nelle cellule ospiti infette e può anche essere applicato agli organismi viventi liberi.
Questo è un protocollo semplice, richiede un passaggio di blocco tra la prima e la seconda coppia di anticorpi. La procedura sarà dimostrata dalla dott.ssa Camila Gachet-Castro e dal dottorando Lays Trajano-Silva del mio laboratorio. Tre giorni dopo aver infettato le cellule LLC-MK2 con Trypanosoma cruzi, raccogliere il surnatante dalle cellule infette in un tubo conico di coltura cellulare da 15 millilitri.
Centrifugare il campione per abbassare i detriti cellulari, quindi posizionare il tubo a temperatura ambiente per consentire ai tripomastitonoti di nuotare verso il surnatante. Dopo 10 minuti, raccogliere il surnatante in un nuovo tubo conico, quindi centrifugare il campione e scartare il surnatante prima di rispendere il pellet contenente i parassiti in mezzo RPMI completo. Aggiungere le celle LLC-MK2 in piastre a 24 pozzetti contenenti coverslip arrotondati sterilizzati UV e lasciare che l&m si depositi per 16 ore.
Quindi, per infettare le cellule, aggiungere il surnatante contenente T.Cruzi a ciascun pozzetto e incubare per sei ore. Quindi, lavare le coperture contenenti le cellule infette e non infette cinque volte con PBS, quindi fissare le cellule con il 2% di paraformaldeide in PBS. Dopo 10 minuti, lavare le coverslip tre volte per cinque minuti ciascuna con PBS e quindi permeabilizzare le coverslips con detergente non ionico per 10 minuti.
Dopo tre lavaggi PBS di cinque minuti, incubare i coverslip in soluzione bloccante per 30 minuti, seguiti da un'altra incubazione di 30 minuti con un anticorpo monoclonale o policlonale di topo. Dopo i lavaggi PBS, incubare i coverslip per 30 minuti con anticorpi secondari in soluzione bloccante e falloidina per colorare i filamenti di actina nella cellula ospite. Quindi lavare nuovamente i coverslip con PBS tre volte prima di applicare una piccola quantità di reagente di montaggio anti-dissolvenza con mezzo DAPI sulla superficie del vetrino.
Usando la pinza, inclinare delicatamente il coperchio nel mezzo per prevenire la formazione di bolle. Per la doppia marcatura, dopo aver incubato i coverslip in soluzione bloccante come dimostrato in precedenza, incubarli nell'anticorpo policlonale del topo per 30 minuti. Quindi, lavare i coverslip tre volte per cinque minuti ciascuno con PBS prima di incubarli con l'anticorpo secondario per 30 minuti.
Quindi, dopo tre lavaggi PBS, eseguire una seconda fase di blocco con IgG anti-topo di coniglio AffiniPure diluito in soluzione bloccante. Dopo 30 minuti, lavare nuovamente le coperture con PBS prima di incubarle con l'anticorpo monoclonale del topo per altri 30 minuti. Successivamente, dopo tre lavaggi PBS, incubare i coverslip con anticorpo IgG 2B anti-topo di capra e falloidina.
Quindi, dopo tre lavaggi PBS, applicare il reagente di montaggio anti-dissolvenza come dimostrato in precedenza. Per la tripla etichettatura, dopo aver bloccato i coverslip e incubato con l'anticorpo policlonale di topo, seguito dall'anticorpo anti-topo di capra, iniziare una nuova incubazione con anticorpo policlonale di coniglio in soluzione bloccante per 30 minuti. Quindi, dopo tre lavaggi PBS, incubare i coverslip con anticorpi anti-coniglio di capra per 30 minuti.
Successivamente, dopo tre lavaggi PBS, eseguire una fase di blocco con l'anticorpo anti-topo del coniglio AffiniPure diluito in soluzione bloccante per 30 minuti. Quindi lavare nuovamente i coverslip prima di incubare con qualsiasi anticorpo monoclonale di topo della sottoclasse IgG per 30 minuti. Dopo tre lavaggi PBS, incubare i coverslip per 30 minuti con una coppia specifica di anticorpi anti-topo della sottoclasse IgG di capra.
Dopo l'incubazione, lavare le coperture tre volte per cinque minuti ciascuna con PBS. Analizzare i campioni immunofluorescenti utilizzando un microscopio confocale con un obiettivo di immersione in olio 63X e rilevare la fluorescenza con un tubo fotomoltiplicatore e un rilevatore ibrido. Quindi acquisire tutte le immagini confocali con canali separati ed eseguire l'elaborazione delle immagini utilizzando Adobe Photoshop.
Queste immagini al microscopio confocale mostrano i risultati con gli esperimenti di controllo di cellule infette e non infette evidenziando la specificità degli anticorpi nella cellula ospite e nel parassita interiorizzato. L'anticorpo policlonale di topo anti-Trypanosoma cruzi FAZ ha riconosciuto la proteina gigante T.cruzi nella zona di attacco del flagello al flagello del parassita, ma non nella cellula ospite. La distribuzione della ribonucleoproteina nucleare eterogenea A1 nei nuclei è stata osservata utilizzando un anticorpo monoclonale di topo commerciale che riconosce solo le cellule di mammifero ospiti, ma non il parassita.
Inoltre, i nuclei dell'ospite e del parassita e i cinetoplasti del parassita sono stati colorati con DAPI e la F-actina dell'ospite è stata colorata con falloidina coniugata ad Alexa 594, confermando la specificità degli anticorpi. L'immunofluorescenza a doppia etichettatura mostra le distribuzioni proteiche nell'ospite e nel parassita analizzate al microscopio confocale. L'etichettatura non ha suggerito alcuna reazione incrociata tra anticorpi utilizzando questa metodologia.
In sintesi, il protocollo qui descritto per studiare le interazioni ospite-patogeno presenta una tecnica di base ed elaborata che può essere adattata a qualsiasi combinazione di anticorpi. Questo approccio rende l'immunofluorescenza economicamente vantaggiosa e può aiutare a studiare la localizzazione di due o più proteine di interesse quando sono disponibili pochi anticorpi.
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Panoramica
In questo articolo viene presentato un protocollo dettagliato per eseguire una marcatura doppia e tripla mediante immunofluorescenza, utilizzando anticorpi policlonali e monoclonali prodotti nella stessa specie. Il metodo è particolarmente utile per lo studio delle interazioni tra cellula ospite e patogeno, specialmente quando gli anticorpi commerciali sono limitati o non disponibili per specifiche proteine parassitarie. Il protocollo è illustrato utilizzando cellule LLC-MK2 infettate da Trypanosoma cruzi e fornisce strategie per prevenire la reattività incrociata tra gli anticorpi.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia cellulare
- Microscopia a immunofluorescenza
- Parassitologia
Sfondo
- Gli anticorpi commerciali per le proteine parassitarie sono scarsi, specialmente per i tripanosomatidi.
- Gli anticorpi policlonali sono spesso preparati in laboratorio, il che può complicare l'etichettatura multiplex quando gli anticorpi provengono dalla stessa specie.
- L'etichettatura doppia o tripla è essenziale per visualizzare più proteine o strutture all'interno dei sistemi ospite-patogeno.
- La prevenzione della reattività incrociata tra anticorpi della stessa specie rappresenta una sfida tecnica.
Scopo dello studio
- Dimostrare un protocollo che permette l'uso di due o più anticorpi provenienti dalla stessa specie ospite in saggi di immunofluorescenza.
- Facilitare lo studio delle interazioni ospite-patogeno quando le risorse anticorpali sono limitate.
- Fornire un metodo economico e adattabile per studi di localizzazione proteica in cellule infette.
Metodi Utilizzati
- Infezione di cellule LLC-MK2 con Trypanosoma cruzi e preparazione di campioni infetti.
- Incubazione sequenziale con anticorpi policlonali e monoclonali murini, separata da un passaggio critico di bloccaggio mediante AffiniPure IgG anti-topo da coniglio.
- Utilizzo di anticorpi secondari coniugati con fluorocromi diversi per etichettature distinte.
- Etichettatura tripla mediante introduzione di un terzo anticorpo proveniente da una specie diversa (ad esempio, coniglio), con opportuni anticorpi secondari e passaggi di bloccaggio.
- Colorazione dei nuclei con DAPI e dei filamenti di actina con phalloidina-Alexa 594.
- Microscopia confocale per l'acquisizione di immagini e l'analisi dei campioni marcati.
Risultati principali
- Il protocollo consente un'etichettatura doppia e tripla efficace senza reazioni incrociate tra anticorpi della stessa specie.
- È stata ottenuta una localizzazione specifica di proteine del parassita e dell'ospite: l'anticorpo anti-FAZ di T. cruzi ha marcato la zona di attacco del flagello del parassita, mentre l'anticorpo anti-hnRNP A1 ha marcato esclusivamente i nuclei delle cellule ospiti.
- La colorazione con DAPI e falloidina ha confermato la specificità e l'integrità dell'etichettatura.
- Le immagini al microscopio confocale hanno dimostrato una chiara distinzione tra le strutture dell'ospite e del parassita, confermando l'efficacia del metodo.
Conclusioni
- Questo protocollo consente un'etichettatura mediante immunofluorescenza flessibile e affidabile quando le fonti di anticorpi sono limitate.
- Il metodo è adattabile a diversi tipi cellulari e combinazioni di anticorpi.
- Fornisce una soluzione economicamente vantaggiosa per lo studio della localizzazione proteica nei sistemi ospite-patogeno.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale Direttiva
L'immunofluorescenza con doppia marcatura che utilizza anticorpi della stessa specie affronta un collo di bottiglia fondamentale nella ricerca ospite-patogeno, in cui la disponibilità di anticorpi commerciali è limitata, specialmente per i bersagli parassitari. Questo protocollo consente la localizzazione multiplex di proteine in cellule infette, supportando la riduzione del rischio meccanicistica e la validazione dei bersagli nelle fasi iniziali della scoperta. La sua adattabilità e convenienza economica lo rendono una risorsa preziosa per i team biofarmaceutici che lavorano con risorse di anticorpi rari o prodotti internamente.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Convalida del Target
- Permette l'analisi delle interazioni ospite-patogeno quando gli anticorpi commerciali sono scarsamente disponibili.
- Supporta la validazione funzionale delle proteine bersaglio consentendo la rilevazione simultanea di proteine dell'ospite e del patogeno.
- Facilita la riduzione del rischio meccanicistico chiarificando la localizzazione delle proteine in modelli di infezione complessi.
Sviluppo di screening e saggi
- Prepara sistemi biologici validati per flussi di lavoro di screening successivi, consentendo un'etichettatura multiplex.
- Migliora la riproducibilità e la standardizzazione dei saggi attraverso passaggi definiti di bloccaggio e rilevamento.
- Supporta output di imaging quantitativi affidabili per la valutazione di composti in modelli di infezione.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea a sistemi rilevanti per la malattia consentendo studi sul restringimento proteico in cellule ospiti infette.
- Garantisce continuità dalla scoperta alla validazione preclinica supportando combinazioni flessibili di anticorpi.
- Riduce il rischio biologico negli studi traslazionali in cui le risorse di anticorpi sono limitate.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo si inserisce nel percorso di scoperta, che va da studi meccanicistici iniziali alla validazione di modelli preclinici, in particolare nei casi in cui la disponibilità di anticorpi rappresenta un limite.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi nei sistemi ospite-patogeno.
- Screening: Fornisce prontezza per saggi riproducibili e multiplex per modelli di infezione.
- Analisi: Fornisce output di imaging quantitativi e separati per canale per l'analisi comparativa.
- Ricerca traslazionale: Permette l'allineamento dei biomarcatori e la continuità nei modelli di infezione rilevanti per la malattia.
- Riutilizzo aziendale: Offre un flusso di lavoro riutilizzabile adattabile a diversi tipi cellulari e fonti di anticorpi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica negli studi su ospite-patogeno.
- Valore operativo: Standardizza l'immunofluorescenza multiplex con risorse anticorpali limitate.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione consentendo una valida conferma dell'obiettivo in sistemi complessi.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione basata sulla gestione del rischio laddove i reagenti commerciali non sono disponibili.
Considerazioni relative all'implementazione
- Richiede competenze in immunofluorescenza e microscopia confocale.
- Necessita di accesso a infrastrutture di imaging di alta qualità e ad anticorpi secondari validati.
- Richiede passaggi rigorosi di bloccaggio e lavaggio per prevenire la cross-reattività.
- Adattabile a diversi tipi cellulari e modelli di infezione anche con fonti limitate di anticorpi.
- Dipende da una selezione accurata degli anticorpi e dalla compatibilità delle sottoclassi per la moltiplexazione.
Domande frequenti sul biopharma
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:21
Parasite Cultures
2:00
Control Immunofluorescence Protocol
3:23
Double Labeling Immunofluorescence ProtocolUsing Monoclonal and Polyclonal Antibodies Raised in the Same Host
4:18
Triple Labeling Immunofluorescence Protocol with the Addition of the Third Polyclonal Antibody from Different Host Species
5:16
Confocal Imaging Acquisition
5:39
Results: Host-pathogen Interactions Studies Using Double Labeling Immunofluorescence
6:51
Conclusion
