Microscopia multifotonica intravitale in tempo reale per visualizzare trattamenti a ultrasuoni e microbolle focalizzati per aumentare la permeabilità della barriera emato-encefalica

L'esposizione agli ultrasuoni in presenza di microbolle è emersa come un metodo efficace per aumentare transitoriamente e localmente la permeabilità della barriera emato-encefalica. Normalmente la barriera emato-encefalica impedisce la somministrazione di potenziali farmaci per diverse malattie del cervello. Dopo la sonicazione, le microbolle iniettate iniziano a oscillare e inducono tensione sulla parete del vaso, aprendo giunzioni strette e infine consentendo ai farmaci di attraversare la barriera emato-encefalica Nei modelli preclinici, l'effetto degli ultrasuoni e del trattamento con microbolle sono spesso studiati mediante risonanza magnetica potenziata dal contrasto o studiando lo stravaso di coloranti ex vivo.

Lo svantaggio di questo approccio è che la risposta in tempo reale durante e immediatamente dopo l'esposizione agli ultrasuoni non può essere acquisita. L'imaging multifotone intravitale del cervello offre l'opportunità di studiare questi effetti in tempo reale. Nel seguente video, presenteremo istruzioni graduali su come posizionare una finestra cranica in un mouse ed eseguire il trattamento con microbolle ad ultrasuoni utilizzando un trasduttore ad anello montato sul cranio.

Questa procedura consente la sonicazione simultanea e l'imaging multifotone in vivo. Per iniziare preparare i materiali necessari per la chirurgia della finestra cranica e i trattamenti a microbolle ad ultrasuoni. In questo video, mostriamo un intervento chirurgico acuto alla finestra cranica senza recupero.

Per la chirurgia della finestra cranica di recupero cronico, sono necessari strumenti e materiali sterilizzati, uno spazio chirurgico sterile e farmaci appropriati. Prima dell'intervento chirurgico somministrare anestesia e analgesia. Rimuovere la pelliccia sulla testa.

Posiziona l'animale in una cornice stereotassica. Inserire un catetere nella vena della coda per iniezioni di destrano e microbolle. Mantenere la temperatura interna dell'animale di 37 gradi utilizzando una fonte di calore.

Qui stiamo usando un guanto pieno di acqua tiepida. Per rimuovere il cuoio capelluto, sollevare la pelle tra gli occhi usando una pinza e tagliare lungo la sutura sagittale. Rimuovere il periostio che copre la superficie esterna del cranio con un batuffolo di cotone.

Successivamente segna la posizione desiderata della finestra cranica sul cranio e inizia a perforare lungo il contorno. Per evitare che il cranio si surriscaldi durante la perforazione, gocciolare soluzione salina sul cranio usando una siringa o applicare un pezzo di spugna chirurgica imbevuta di soluzione salina. Alternare tra perforazione e raffreddamento del cranio.

Controllare l'avanzamento della perforazione applicando una leggera pressione sull'isola ossea. Rimuovere l'isola ossea utilizzando un paio di pinze. Assicurarsi che il cervello sia mantenuto umido utilizzando un pezzo di spugna chirurgica che è stato presoaked in soluzione salina.

Per posizionare una finestra cranica, posizionare una goccia di soluzione salina su un lato di una copertura e manovrarla sopra il foro nel cranio. Stendere uno strato di colla attorno al perimetro del coverslip per attaccarlo al cranio. Una volta che la colla è completamente asciutta, depositare la soluzione di agarosio sulla finestra e posizionare il trasduttore sopra.

Applicare una pressione decisa in modo tale che ci sia un'agarosio minima tra il trasduttore e la finestra cranica. Quando l'agarosio si è raffreddato a una consistenza simile a Jell-O, tagliare via l'agarosio in eccesso dalle circonferenze del coperchio del trasduttore. Stendere uno strato di colla lungo le circonferenze del coperchio del trasduttore per farlo aderire al cranio.

Dopo che la colla si è completamente asciugata, posizionare l'animale sotto la lente obiettiva del microscopio. Assicurarsi che l'obiettivo non entri in collisione con il trasduttore o il coverslip. Selezionare un campo visivo nel microscopio multifotone.

Impostare una scansione di imaging della vascolarizzazione e iniziare la sonicazione. Per questo protocollo, utilizziamo un trasduttore ad anello che viene azionato a una frequenza di guida di 0,82 megahertz, cicli di 10 millisecondi indicizzati meccanicamente da 0,2 a 0,4 e frequenze di ripetizione degli impulsi tra uno e quattro Hertz. Le microbolle Sonovue vengono iniettate alla dose di un millilitro per chilogrammo.

I trattamenti a microbolle ad ultrasuoni di successo possono essere rilevati dallo stravaso del destrano fluorescente dallo spazio intravascolare a quello extravascolare, indicando un aumento della permeabilità BBB. Per valutare la cinetica della perdita di destrano come modello rappresentativo per la somministrazione di farmaci, l'intensità del segnale tra lo spazio intra ed extravascolare può essere valutata utilizzando strumenti come MATLAB. Per valutare i cambiamenti vascolari indotti dai trattamenti a microbolle ad ultrasuoni, il diametro del vaso di interesse può essere misurato prima, durante e dopo il trattamento con microbolle ad ultrasuoni.

L'analisi delle immagini può essere condotta utilizzando software come ImageJ, FIJI o strumenti di programmazione. Qui Imaris è stato utilizzato per la segmentazione e la classificazione dei vasi sanguigni. La microscopia multifotonica intravitale del cervello combinata con trasduttori ad anello fornisce un metodo per monitorare gli effetti indotti dal trattamento con microbolle ad ultrasuoni in tempo reale ad alta risoluzione spaziale e temporale.

È possibile ottenere dati quantitativi e qualitativi per studiare, ad esempio, la cinetica dello stravaso e i cambiamenti vascolari. Il metodo sperimentale qui presentato può essere applicato a diversi modelli di ricerca e a varie applicazioni ecografiche.