Name: Screening di tossicità negli organoidi retinici umani per la scoperta farmaceutica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Scopri un protocollo di screening farmaceutico basato su organoidi retinici umani maturi per valutare composti che prevengono la tossicità dei fotorecettori nella degenerazione retinica metabolica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Supportato dal Lowy Medical Research Institute. Vorremmo ringraziare la famiglia Lowy per il loro sostegno al progetto MacTel. Vorremmo ringraziare Mari Gantner, Mike Dorrell e Lea Scheppke per il loro contributo intellettuale e l'assistenza nella preparazione del manoscritto.

<ol><li>Waring, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analysis+of+the+attrition+of+drug+candidates+from+four+major+pharmaceutical+companies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies.</a> Nature Review Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).</li>
<li>Khalil, A. S., Jaenisch, R., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+tissues+and+strategies+to+overcome+challenges+in+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Engineered tissues and strategies to overcome challenges in drug development.</a> Advances in Drug Delivery Reviews. 158, 116-139 (2020).</li>
<li>Demetrius, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+mice+and+men.+When+it+comes+to+studying+ageing+and+the+means+to+slow+it+down%2C+mice+are+not+just+small+humans%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Of mice and men. When it comes to studying ageing and the means to slow it down, mice are not just small humans.</a> EMBO Reports. , 6 Spec No 39-44 (2005).</li>
<li>Lindsay, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyruvate+kinase+and+aspartate-glutamate+carrier+distributions+reveal+key+metabolic+links+between+neurons+and+glia+in+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Pyruvate kinase and aspartate-glutamate carrier distributions reveal key metabolic links between neurons and glia in retina.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 111 (43), 15579-15584 (2014).</li>
<li>Cowan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+types+of+the+human+retina+and+its+organoids+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution.</a> Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).</li>
<li>Kruczek, K., Swaroop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cell-derived+retinal+organoids+for+disease+modeling+and+development+of+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cell-derived retinal organoids for disease modeling and development of therapies.</a> Stem Cells. 38 (10), 1206-1215 (2020).</li>
<li>Sinha, D., Phillips, J., Phillips, M. J., Gamm, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mimicking+retinal+development+and+disease+with+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Mimicking retinal development and disease with human pluripotent stem cells.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (5), 1-9 (2016).</li>
<li>Gan, L., Cookson, M. R., Petrucelli, L., La Spada, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Converging+pathways+in+neurodegeneration%2C+from+genetics+to+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Converging pathways in neurodegeneration, from genetics to mechanisms.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1300-1309 (2018).</li>
<li>Aung, K. Z., Wickremasinghe, S. S., Makeyeva, G., Robman, L., Guymer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prevalence+estimates+of+macular+telangiectasia+type+2%3A+the+Melbourne+collaborative+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Retina%22%5BJournal%5D)">The prevalence estimates of macular telangiectasia type 2: the Melbourne collaborative cohort study.</a> Retina. 30 (3), 473-478 (2010).</li>
<li>Chew, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+ciliary+neurotrophic+factor+on+retinal+neurodegeneration+in+patients+with+macular+telangiectasia+type+2%3A+A+randomized+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Effect of ciliary neurotrophic factor on retinal neurodegeneration in patients with macular telangiectasia type 2: A randomized clinical trial.</a> Ophthalmology. 126 (4), 540-549 (2019).</li>
<li>Gass, J. D., Blodi, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Idiopathic+juxtafoveolar+retinal+telangiectasis.+Update+of+classification+and+follow-up+study%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Idiopathic juxtafoveolar retinal telangiectasis. Update of classification and follow-up study.</a> Ophthalmology. 100 (10), 1536-1546 (1993).</li>
<li>Klein, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prevalence+of+macular+telangiectasia+type+2+in+the+Beaver+Dam+eye+study%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">The prevalence of macular telangiectasia type 2 in the Beaver Dam eye study.</a> American Journal of Ophthalmology. 150 (1), 55-62 (2010).</li>
<li>Powner, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Muller%27s+cells+and+photoreceptors+in+macular+telangiectasia+type+2%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Loss of Muller's cells and photoreceptors in macular telangiectasia type 2.</a> Ophthalmology. 120 (11), 2344-2352 (2013).</li>
<li>Gantner, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serine+and+lipid+metabolism+in+macular+disease+and+peripheral+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Serine and lipid metabolism in macular disease and peripheral neuropathy.</a> New England Journal of Medicine. 381 (15), 1422-1433 (2019).</li>
<li>Scerri, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analyses+identify+common+variants+associated+with+macular+telangiectasia+type+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analyses identify common variants associated with macular telangiectasia type 2.</a> Nature Genetics. 49 (4), 559-567 (2017).</li>
<li>Alecu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+1-deoxysphingolipids+are+metabolized+by+a+cytochrome+P450-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic 1-deoxysphingolipids are metabolized by a cytochrome P450-dependent pathway.</a> Journal of Lipid Research. 58 (1), 60-71 (2017).</li>
<li>Othman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fenofibrate+lowers+atypical+sphingolipids+in+plasma+of+dyslipidemic+patients%3A+A+novel+approach+for+treating+diabetic+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Lipidology%22%5BJournal%5D)">Fenofibrate lowers atypical sphingolipids in plasma of dyslipidemic patients: A novel approach for treating diabetic neuropathy.</a> Journal of Clinical Lipidology. 9 (4), 568-575 (2015).</li>
<li>Ohlemacher, S. K., Iglesias, C. L., Sridhar, A., Gamm, D. M., Meyer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+highly+enriched+populations+of+optic+vesicle-like+retinal+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of highly enriched populations of optic vesicle-like retinal cells from human pluripotent stem cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 32, 1-20 (2015).</li>
<li>Zhong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+three-dimensional+retinal+tissue+with+functional+photoreceptors+from+human+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs.</a> Nature Communication. 5, 4047(2014).</li>
<li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).</li>
<li>Wahlin, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptor+outer+segment-like+structures+in+long-term+3D+retinas+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3D retinas from human pluripotent stem cells.</a> Science Reports. 7 (1), 766(2017).</li>
<li>Capowski, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducibility+and+staging+of+3D+human+retinal+organoids+across+multiple+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines.</a> Development. 146 (1), (2019).</li>
<li>Luo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+system+for+effective+derivation+of+three-dimensional+retinal+tissue+via+Wnt+signaling+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">An optimized system for effective derivation of three-dimensional retinal tissue via Wnt signaling regulation.</a> Stem Cells. 36 (11), 1709-1722 (2018).</li>
<li>Ovando-Roche, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+bioreactors+for+culturing+human+retinal+organoids+improves+photoreceptor+yields%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+Therapy%22%5BJournal%5D)">Use of bioreactors for culturing human retinal organoids improves photoreceptor yields.</a> Stem Cell Research Therapy. 9 (1), 156(2018).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse.

Variazioni del protocollo di differenziazione Dall'invenzione delle coppe ottiche autoformanti da parte del gruppo20 di Yoshiki Sasai, molti laboratori hanno sviluppato protocolli per generare organoidi retinici che possono variare in quasi ogni fase 5,18,19,21. Un elenco esaustivo di protocolli può essere trovato in Capowski et al.2...

La modellazione delle malattie umane in colture cellulari e modelli animali ha fornito strumenti inestimabili per la scoperta, la modifica e la convalida di terapie farmacologiche, consentendo loro di passare dal farmaco candidato alla terapia approvata. Sebbene una combinazione di modelli in vitro e non umani in vivo sia stata a lungo una componente critica della pipeline di sviluppo di farmaci, spesso non riescono a prevedere le prestazioni cliniche di nuovi farmaci candidati1. Vi è una chiara necessità di sviluppare tecnologie che colmino il divario tra monocolture cellulari umane semplicistiche e sperimentazioni cliniche. I recenti progressi tecnologici nelle colture tissutali tridimensionali auto-organizzate, gli organoidi, hanno migliorato la loro fedeltà ai tessuti che modellano, rendendoli strumenti promettenti nella pipeline di sviluppo di farmaci preclinici2.
Uno dei principali vantaggi della coltura cellulare umana rispetto ai modelli in vivo non umani è la capacità di replicare le complessità specifiche del metabolismo umano che possono variare considerevolmente anche tra vertebrati di ordine superiore come gli esseri umani e i topi3. Tuttavia, questa specificità può essere oscurata da una perdita di complessità tissutale; Questo è il caso del tessuto retinico in cui più tipi di cellule sono intrecciati in modo intricato e hanno un'interazione metabolica simbiotica unica tra sottotipi cellulari che non possono essere replicati in una monocoltura4. Gli organoidi umani, che forniscono un facsimile di tessuti umani complessi con l'accessibilità e la scalabilità della coltura cellulare, hanno il potenziale per superare le carenze di queste piattaforme di modellazione delle malattie.
Gli organoidi retinici derivati da cellule staminali si sono dimostrati particolarmente fedeli nel modellare il complesso tessuto della retina neurale umana5. Ciò ha reso il modello organoide retinico una tecnologia promettente per lo studio e il trattamento delle malattie retiniche 6,7. Ad oggi gran parte della modellizzazione della malattia negli organoidi retinici si è concentrata sulle malattie retiniche monogeniche in cui gli organoidi retinici derivano da linee iPSC con varianti genetiche che causano malattie7. Si tratta generalmente di mutazioni altamente penetranti che si manifestano come fenotipi dello sviluppo. Meno lavoro è stato fatto efficacemente sulle malattie dell'invecchiamento in cui mutazioni genetiche e fattori di stress ambientali influenzano il tessuto che si è sviluppato normalmente. Le malattie neurodegenerative dell'invecchiamento possono avere un'eredità genetica complessa e contributi da fattori di stress ambientali che sono intrinsecamente difficili da modellare utilizzando colture cellulari a breve termine. Tuttavia, in molti casi queste malattie complesse possono fondersi su comuni fattori di stress cellulari o metabolici che, se testati su un tessuto umano completamente sviluppato, possono fornire potenti informazioni sulle malattie neurodegenerative dell'invecchiamento8.
La malattia degenerativa maculare ad esordio tardivo, la teleangectasia maculare di tipo II (MacTel), è un ottimo esempio di una malattia neurodegenerativa geneticamente complessa che si fonde su un difetto metabolico comune. MacTel è una rara malattia degenerativa retinica dell'invecchiamento che provoca la perdita di fotorecettori e glia di Müller nella macula, portando a una progressiva perdita nella visione centrale 9,10,11,12,13. In MacTel, un'eredità genetica indeterminata, possibilmente multifattoriale, guida una riduzione comune della serina circolante nei pazienti, con conseguente aumento di una specie lipidica neurotossica chiamata desossisfingolipidi (deossiSL)14,15. Per dimostrare che l'accumulo di deoxySL è tossico per la retina e per convalidare potenziali terapie farmaceutiche, abbiamo sviluppato questo protocollo per analizzare la tossicità dei fotorecettori negli organoidi retinici umani14.
Qui delineiamo un protocollo specifico per differenziare gli organoidi retinici umani, stabilendo un saggio di tossicità e salvataggio utilizzando organoidi e quantificando i risultati. Forniamo un esempio di successo in cui determiniamo la tossicità tessuto-specifica di un sospetto agente patogenogeno, il deoxySL, e convalidiamo l'uso di un farmaco generico sicuro, il fenofibrato, per il potenziale trattamento della tossicità retinica indotta da deossiSL. Lavori precedenti hanno dimostrato che il fenofibrato può aumentare la degradazione del deossiSL e ridurre la deossiSL circolante nei pazienti, tuttavia, la sua efficacia nel ridurre la tossicità retinica indotta da deossiSL non è stata testata16,17. Sebbene presentiamo un esempio specifico, questo protocollo può essere utilizzato per valutare l'effetto di qualsiasi numero di fattori di stress metabolici / ambientali e potenziali farmaci terapeutici sul tessuto retinico.

<table><tbody><tr><td>0.5M EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>125mL Erlenmeyer Flaconi</td><td>VWR</td><td>89095-258</td><td></td></tr><tr><td>1-deossisfinganina</td><td>Avanti</td><td>860493</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplemento, meno vitamina A</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Beaver 6900 Mini-Blade</td><td>Beaver-Visitec</td><td>BEAVER6900</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Saccarosio</td><td>VWR</td><td>97061-432</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo-fisher</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II, polvere</td><td>Gibco</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, glucosio alto, piruvato</td><td>Gibco</td><td>11995073</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11330</td><td></td></tr><tr><td>Asino anti-coniglio Ig-G, Alexa Fluor plus 555</td><td>Thermo-fisher</td><td>A32794</td><td></td></tr><tr><td>siero</td> <td>d'asinoSigma</td><td>D9663-10ML</td><td></td></tr><tr><td>FBS, Inattivato a Caldo</td><td>Corning</td><td>45001-108</td><td></td></tr><tr><td>Fenofibrato</td><td>Sigma</td><td>F6020</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Eparina</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7980</td><td></td></tr><tr><td>Kit di Rilevamento della Morte Cellulare In Situ, Fluorescin</td><td>Sigma</td><td>11684795910</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel, fattore di crescita ridotto</td><td>Corning</td><td>356230</td><td></td></tr><tr><td>MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR 1</td><td>Stemcell Technologies</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>N2 Integratore</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 16% Formaldeide</td><td>Thermo-fisher</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Recoverina di coniglio</td><td>Millipore</td><td>AB5585</td><td></td></tr><tr><td>Citrato di sodio</td><td>Sigma</td><td>W302600</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip Unità filtranti sottovuoto monouso sterili</td><td>MilliporeSigma</td><td>SE1M179M6</td><td></td></tr><tr><td>Taurina</td><td>Sigma</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>Tessuto Plus- Composto OCT</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-730-571</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold</td><td>EMS</td><td>62534-10</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Attacco ultra-basso Piastre a 6 pozzetti</td><td>Corning</td><td>29443-030</td><td></td></tr><tr><td>Attacco ultra-basso 75cm2 U-Flask</td><td>Corning</td><td>3814</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di filtrazione sottovuoto</td><td>VWR</td><td>10040-436</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield-montaggio vettore medio</td><td>Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>penna per cera-ImmEdge</td><td>vettore Labs</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 Dicloridrato (Inibitore della roccia)</td><td>Sigma</td><td>Y0503</td><td></td></tr></tbody></table>

screening di tossicità negli organoidi retinici umani per la scoperta farmaceutica

Toxicity Screens in Human Retinal Organoids for Pharmaceutical Discovery

Gli organoidi forniscono una piattaforma promettente per studiare il meccanismo e i trattamenti della malattia, direttamente nel contesto del tessuto umano con la versatilità e la produttività della coltura cellulare. Gli organoidi retinici umani maturi sono utilizzati per lo screening di potenziali trattamenti farmaceutici per la telangiectasia maculare legata all'età della malattia degenerativa della retina di tipo 2 (MacTel).
Abbiamo recentemente dimostrato che MacTel può essere causato da livelli elevati di una specie lipidica atipica, i desossisfingolipidi (deossiSL). Questi lipidi sono tossici per la retina e possono guidare la perdita di fotorecettori che si verifica nei pazienti MacTel. Per esaminare i farmaci per la loro capacità di prevenire la tossicità dei fotorecettori deossiSL, abbiamo generato organoidi retinici umani da una linea di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) non MacTel e li abbiamo maturati fino a un'età post-mitotica in cui sviluppano tutte le cellule derivate dalla linea neuronale della retina, compresi i fotorecettori funzionalmente maturi. Gli organoidi retinici sono stati trattati con un metabolita deossiSL e l'apoptosi è stata misurata all'interno dello strato fotorecettore utilizzando l'immunoistochimica. Utilizzando questo modello di tossicità, sono stati sottoposti a screening i composti farmacologici che prevengono la morte dei fotorecettori indotta da deossiSL. Utilizzando un approccio candidato mirato, abbiamo determinato che il fenofibrato, un farmaco comunemente prescritto per il trattamento del colesterolo alto e dei trigliceridi, può anche prevenire la tossicità del deossiSL nelle cellule della retina.
Lo schermo di tossicità ha identificato con successo un farmaco approvato dalla FDA che può prevenire la morte dei fotorecettori. Questo è un risultato direttamente attuabile grazie al modello altamente rilevante per la malattia testato. Questa piattaforma può essere facilmente modificata per testare qualsiasi numero di fattori di stress metabolici e potenziali interventi farmacologici per la futura scoperta del trattamento nelle malattie retiniche.

Gli organoidi retinici sono stati generati da una linea iPSC di controllo non MacTel. Dopo che gli organoidi hanno raggiunto le 26 settimane di coltura, sono stati selezionati e divisi in gruppi sperimentali. Gli organoidi sono stati trattati con concentrazioni variabili di deossiSA per determinare se il deossiSA è tossico per i fotorecettori. Sono state testate quattro concentrazioni di deossiSA, da 0 a 1 μM (Figura 2) e gli organoidi sono stati trattati per 8 giorni, con cambiamenti dei te...

Qui presentiamo un protocollo passo-passo per generare organoidi retinici umani maturi e utilizzarli in un test di tossicità dei fotorecettori per identificare i candidati farmaceutici per la malattia degenerativa retinica legata all'età telangiectasia maculare di tipo 2 (MacTel).

Screening di tossicità negli organoidi retinici umani per la scoperta farmaceutica

Organoids provide a promising platform to study disease mechanism and treatments, directly in the context of human tissue with the versatility and ...

Questo protocollo fornisce un approccio preclinico per scoprire e convalidare trattamenti farmaceutici per le malattie metaboliche della retina direttamente all'interno del tessuto retinico umano. Questa tecnica combina la complessità del metabolismo nei tessuti umani con la versatilità e la produttività della coltura cellulare. Abbiamo utilizzato questo test per acquisire dati preclinici per il trattamento della malattia degenerativa retinica, MacTel, utilizzando un farmaco che altera i lipidi comune e sicuro, il fenofibrato, che è ora in studi clinici di sicurezza.Questo approccio può essere applicato a qualsiasi numero di fattori di stress retinici comuni che portano a malattie tra cui carenza di nutrienti, ipossia, tossicità leggera e altri lipidi tossici. Alla settimana 24 di coltura, controllare gli organoidi per la formazione di segmenti rudimentali all'esterno dell'organoide. Entro la settimana 26-28, i segmenti esterni dovrebbero aver formato uno spesso strato.Quando si può osservare un segmento di dubbioso ispessito, diluire una soluzione madre di deossiSA millimolare a 0,51. Una e due concentrazioni micromolari in tre millilitri di differenziazione retinica mezzo più. Utilizzando un microscopio a dissezione e una sonda sterile, selezionare quattro gruppi di organoidi di circa le stesse dimensioni e forma con un minimo di cinque organoidi per gruppo e dividere i gruppi in singoli pozzetti di una piastra a 6 pozzetti a attacco ultra-basso.Quando tutti gli organoidi sono stati raccolti, rimuovere quanto più mezzo possibile da ciascun pozzetto e aggiungere una concentrazione della soluzione di deossiSA a ciascun pozzetto. Aggiungere il controllo del veicolo al quarto gruppo di organoidi. Dopo due giorni di coltura, sostituire i surnatanti di coltura con il deossiSA fresco appropriato o la diluizione di controllo.Dopo quattro giorni di coltura, incorporare la sezione criogenica e colorare gli organoidi secondo protocolli standard per consentire la valutazione della morte cellulare all'interno di ciascuna coltura. Dopo la colorazione, utilizzare un ingrandimento da cinque a 10x per individuare una regione della sezione organoide affettata che sia intatta, ben formata e in un piano che campiona una sezione trasversale rappresentativa dell'organoide. La sezione dovrebbe avere uno strato nucleare esterno distinto di fotorecettori che sia almeno un paio di cellule spesse e uno strato separato e distinto di nuclei che non hanno recupero e colorazione.Incorniciare l'immagine e aumentare l'ingrandimento a 20x. Quindi, inquadrare nuovamente la diapositiva per riempire l'immagine con il maggior numero possibile di strati fotorecettori. Impostate il piano Z e impostate i limiti inferiori superiori dell'intervallo Z per visualizzare l'intera profondità della sezione.Quindi immagina tutti e tre i canali del fluoroforo in un'acquisizione Z-stack e salva l'immagine in un formato di file che preservi il rapporto di area per pixel. Per quantificare il numero di cellule morte in ciascun campione, apri le pile di immagini nelle Figi. Nella finestra delle opzioni di importazione del formato bio, verificare che non siano selezionate caselle nella sezione suddivisione in finestre separate e selezionare Progetto immagine, Pile e Z per creare una nuova immagine per la quantificazione.Selezionare il canale dell'immagine che mostra il recupero e la colorazione e utilizzare lo strumento di selezione del poligono per delineare una regione continua di fotorecettori nell'immagine. Fare clic su Analizza e imposta misurazioni e selezionare la casella Area. Fare clic su Analizza e misura, per misurare l'area dei fotorecettori, per contare le cellule morenti.La misurazione apparirà in una finestra pop-up. Per contare i nuclei positivi all'apoptosi nella regione fotorecettore selezionata, fare clic con il pulsante destro del mouse sullo strumento punto per selezionare lo strumento multipunto e selezionare la colorazione positiva dell'apoptosi che si sovrappone a un nucleo positivo DAPI e recuperare e colorare. Passare da un canale all'altro per convalidare le celle positive.Quindi dividere il numero di cellule positive all'apoptosi per l'area per ottenere un valore normalizzato per la morte cellulare all'interno dei fotorecettori per organoide. Dopo aver determinato la concentrazione di deossiSA che induce la morte delle cellule bersaglio, utilizzare una sonda sterile per selezionare tre gruppi di organoidi di circa le stesse dimensioni e forma con un minimo di cinque organoidi per gruppo. E aggiungi i gruppi ai singoli pozzetti di una piastra a 6 pozzetti ultra-bassa.Aggiungere la concentrazione di morte delle cellule bersaglio di deoxySA, la concentrazione di morte delle cellule bersaglio di deossiSA integrata con il farmaco di interesse o il mezzo di controllo al pozzo o agli organoidi appropriati. Dopo due giorni, sostituire il surnatante in ciascun pozzetto con la concentrazione appropriata di trattamento fresco o mezzo di controllo. Dopo quattro giorni di coltura, valutare le colture per la morte cellulare come dimostrato.In questa analisi rappresentativa, organoidi retinici generati da una linea di cellule staminali pluripotenti indotte da controllo non maculare telangiectasia di tipo 2 sono stati trattati con quattro concentrazioni di deossiSA. La morte cellulare in risposta al deossiSA era dipendente dalla concentrazione e rilevabile in appena 50 nanomolari deossiSA. La più alta concentrazione testata ha indotto una robusta morte cellulare pur mantenendo l'integrità dell'organoide retinico.Il trattamento con fenofibrato micromolare 20 ha impedito la tossicità indotta da deossiSA nei fotorecettori degli organoidi retinici, riducendo significativamente la morte cellulare di circa l'80% dopo quattro giorni di trattamento. Ricordarsi di selezionare organoidi ben formati e sani per garantire che il test venga eseguito nelle cellule retiniche. Gli organoidi possono essere elaborati per la raccolta dell'RNA per quantificare l'espressione genica, consentendo la valutazione dei segnali di stress e la convalida di effetti tossici e salvataggi.Utilizzando questa tecnica, siamo stati in grado di saggiare il metabolismo a valle di più lipidi diversi negli organoidi, aprendo lo studio del metabolismo lipidico nelle retine umane.

toxicity-screens-human-retinal-organoids-for-pharmaceutical

Research

Ricerca

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingegneria

Screening RNA inibitorio piccolo su vasta scala è uno strumento importante che potrebbe contribuire a delucidare più rapidamente i meccanismi molecolari di lesioni epiteliali cornea chimica. Qui, presentiamo lo sviluppo e la convalida dei modelli di esposizione e dei metodi per lo screening di elevato throughput di indotta da acido fluoridrico e cloropicrina lesioni epiteliali cornea.

High Throughput Screening SiRNA per lesione delle cellule epiteliali cloropicrina e Cornea indotta da acido fluoridrico

Utilizzando un metodo auto-organizzante, sviluppiamo un protocollo con l'aggiunta di COCO che potrebbe aumentare significativamente la generazione di fotorecettori.

Induzione diretta di organoidi retinici da cellule staminali pluripotenti umane

Questo protocollo presenta e descrive i passaggi per l'isolamento, la dissezione, la coltivazione e la colorazione degli espianti retinici ottenuti da un topo adulto. Questo metodo è utile come modello ex vivo per lo studio di diverse malattie neurovascolari retiniche come la retinopatia diabetica.

Espianto retinico della retina del topo adulto come modello ex vivo per lo studio delle malattie neurovascolari retiniche

Questo protocollo descrive un metodo semi-automatico per screening di farmaci organoidi a medio-alto rendimento e un software di analisi delle immagini automatizzato indipendente dal microscopio per quantificare e visualizzare risposte multiparametriche a singolo organoide per catturare l'eterogeneità intratumorale.

Screening multiparametrico di farmaci organoidi tumorali mediante imaging a cellule vive a campo ampio per analisi di massa e organoidi singoli

Questo protocollo descrive un metodo efficiente per differenziare le hiPSC in cluster di campi oculari e generare organoidi neuro-retinici utilizzando condizioni di coltura semplificate che coinvolgono sia sistemi di coltura aderenti che in sospensione. Altri tipi di cellule oculari, come l'RPE e l'epitelio corneale, possono anche essere isolati dai campi oculari maturi nelle colture retiniche.

Generazione di organoidi retinici da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo sane e specifiche per malattie retiniche

Il presente protocollo descrive un sistema di induzione retinica neurale 3D ottimizzato che riduce l'adesione e la fusione degli organoidi retinici con elevata ripetibilità ed efficienza.

Generazione di retina neurale da cellule staminali pluripotenti umane

Le microglia sono cellule immunitarie uniche residenti nella retina, che svolgono un ruolo cruciale in varie malattie degenerative della retina. La generazione di un modello di co-coltura di organoidi retinici con microglia può facilitare una migliore comprensione della patogenesi e del progresso dello sviluppo delle malattie retiniche.

Assemblaggio di organoidi retinici con microglia

Questo protocollo combina la chiarificazione ottica e l'immunomarcatura per l'imaging confocale a volume completo di organoidi retinici a montaggio intero. Preserva la struttura 3D, consentendo la visualizzazione dettagliata dei percorsi neuronali chiave, migliorando lo studio della maturazione retinica, l'organizzazione spaziale e le sue potenziali applicazioni nella modellazione delle malattie e nella medicina personalizzata.

Visualizzazione di organoidi retinici a montaggio intero con risoluzione cellulare

Nanoparticelle fluorescenti prodotte nel nostro laboratorio vengono utilizzati per concentrazioni di ioni di imaging e flussi di ioni in sistemi biologici come cellule durante la segnalazione e fluido interstiziale durante l'omeostasi fisiologica.

Le nanoparticelle fluorescenti per la misurazione della concentrazione di ioni in sistemi biologici

GENPLAT (Enzyme GLBRC Platform) è una piattaforma automatizzata per la scoperta e l'ottimizzazione di cocktail di enzimi per la degradazione della biomassa. Può essere adattato alle materie prime più e miscele di enzimi contenenti più componenti.

GENPLAT: una piattaforma automatizzata per la scoperta degli enzimi biomassa e ottimizzazione Cocktail

Scopri un protocollo di screening farmaceutico basato su organoidi retinici umani maturi per valutare composti che prevengono la tossicità dei fotorecettori nella degenerazione retinica metabolica.

Screening di tossicità negli organoidi retinici umani per la scoperta farmaceutica

Esplora altri video