Preparazione della griglia crio-elettrone microscopica per studi risolti nel tempo utilizzando un nuovo sistema robotico, Spotiton

Utilizzando il sistema robotico Spotiton, è possibile mescolare e vetrificare una proteina di interesse con un partner interagente su una griglia di microscopio elettronico in appena 90 millisecondi. Questo protocollo consente la cattura di conferme proteiche intermedie che sono troppo transitorie per essere catturate con tecniche standard di preparazione della griglia. Lo Spotiton risolto nel tempo può informare sistemi biologici o biochimici sub-secondi come l'attivazione del canale di membrana, la sintesi del DNA o dell'RNA o l'interazione precoce di un farmaco o di un anticorpo con la sua proteina bersaglio.

L'utente deve gestire contemporaneamente diversi componenti che influiscono direttamente sulla qualità di una griglia. È importante comprendere il sistema prima di utilizzarlo e avere pazienza durante la preparazione delle griglie. Per iniziare, aprire la valvola principale sul serbatoio di alimentazione dell'azoto e assicurarsi che il serbatoio del sistema sia riempito con acqua ultrapura degassata.

Accendere il computer e il sistema Spotiton sulla ciabatta multi-presa. Fare clic sull'icona del desktop per aprire l'interfaccia utente del software Spotiton. Nel menu Strumenti, selezionare Inizializza fasi per inizializzare e gestire i robot a tre assi e il gruppo testa del distributore rotante, assicurandosi che le punte del distributore siano puntate verso il basso prima dell'inizializzazione e dell'homing.

Nel menu principale, fai clic su Vai alla posizione sicura per inviare i robot alla posizione sicura. Nella scheda Aspira, selezionare Prime per lavare più volte le teste del distributore con l'acqua del serbatoio. Continua fino a quando due flussi ininterrotti di acqua possono essere visti emergere dalle punte.

Nella scheda Ispeziona, inviare la punta uno alla telecamera di ispezione e testare l'acqua di fuoco, regolando l'ampiezza fino a quando non vengono prodotte goccioline discrete. Premere il pulsante Registra nel monitor della fotocamera superiore per registrare un video di punta uno che spara. Invia il suggerimento due alla telecamera di ispezione.

Riproduci il video della punta uno che spara nel monitor laterale destro nello stesso momento in cui la punta due viene sparata nel monitor della telecamera superiore, abbinando il modello di produzione di goccioline dai due distributori. Rimuovere le pinzette dal supporto sul robot a griglia utilizzando la chiave a brugola in dotazione. Su un piano di lavoro vicino, posizionare un nanofilo della griglia di prova sul lato sul bordo del blocco della griglia.

Afferrare con attenzione il bordo della griglia e posizionarlo correttamente nelle pinzette. Quindi rimontare le pinzette. Nella scheda Cryo, fai clic su Tip to Camera per spostare la punta uno nel campo visivo della telecamera del percorso di immersione superiore, assicurandoti che Live sia selezionato nel monitor della fotocamera superiore.

Accendere e regolare la luce superiore della fotocamera. Punta di posizione uno visibile nel monitor superiore della telecamera, facendo clic con il mouse all'interno del monitor. Fare clic su Grid to Camera per posizionare la griglia davanti alla fotocamera superiore, quindi regolare nuovamente la punta di una posizione, se necessario.

Nella scheda Crio, assicurati che Griglia vetrificata non sia selezionata, fai clic su Destinazione coda, quindi su Tuffa. Valutare le immagini superiore e inferiore per confermare che i dispenser funzionino normalmente. Diluire due campioni alle concentrazioni desiderate con un tampone appropriato, idealmente usando lo stesso per entrambi, e riempire la ciotola di criogeno con azoto liquido.

Plasma pulito tre o quattro griglie di nanofili utilizzando cinque watt di idrogeno e ossigeno e 1,5 minuti come punto di partenza. Collegare il nebulizzatore e osservare il vapore uscire dalla porta centrale del cappuccio del nebulizzatore. Osservare il monitor di umidità in tempo reale nella finestra principale o aprire il tracker dell'umidità ambientale in Rapporti e Ambiente.

Controllare i livelli di umidità nella camera e nelle zone di sudario. Aggiungere cinque microlitri di ciascun campione nelle tazze del campione. Caricare le coppe campione nel vassoio di attesa con un campione per la punta uno a sinistra e per la punta due a destra.

Quindi spingere il vassoio di nuovo nella macchina fino a quando non si siede. Nella scheda Aspirato selezionare tre microlitri per il volume da aspirare da ciascuna punta. Assicurarsi che il vassoio del campione sia stato inserito saldamente, fare clic su Aspira e osservare lo stadio della pipetta spostare le teste del distributore nelle tazze del campione.

Verificare l'aspirazione di successo di entrambi i campioni rimuovendo le tazze del campione e osservando un calo dei livelli di liquido. Nella scheda Ispeziona, inviare ogni suggerimento alla telecamera di ispezione per confermare l'erogazione senza ostacoli. Regolare l'ampiezza secondo necessità per abbinare la formazione di goccioline da ciascuna punta.

Caricare una griglia appena pulita al plasma nelle pinzette, ma non montare ancora le pinzette. Assicurarsi che il livello di umidità sia elevato a circa il 90-95% Riempire la tazza di etano ed eseguire un fuoco di prova finale di entrambe le punte davanti alla telecamera di ispezione, confermando l'installazione di nessuna ostruzione. Nella scheda Cryo, fai clic su Tip to Camera.

Controlla la tazza di etano. Se si è formato ghiaccio di etano, sciogliersi secondo necessità con gas etano aggiuntivo. Montare le pinzette con la griglia sul palco della griglia.

Nella scheda Cryo, fare clic su Grid to Camera, assicurandosi che la punta uno sia posizionata correttamente nel monitor della telecamera superiore. Fare clic su Griglia vetrificata, Destinazione coda, quindi Su Tuffo. Fare clic su OK quando viene richiesto di comandare al robot della griglia di far saltare la griglia dall'etano all'azoto liquido e rilasciarla sullo scaffale sommerso.

Esaminare le immagini della griglia per decidere se deve essere conservata o scartata. Se si mantiene la griglia, pre-raffreddare la pincipe a punta fine, afferrare delicatamente la griglia dal bordo e posizionarla in uno slot della griglia, iniziando con il primo slot a sinistra della tacca e andando in senso orario. Utilizzare il Visualizzatore esperimenti per rivedere e confrontare le immagini della griglia delle telecamere superiore e inferiore insieme alle impostazioni della macchina e alle misurazioni dell'umidità al momento del tuffo selezionando Report ed esperimento.

Le immagini di griglie preparate durante una singola sessione di Spotiton risolta nel tempo mescolando RNA polimerasi in un oligomero di DNA a 105 coppie di basi che trasporta una sequenza di promotori per 150 millisecondi prima della vitrificazione sono mostrate qui. Delle sei griglie, solo una mostra un assorbimento non ottimale. Il modello di deposizione di ghiaccio su una griglia vetrificata corrisponde strettamente al modello di liquido depositato visto nell'immagine superiore della telecamera.

L'assorbimento efficace dei campioni misti avviene lungo le barre della griglia coperte di nanofili in cui il campione raramente trabocca in quadrati adiacenti a quelli in cui è atterrato. Nei quadrati pieni di ghiaccio, il ghiaccio è in genere più spesso all'interno dei fori al centro del quadrato e diventa più sottile nei fori più vicini alle barre della griglia. I fori immediatamente adiacenti alle barre della griglia sono spesso vuoti, a causa della vicinanza ai nanofili.

Una corretta preparazione e manipolazione delle griglie di nanofili garantirà un buon spessore del ghiaccio su griglie di campioni misti. Il sistema Spotiton consente inoltre all'utente di depositare i due campioni separatamente su un'unica griglia, consentendo la raccolta di un controllo non mixato durante la stessa sessione di manutenzione della rete. Spotiton ha permesso la cattura dei primi intermedi nell'espressione genica batterica in tempo reale.

Poiché si formano su una scala temporale al di sotto del secondo, le loro strutture sono state sconosciute fino ad ora.