Preparazione della griglia crio-elettrone microscopica per studi risolti nel tempo utilizzando un nuovo sistema robotico, Spotiton
25 febbraio 2021
Il protocollo qui presentato descrive l'uso di Spotiton, un nuovo sistema robotico, per fornire due campioni di interesse su una griglia di nanofili auto-traspiranti che si mescolano per un minimo di 90 ms prima della vetrificazione nel criogeno liquido.
Utilizzando il sistema robotico Spotiton, è possibile mescolare e vetrificare una proteina di interesse con un partner interagente su una griglia di microscopio elettronico in appena 90 millisecondi. Questo protocollo consente la cattura di conferme proteiche intermedie che sono troppo transitorie per essere catturate con tecniche standard di preparazione della griglia. Lo Spotiton risolto nel tempo può informare sistemi biologici o biochimici sub-secondi come l'attivazione del canale di membrana, la sintesi del DNA o dell'RNA o l'interazione precoce di un farmaco o di un anticorpo con la sua proteina bersaglio.
L'utente deve gestire contemporaneamente diversi componenti che influiscono direttamente sulla qualità di una griglia. È importante comprendere il sistema prima di utilizzarlo e avere pazienza durante la preparazione delle griglie. Per iniziare, aprire la valvola principale sul serbatoio di alimentazione dell'azoto e assicurarsi che il serbatoio del sistema sia riempito con acqua ultrapura degassata.
Accendere il computer e il sistema Spotiton sulla ciabatta multi-presa. Fare clic sull'icona del desktop per aprire l'interfaccia utente del software Spotiton. Nel menu Strumenti, selezionare Inizializza fasi per inizializzare e gestire i robot a tre assi e il gruppo testa del distributore rotante, assicurandosi che le punte del distributore siano puntate verso il basso prima dell'inizializzazione e dell'homing.
Nel menu principale, fai clic su Vai alla posizione sicura per inviare i robot alla posizione sicura. Nella scheda Aspira, selezionare Prime per lavare più volte le teste del distributore con l'acqua del serbatoio. Continua fino a quando due flussi ininterrotti di acqua possono essere visti emergere dalle punte.
Nella scheda Ispeziona, inviare la punta uno alla telecamera di ispezione e testare l'acqua di fuoco, regolando l'ampiezza fino a quando non vengono prodotte goccioline discrete. Premere il pulsante Registra nel monitor della fotocamera superiore per registrare un video di punta uno che spara. Invia il suggerimento due alla telecamera di ispezione.
Riproduci il video della punta uno che spara nel monitor laterale destro nello stesso momento in cui la punta due viene sparata nel monitor della telecamera superiore, abbinando il modello di produzione di goccioline dai due distributori. Rimuovere le pinzette dal supporto sul robot a griglia utilizzando la chiave a brugola in dotazione. Su un piano di lavoro vicino, posizionare un nanofilo della griglia di prova sul lato sul bordo del blocco della griglia.
Afferrare con attenzione il bordo della griglia e posizionarlo correttamente nelle pinzette. Quindi rimontare le pinzette. Nella scheda Cryo, fai clic su Tip to Camera per spostare la punta uno nel campo visivo della telecamera del percorso di immersione superiore, assicurandoti che Live sia selezionato nel monitor della fotocamera superiore.
Accendere e regolare la luce superiore della fotocamera. Punta di posizione uno visibile nel monitor superiore della telecamera, facendo clic con il mouse all'interno del monitor. Fare clic su Grid to Camera per posizionare la griglia davanti alla fotocamera superiore, quindi regolare nuovamente la punta di una posizione, se necessario.
Nella scheda Crio, assicurati che Griglia vetrificata non sia selezionata, fai clic su Destinazione coda, quindi su Tuffa. Valutare le immagini superiore e inferiore per confermare che i dispenser funzionino normalmente. Diluire due campioni alle concentrazioni desiderate con un tampone appropriato, idealmente usando lo stesso per entrambi, e riempire la ciotola di criogeno con azoto liquido.
Plasma pulito tre o quattro griglie di nanofili utilizzando cinque watt di idrogeno e ossigeno e 1,5 minuti come punto di partenza. Collegare il nebulizzatore e osservare il vapore uscire dalla porta centrale del cappuccio del nebulizzatore. Osservare il monitor di umidità in tempo reale nella finestra principale o aprire il tracker dell'umidità ambientale in Rapporti e Ambiente.
Controllare i livelli di umidità nella camera e nelle zone di sudario. Aggiungere cinque microlitri di ciascun campione nelle tazze del campione. Caricare le coppe campione nel vassoio di attesa con un campione per la punta uno a sinistra e per la punta due a destra.
Quindi spingere il vassoio di nuovo nella macchina fino a quando non si siede. Nella scheda Aspirato selezionare tre microlitri per il volume da aspirare da ciascuna punta. Assicurarsi che il vassoio del campione sia stato inserito saldamente, fare clic su Aspira e osservare lo stadio della pipetta spostare le teste del distributore nelle tazze del campione.
Verificare l'aspirazione di successo di entrambi i campioni rimuovendo le tazze del campione e osservando un calo dei livelli di liquido. Nella scheda Ispeziona, inviare ogni suggerimento alla telecamera di ispezione per confermare l'erogazione senza ostacoli. Regolare l'ampiezza secondo necessità per abbinare la formazione di goccioline da ciascuna punta.
Caricare una griglia appena pulita al plasma nelle pinzette, ma non montare ancora le pinzette. Assicurarsi che il livello di umidità sia elevato a circa il 90-95% Riempire la tazza di etano ed eseguire un fuoco di prova finale di entrambe le punte davanti alla telecamera di ispezione, confermando l'installazione di nessuna ostruzione. Nella scheda Cryo, fai clic su Tip to Camera.
Controlla la tazza di etano. Se si è formato ghiaccio di etano, sciogliersi secondo necessità con gas etano aggiuntivo. Montare le pinzette con la griglia sul palco della griglia.
Nella scheda Cryo, fare clic su Grid to Camera, assicurandosi che la punta uno sia posizionata correttamente nel monitor della telecamera superiore. Fare clic su Griglia vetrificata, Destinazione coda, quindi Su Tuffo. Fare clic su OK quando viene richiesto di comandare al robot della griglia di far saltare la griglia dall'etano all'azoto liquido e rilasciarla sullo scaffale sommerso.
Esaminare le immagini della griglia per decidere se deve essere conservata o scartata. Se si mantiene la griglia, pre-raffreddare la pincipe a punta fine, afferrare delicatamente la griglia dal bordo e posizionarla in uno slot della griglia, iniziando con il primo slot a sinistra della tacca e andando in senso orario. Utilizzare il Visualizzatore esperimenti per rivedere e confrontare le immagini della griglia delle telecamere superiore e inferiore insieme alle impostazioni della macchina e alle misurazioni dell'umidità al momento del tuffo selezionando Report ed esperimento.
Le immagini di griglie preparate durante una singola sessione di Spotiton risolta nel tempo mescolando RNA polimerasi in un oligomero di DNA a 105 coppie di basi che trasporta una sequenza di promotori per 150 millisecondi prima della vitrificazione sono mostrate qui. Delle sei griglie, solo una mostra un assorbimento non ottimale. Il modello di deposizione di ghiaccio su una griglia vetrificata corrisponde strettamente al modello di liquido depositato visto nell'immagine superiore della telecamera.
L'assorbimento efficace dei campioni misti avviene lungo le barre della griglia coperte di nanofili in cui il campione raramente trabocca in quadrati adiacenti a quelli in cui è atterrato. Nei quadrati pieni di ghiaccio, il ghiaccio è in genere più spesso all'interno dei fori al centro del quadrato e diventa più sottile nei fori più vicini alle barre della griglia. I fori immediatamente adiacenti alle barre della griglia sono spesso vuoti, a causa della vicinanza ai nanofili.
Una corretta preparazione e manipolazione delle griglie di nanofili garantirà un buon spessore del ghiaccio su griglie di campioni misti. Il sistema Spotiton consente inoltre all'utente di depositare i due campioni separatamente su un'unica griglia, consentendo la raccolta di un controllo non mixato durante la stessa sessione di manutenzione della rete. Spotiton ha permesso la cattura dei primi intermedi nell'espressione genica batterica in tempo reale.
Poiché si formano su una scala temporale al di sotto del secondo, le loro strutture sono state sconosciute fino ad ora.
Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo dettagliato per l'utilizzo del sistema robotico Spotiton per eseguire studi di microscopia elettronica crio-a risoluzione temporale (cryo-EM). Il sistema Spotiton consente una rapida miscelazione e vitrificazione di biomolecole interagenti su griglie EM a nanofili, permettendo ai ricercatori di catturare stati molecolari transitori che si verificano su scale temporali inferiori al secondo. Il protocollo pone particolare enfasi sulla risoluzione dei problemi e sull'ottimizzazione della preparazione delle griglie per ottenere risultati di alta qualità con volumi minimi di campione.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Microscopia elettronica criogenica (cryo-EM)
- Biologia strutturale
- Chimica biologica
Sfondo
- Catturare intermedi molecolari a vita breve è una sfida importante nella microscopia crioelettronica (cryo-EM).
- I metodi tradizionali di preparazione delle griglie spesso non riescono a catturare stati conformazionali transitori.
- Sono necessarie approcci risolti nel tempo per studiare processi biologici rapidi come l'attivazione dei canali di membrana, la sintesi degli acidi nucleici e le prime interazioni tra farmaco e bersaglio.
- Spotiton è un sistema robotico progettato per affrontare queste sfide, consentendo un miscelamento preciso e rapido del campione e la sua vitrificazione.
Scopo dello studio
- Fornire un protocollo dettagliato per l'utilizzo del sistema Spotiton in studi di criomicroscopia elettronica risolti nel tempo.
- Evidenziare strategie di risoluzione dei problemi relativi a errori comuni durante la preparazione delle griglie.
- Mostrare la capacità del sistema di catturare stati molecolari transitori.
Metodi Utilizzati
- Preparazione e inizializzazione del sistema robotico Spotiton e del relativo software.
- Calibrazione e sincronizzazione di due dispenser piezoelettrici per la deposizione precisa di goccioline.
- Pulizia con plasma e manipolazione delle griglie elettroniche a nanofili.
- Miscelazione rapida e vetrificazione di due campioni su una griglia in appena 90–150 millisecondi.
- Valutazione della qualità della griglia mediante strumenti di imaging e tracciamento dell'esperimento.
Risultati principali
- Il protocollo consente la miscelazione e la vetrificazione dei campioni su una scala temporale sufficientemente rapida da catturare conformazioni proteiche intermedie.
- Un'efficace asciugatura e formazione di ghiaccio sono ottenute lungo le barre della griglia nanostrutturata, con uno spessore ottimale del ghiaccio nella maggior parte delle maglie della griglia.
- Il sistema permette il deposito sia di campioni miscelati che non miscelati (controllo) su una singola griglia.
- Spotiton ha permesso la cattura in tempo reale di intermedi precedentemente inosservabili nell'espressione genica batterica.
Conclusioni
- Il sistema Spotiton fornisce un flusso di lavoro robusto ed efficiente per studi di criomicroscopia elettronica risolti nel tempo.
- Una corretta configurazione, calibrazione e manipolazione sono fondamentali per la preparazione di griglie di alta qualità.
- Questo approccio apre nuove possibilità per lo studio di eventi biomolecolari rapidi e transitori ad alta risoluzione.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Catturare intermedi molecolari transitori rappresenta una sfida fondamentale nella fase iniziale della scoperta di farmaci e nella biologia strutturale. Il sistema robotico Spotiton consente la preparazione di griglie per microscopia crioelettronica risolta nel tempo, permettendo ai team di ricerca e sviluppo di analizzare interazioni biomolecolari rapide e cambiamenti conformazionali con elevata precisione temporale. Questa capacità aumenta la sicurezza predittiva nella validazione delle proteine bersaglio e supporta decisioni ponderate sui portafogli progettuali in punti critici della scoperta.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette l'osservazione diretta di conformazioni proteiche a vita breve rilevanti per il legame al bersaglio.
- Consente la riduzione del rischio meccanicistico catturando stati intermedi nelle interazioni proteina-ligando o proteina-acido nucleico.
- Facilita la validazione funzionale del bersaglio rivelando transizioni strutturali su scale temporali sub-secondo.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Prepara griglie biologiche validate per analisi crioelettroniche successive con volume minimo di campione.
- Standardizza la preparazione delle griglie per ottenere letture strutturali riproducibili e quantitative.
- Consente una produzione rapida e scalabile di griglie per supportare lo screening ad alto rendimento delle interazioni molecolari.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea istantanee strutturali con meccanismi rilevanti per la malattia, fornendo indicazioni per strategie traslazionali di biomarcatori.
- Garantisce continuità dallo studio meccanicistico nella fase di scoperta alla validazione in modelli preclinici.
- Riduce l'ambiguità nella progettazione di farmaci basata sulla struttura, catturando stati intermedi difficili da isolare.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il sistema Spotiton si integra nell'interfaccia tra la fase iniziale della scoperta e l'identificazione dei composti promettenti, collegando i flussi di lavoro di indagine meccanicistica con quelli di validazione strutturale.
- Biologia della Scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi consentendo il rilevamento di eventi molecolari rapidi e transizioni nei percorsi metabolici.
- Screening: Fornisce griglie di microscopia criogenica riproducibili e quantitative per l'analisi comparativa degli effetti di composti o biomolecole.
- Analisi: Offre dati strutturali ad alta risoluzione per guidare il confronto tra condizioni e formulare ipotesi meccanicistiche.
- Ricerca Translazionale: Collega le prime scoperte strutturali alla validazione preclinica quando vengono studiati sistemi rilevanti per la malattia.
- Riutilizzo Aziendale: Stabilisce un flusso di lavoro scalabile e standardizzato per un uso ripetuto in diversi programmi di scoperta.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione del bersaglio.
- Valore operativo: Fornisce una preparazione standardizzata, riproducibile e scalabile delle griglie per studi strutturali.
- Valore strategico: Permette decisioni informate di proseguimento o interruzione e un avanzamento capital-efficiente delle risorse scoperte.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione aggiustata per il rischio rivelando stati transitori cruciali per la funzione biologica.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specialistiche nella manipolazione delle griglie per criomicroscopia elettronica e nell'uso di sistemi robotici.
- Necessita dell'accesso allo strumento Spotiton e a griglie elettroniche per nanofili compatibili.
- Richiede una rigorosa calibrazione e una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per ottenere risultati riproducibili.
- Potrebbe essere necessaria un'adattamento per diversi sistemi biomolecolari o tipologie di campioni.
- La qualità della griglia è sensibile al controllo dell'umidità, alla calibrazione del dispensatore e alle procedure di preparazione del campione.
