Agroinoculazione diretta di piantine di mais per iniezione con cloni infettivi del virus del mosaico della coda di volpe ricombinante e virus del mosaico della canna da zucchero
27 febbraio 2021
Viene presentato un protocollo di iniezione (agroiniezione) a base di Agrobacterium per l'inoculazione del virus del mosaico a coda di volpe e dei virus del mosaico della canna da zucchero in piantine di mais. L'inoculazione in questo modo porta a infezioni virali, silenziamento genico indotto da virus di geni marcatori e sovraespressione virale di GFP.
Questo protocollo consente l'inoculazione di vettori virali direttamente in piante di mais che possono essere facilmente applicate nella maggior parte delle impostazioni di laboratorio senza la necessità di costose attrezzature specializzate. L'inoculazione diretta elimina l'uso di un ospite alternativo come fonte di inoculo, risparmiando tempo e risorse. Questo metodo potrebbe essere applicato ad altri vettori virali, linee di mais e potenzialmente altre specie monocotiledoni.
Inizia piantando da 1 a 2 semi di mais nel terreno di coltura a base di torba in piccoli inserti posti all'interno di vassoi. Posizionare i vassoi in una camera di crescita sotto i giorni di 16 ore a 25 gradi Celsius e 8 ore di notte a 22-25 gradi Celsius, o in una serra a 22-25 gradi Celsius con giorni di 16 ore e notti di 8 ore. Innaffia regolarmente le piante e concima una volta alla settimana con 15-5-15 fertilizzanti liquidi a 330 parti per milione di concentrazione.
Preparare l'agrobatterio per iniezione inoculando il ceppo agrobatterico contenente il costrutto virale desiderato in mezzi LB con antibiotici. Quindi, incubare il pallone o i tubi a 28 gradi Celsius mentre si agita a 225 RPM per 24 ore. Il giorno successivo, pellettificare i batteri per centrificazione a 4.000 volte G per 10 minuti a temperatura ambiente ed scartare il surnatante.
Quindi, lavare il pellet con un millilitro di acqua deionizzata. Sospendere nuovamente il pellet in un millilitro di soluzione di solfato di magnesio da 10 millimolari e misurare la densità ottica a 600 nanometri. Quindi regolarlo su 1.0.
Utilizzare piantine di mais da 4 a 7 giorni per l'iniezione di agrobatteri. Assemblare la siringa e l'ago. Iniettare delicatamente la sospensione batterica a 2-3 millimetri sopra il nodo coleoptilulare fino a riempire il coleoptile, o è visibile nella spirale, in attesa della fase di crescita delle piante.
Iniettare tutte le piantine e cambiare la siringa e gli aghi per iniettare ogni costrutto. Confermare l'infezione fenotipica osservando le lesioni dal silenziamento dei geni di controllo, la lesione mimica 22 o la fitoene desaturasi sulle foglie. Utilizzare un dispositivo di imaging a fluorescenza per lo screening rapido delle piante e la microscopia a fluorescenza per rilevare la presenza di espressione GFP.
Eseguire analisi di espressione genica per il rilevamento molecolare delle infezioni. Estrarre l'RNA totale dalle foglie di piante infette da 14 a 21 giorni dopo l'infezione e sintetizzare il cDNA del primo filamento come descritto nel manoscritto di testo. Eseguire la PCR della trascrittasi inversa per confermare l'infezione e determinare l'integrità del gene o il frammento genico di interesse utilizzando primer specifici progettati per diversi costrutti virali.
Visualizza il prodotto PCR su un gel di agarosio all'1% contenente una macchia di acido nucleico per determinare la presenza o l'assenza di virus e frammento di gene o gene. Questo protocollo è stato utilizzato per inserire virus ricombinanti ingegnerizzati per gene nelle piantine di mais. Circa 12 giorni dopo l'iniezione, sono stati osservati fenotipi di silenziamento sulle foglie come necrosi e un fotosbiancamento.
La presenza di costrutto nelle foglie dopo l'infezione è stata rilevata osservando l'espressione della proteina fluorescente verde sotto una fluorescenza utilizzando un filtro GFP diverso. L'espressione della proteina fluorescente verde nelle foglie infette da virus del mosaico della coda di volpe è stata visualizzata come piccole aree puntate di fluorescenza distribuite sulle foglie e come grandi macchie nelle foglie infette dal virus del mosaico della canna da zucchero. Utilizzando l'analisi dell'espressione genica, è stata confermata l'infezione sistemica da virus del mosaico della coda di volpe ed è stato osservato il silenziamento genico o la soppressione della fitoene desaturasi e della lesione mimica 22.
Il costrutto utilizzava anche l'efficienza delle infezioni influenzate. Nel caso dell'infezione da virus del mosaico della coda di volpe, il vettore vuoto del virus del mosaico della coda di volpe e la lesione del virus del mosaico della coda di volpe mimica 22 in genere avevano le più alte efficienze di infezione rispettivamente al 53% e al 54%. Foxtail mosaic virus phytoene desaturase a un'efficienza leggermente inferiore al 39% e foxtail mosaic virus green fluorescent protein, alla più bassa efficienza al 16%Nel frattempo, l'efficienza di infezione della proteina fluorescente verde del virus del mosaico della canna da zucchero è stata dell'8% I tempi e i sintomi si baseranno sul vettore virale e sulla linea di mais utilizzati.
La mancanza di un fenotipo visivo potrebbe non significare una mancanza di silenziamento o espressione. Questo metodo può anche essere applicato alle tecnologie di editing genetico migliorando i metodi di consegna per gli RNA guida.
Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo dettagliato per la consegna mediata da Agrobacterium di vettori virali ricombinanti in piantine di mais. Il metodo consente l'inoculazione diretta di costrutti virali per studi di silenziamento genico ed espressione genica, eliminando la necessità di piante ospiti alternative e di attrezzature specializzate. L'approccio è stato ottimizzato per i vettori del virus del mosaico della digitaria (FoMV) e del virus del mosaico della canna da zucchero (SCMV) ed è adattabile a diversi genotipi di mais e potenzialmente ad altre specie di monocotiledoni.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia molecolare vegetale
- Virologia vegetale
- Ingegneria genetica
Sfondo
- I metodi basati su Agrobacterium sono ampiamente utilizzati per introdurre DNA in tessuti vegetali.
- I vettori virali facilitano il silenziamento genico e l'espressione nelle piante.
- L'inoculazione tradizionale richiede spesso un ospite alternativo come fonte del virus.
- I metodi di somministrazione diretta possono risparmiare tempo e risorse negli studi genetici vegetali.
Scopo dello studio
- Sviluppare e ottimizzare un protocollo per la consegna diretta di vettori virali in piantine di mais mediante Agrobacterium.
- Dimostrare l'efficacia del metodo per l'interferenza genica e l'espressione genica utilizzando costrutti di FoMV e SCMV.
- Fornire una tecnica ampiamente accessibile per la ricerca molecolare vegetale.
Metodi Utilizzati
- Crescita di piantine di mais in condizioni controllate (camera climatica o serra).
- Preparazione di Agrobacterium tumefaciens GV3101 contenente costrutti virali ricombinanti in pCAMBIA1380.
- Iniezione della sospensione batterica nelle vicinanze del nodo coleoptilaro di piantine di mais di 4–7 giorni di età.
- Osservazione fenotipica (lesione simulata 22, silenziamento della fitoene desaturasi, espressione di GFP) e conferma molecolare mediante RT-PCR ed elettroforesi in gel di agarosio.
Risultati principali
- Infezione sistemica e diffusione riuscita di virus ricombinanti in piantine di mais.
- Fenotipi osservabili: necrosi e fotobiancamento per il silenziamento genico, fluorescenza GFP per l'espressione genica.
- L'efficienza di infezione variava a seconda del costrutto: vettore vuoto FoMV e les22 (53–54%), FoMV pds (39%), FoMV GFP (16%), SCMV GFP (8%).
- La RT-PCR ha confermato la presenza e l'integrità dei costrutti virali nelle piante infette.
Conclusioni
- Il protocollo consente un'efficace somministrazione diretta di vettori virali nel mais senza l'uso di attrezzature specializzate.
- È efficace sia per studi di silenziamento genico che di espressione genica nel mais.
- Il metodo è adattabile ad altri vettori virali, linee di mais e potenzialmente ad altre monocotiledoni, e potrebbe facilitare applicazioni di editing genico.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'agroinoculazione diretta di piantine di mais con vettori virali ricombinanti semplifica l'analisi della funzione genica e la validazione di caratteri fenotipici nelle colture a foglia stretta. Questo approccio elimina la necessità di ospiti alternativi e di attrezzature specializzate, accelerando la fase iniziale della scoperta e consentendo test rapidi delle ipotesi nei processi biotecnologici vegetali. Il metodo supporta flussi di lavoro scalabili e riproducibili per studi di silenziamento genico ed espressione genica, migliorando l'affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi e nell'ingegnerizzazione dei caratteri fenotipici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Consente studi rapidi di genomica funzionale mediante il diretto rilascio di costrutti per il silenziamento genico o l'espressione genica.
- Facilita la riduzione del rischio meccanicistico attraverso cambiamenti fenotipici osservabili associati a specifici geni bersaglio.
- Supporta una previsione affidabile nella selezione dei caratteri e nella priorizzazione dei bersagli per il miglioramento delle colture.
Sviluppo di screening e saggi
- Prepara sistemi di mais validati per lo screening successivo della funzione genica o dell'espressione di caratteri.
- Standardizza i protocolli di infezione ed espressione, migliorando la riproducibilità tra genotipi e costrutti.
- Genera output quantitativi mediante RT-PCR e imaging a fluorescenza per una valutazione affidabile dei costrutti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea gli studi sulla funzione genica a caratteri rilevanti per le malattie o di importante valore agronomico nelle colture di monocotiledoni.
- Consente una continuità dalla fase iniziale di scoperta alla validazione preclinica dei caratteri nei processi biotecnologici vegetali.
- Fornisce informazioni meccanicistiche che guidano l'ulteriore sviluppo di caratteri ingegnerizzati con valutazione del rischio.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo diretto di agroinoculazione si integra nel processo di scoperta e validazione per l'ingegneria delle caratteristiche vegetali e la genetica funzionale.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi metabolici consentendo il silenziamento genico diretto o l'espressione nel mais.
- Screening: Fornisce dati quantitativi e riproducibili relativi all'infezione e all'espressione per il confronto tra costrutti.
- Analisi: Utilizza metodiche RT-PCR e rilevamenti di fluorescenza per confermare la presenza del costrutto e i risultati funzionali.
- Ricerca traslazionale: Collega gli studi iniziali sulla funzione genica alla validazione preclinica di caratteristiche in sistemi colturali pertinenti.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma ampiamente accessibile e adattabile per diversi vettori virali e genotipi di monocotiledoni.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica negli studi sulla funzione genica.
- Valore operativo: Standardizza e amplia la consegna genica senza l'uso di attrezzature specializzate o di ospiti alternativi.
- Valore strategico: Accelera le decisioni di avanzamento o interruzione e migliora l'efficienza del capitale nei processi di sviluppo di caratteri fenotipici.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione e la promozione di caratteri fenotipici o bersagli ingegnerizzati in base alla gestione del rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in biologia molecolare vegetale e trasformazione mediata da Agrobacterium.
- Necessita di una infrastruttura di base in laboratorio per la coltivazione di piante, la coltura batterica e l'analisi molecolare.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro dei protocolli di iniezione e analisi per garantire la riproducibilità.
- Adattabile a diverse genotipi di mais e potenzialmente ad altre specie monocotiledoni, previa ottimizzazione del protocollo.
- L'efficienza di infezione e la visibilità del fenotipo possono variare in base al costrutto e al genotipo, richiedendo una conferma molecolare.
