Name: Produzione di cellule CAR-T umane ingegnerizzate CRISPR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-15T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Scopri la produzione di cellule CAR-T umane ingegnerizzate CRISPR per l'immunoterapia antitumorale. Questo protocollo robusto consente l'editing genico multiplex con elevata efficienza e facilita la traduzione clinica.

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Riconosciamo il Nucleo di Immunologia Umana per la fornitura di cellule T normali donatrici e il Nucleo di Citometria a Flusso presso l'Università della Pennsylvania.

Le cellule T umane sono state acquistate attraverso il nucleo di immunologia umana dell'Università della Pennsylvania, che opera secondo i principi della buona pratica di laboratorio con procedure operative standard stabilite e / o protocolli per la ricezione, l'elaborazione, il congelamento e l'analisi dei campioni conformi alle linee guida etiche MIATA e Dell'Università della Pennsylvania.
1. Produzione vettoriale lentivirale
NOTA: I prodotti virali sono stati resi difettosi di replicazione mediante separazione dei costrutti di imballaggio (Rev, gag/pol/RRE, VSVg e plasmide di trasferimento) in quattro plasmidi separati, riducendo notevolmente la probabilità di eventi di ricombinazione che possono portare a virus competenti per la replicazione.
<ol><li>Preparare le cellule HEK293T un giorno prima della trasfezione. Placcare circa 6 x 10 6 cellule in vasi dicoltura T150 in 30 mL di substrati di coltura standard (indicati come R10:RPMI 1640 integrati con il 10% di siero fetale di vitello, 10 mM hepes, 1% di penna/streptococco, 1% di L-glutammina) e incubare durante la notte a 37 °C. 18-24 ore dopo, le cellule dovrebbero essere confluenti al 60-70% e apparire sane (proiezioni dendritiche e distribuzione uniforme attraverso il pallone). Se le cellule sembrano sane, procedere al passaggio 1.2.</li>
	<li>Preparare la miscela di trasfezione contenente reagente di lipofezione (96 μL), pTRP gag/pol (Lotto # RR13SEP19A) (18 μg), pTRP RSV-Rev (Lotto # RR13SEP19B-3) (18 μg), pTRP VSVG (Lotto # RR13SEP19C) (7 μg) plasmidi di imballaggio e 15 μg di plasmide di espressione (CD19bbz scFv clonato in pTRPE).<ol>
<li>Per ogni reazione di trasfezione, preparare un tubo contenente 1 mL di mezzi essenziali minimi sierici ridotti più i quattro plasmidi descritti nella fase 1.2 e un tubo contenente 2 mL di mezzi essenziali minimi sierici ridotti più 90 μL di reagente di lipofezione. Combinare queste due soluzioni mediante aggiunta a goccia della miscela di plasmidi da 1 mL alla miscela di reagenti lipofezionali da 2 mL. Assicurarsi di mescolare vigorosamente la soluzione pipettando su e giù più volte. Incubare la soluzione per 15 minuti a temperatura ambiente.</li>
		<li>Nel frattempo, aspirare il mezzo dal pallone cellulare HEK293T e lavare delicatamente le cellule con 10 ml di mezzi essenziali minimi sierici ridotti e aspirare di nuovo.</li>
		<li>Aggiungere delicatamente la miscela di trasfezione (3 mL) dal punto 1.2.1 all'angolo inferiore del pallone di coltura cellulare utilizzando una pipetta sierologica da 5 mL. Inclinare delicatamente il pallone per distribuire uniformemente la miscela di trasfezione attraverso il pallone di coltura cellulare e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Assicurati di non disturbare il monostrato cellulare. Dopo un'incubazione di 10 minuti, aggiungere 35 ml di mezzi R10 e restituire il pallone all'incubatore per 24 ore.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dopo 24 ore, raccogliere il surnatante dai palloni di coltura cellulare HEK293T e trasferirlo in tubi conici da 50 ml. Aggiungere R10 fresco alle celle HEK29T e rimettere le celle nell'incubatore per altre 24 ore. Ruotare verso il basso il surnatante (300 x g) per rimuovere i detriti cellulari e filtrare il surnatante attraverso un filtro da 0,45 μm.</li>
	<li>Concentrare il filtrato dal punto 1.3 mediante ultracentrifugazione ad alta velocità (25.000 x g per 2,5 ore o 8000 x g durante la notte (O/N)). Conservare il pellet di virus 24 h a 4 °C mentre si pooling il virus 48 h.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 1.3-1.4 per la raccolta di 48 ore e combinare raccolte di virus di 24 ore e 48 ore. I pellet della collezione 48 h conterranno un raccolto combinato del lentivirus.</li>
	<li>Resuspend viral pellet in circa 1 mL di R10 freddo e aliquota in flaconcini da 100 μL. Congelare immediatamente le aliquote con ghiaccio secco e conservare a -80 °C.</li>
	<li>Calcolare il titolo virale funzionale in unità trasduttori/mL trasducendo una quantità fissa di cellule T umane primarie attivate da cd3/CD28 con diluizioni seriali del surnatante lentivirale. Misurare la trasduzione CAR dopo 72 ore mediante citometria a flusso.<ol>
<li>Colorazione per la CAR diretta da CD19 con un anticorpo anti-FCM63 scFv. Per altri recettori dell'antigene chimerico, colorare usando una proteina ricombinante etichettata con fluoroforo specifica per il CAR scFv. La diluizione del virus che genera meno del 20% di cellule CAR positive mediante citometria a flusso è la diluizione più accurata da cui calcolare il titolo virale. Al di sopra del 20% di cellule CAR-positive, la possibilità che ogni cellula positiva venga trasdotta due volte aumenta, con conseguente sottostima del numero di particelle trasduttori. Calcolare le unità trasduttori per mL (TU/mL) = (numero di cellule trasdotte x percentuale di cellule CAR positive x fattore di diluizione)/(volume di trasduzione in mL).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Progettazione di sgRNA e distruzione genica in cellule T umane primarie
<ol><li>Progettazione di SGRNA CRISPR NOTA: diversi server e programmi facilitano la progettazione di sgRNA specifici del target. In questo protocollo, gli sgRNA CRISPR sono stati progettati utilizzando CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no) e il portale di progettazione gRNA dell'istituto Broad (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).<ol>
<li>Per ogni gene bersaglio, progettare da sei a dieci sequenze di sgRNA per indirizzare le prime sequenze di esoni codificanti. NOTA: sgRNA dovrebbe avere un'elevata efficacia on-target e una bassa efficacia off target. Ogni algoritmo di apprendimento automatico per determinare l'efficacia di sgRNA funziona in modo leggermente diverso. Pertanto, si consiglia di confrontare più strumenti di progettazione sgRNA e curare un elenco da sei a dieci sgRNA per lo screening.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Interruzione genica nelle cellule T umane primarie<ol>
<li>Ottenere cellule mononucleate autologhe del sangue periferico (PBMC) da donatori volontari sani. Una sequenza temporale schematica del protocollo è descritta nella Figura 2A e descritta di seguito.</li>
		<li>Isolare le cellule T CD4+ e CD8+ utilizzando i kit di selezione CD4 e CD8 disponibili in commercio.</li>
		<li>Combinare le cellule T CD4+ e CD8+ in un rapporto 1: 1 e incubare durante la notte a 3x106 cellule / mL in R10 integrate con 5 ng / mL huIL-7 e huIL-15 ciascuna. L'aggiunta di IL-7 e IL-15 è raccomandata in quanto sono noti per promuovere un fenotipo di memoria centrale e le cellule CAR-T espanse con IL-7 e IL-15 hanno un'efficacia antitumorale superiore rispetto alle cellule CAR-T espanse IL-222,23,24.</li>
		<li>Il giorno dopo, contare le cellule T e centrifugare 5-10 x 106 celle a 300 x g per 5 minuti. Scartare tutto il surnatante e lavare il pellet cellulare in un mezzo essenziale minimo a siero ridotto. Trattenere il pellet in 100 μL di soluzione di nucleofezione secondo le istruzioni del produttore (Tabella dei materiali).</li>
		<li>Durante il lavaggio delle cellule, preparare il complesso di ribonucleoproteine (RNP) con Cas9 e gRNA incubando 10 μg di nucleasi Cas9 con 5 μg di sgRNA per 10 minuti a temperatura ambiente (RT). Il rapporto molare tra Cas9 e sgRNA è 1:2,4. Si consiglia un controllo fittizio che contenga Cas9 e potenziatore di elettroporazione, ma nessun sgRNA. NOTA: l'editing genetico multiplex può essere eseguito in questa fase creando complessi RNP per ciascun bersaglio separatamente e combinandoli con le cellule al momento della nucleofezione come descritto nel passaggio successivo. La scelta dei reagenti per assemblare il complesso RNP è la chiave per ottenere un'elevata efficienza KO. Ad esempio, le nucleasi Cas9 di diversi fornitori hanno diversi effetti fuori bersaglio e il gRNA chimicamente modificato riduce la tossicità per le cellule T, aumentando così l'efficienza del KO.</li>
		<li>Combinare le cellule spese dal passo 2.2.4 con il complesso RNP dal passo 2.2.5 e aggiungere 4,2 μL di potenziatore di elettroporazione da 4 μM (oligonucleotide ssDNA che non è omologo al genoma umano). Mescolare bene e trasferire in cuvette elettroporatorie. Evitare le bolle in quanto compromettono l'efficienza dell'elettroporazione.</li>
		<li>Celle elettroporate con codice a impulsi EH111. Dopo l'elettroporazione, incubare le celle in R10 integrate con 5 ng/mL huIL-7 e huIL-15 a 5x106 celle/mL a 30 °C per 48 ore in piastre a 12 pozzi. Dopo 48 ore, procedere con l'attivazione e l'espansione delle cellule T.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Attivazione delle cellule T, trasduzione ed espansione lentivirale
NOTA: Per lo screening degli sgRNA, la trasduzione lentivirale (Step 3.2) del costrutto CAR non è necessaria.
<ol><li>Contare le cellule T elettroporate e diluire fino a una concentrazione di 1 x10 6 celle/mL utilizzando R10 caldo integrato con 5 ng/mL huIL-7 e huIL-15. Attivare le cellule aggiungendo perle magnetiche rivestite di anticorpi monoclonali anti-CD3 / anti-CD28 in un rapporto di 3 perle per cellula T viva. NOTA: l'elettroporazione provoca una significativa morte cellulare con conseguente circa il 60% ± il 15% di cellule vitali rispetto alle cellule non elettroporate. Utilizzare un conteggio di cellule vive / morte per determinare la quantità appropriata di pere. Trasferire le cellule a 37 °C e incubare durante la notte.</li>
	<li>Dopo la stimolazione notturna, trasdurre le cellule T ingegnerizzate CRISPR con surnatante lentivirale dal passaggio 1. Aggiungere il volume appropriato in base al titolo virale calcolato nel passaggio 1.7 per ottenere una molteplicità di infezione (MOI) di 3 e incubare le cellule per 72 ore a 37 °C. NOTA: Il pellet di virus riconsoso in R10 viene semplicemente aggiunto sopra le cellule in base alla concentrazione cellulare, al titolo virale e al MOI desiderato.</li>
	<li>Dopo 72 ore, alimentare le cellule con il 50% dell'attuale volume di coltura R10 contenente 10 ng/mL huIL-7 e huIL-15 e restituirle all'incubatore per altre 48 ore. Non disturbare i cluster che si sono formati tra le cellule T e le pere.</li>
	<li>Dopo 48 ore, rimuovere le perle dalle cellule riconsosciendo delicatamente la miscela cellula-perle seguita da separazione magnetica. Conta le cellule dopo la rimozione delle perle e portale ad una concentrazione di 0,8 x10 6 cellule / mL usando R10 integrato con 5 ng / mL huIL-7 e huIL-15. Dopo la de-perla, il numero di cellule dovrebbe essere simile al conteggio delle cellule il giorno 1 prima dell'elettroporazione (Figura 2B).</li>
	<li>Dopo 24 ore, contare le cellule e alimentare fino a una concentrazione di 1 x10 6 cellule / mL con R10 + 5 ng / mL huIL-7 e huIL-15. Ripeti questo ogni 24 ore fino a quando la cinetica di crescita e le dimensioni delle cellule dimostrano che le cellule si sono riposate dalla stimolazione. NOTA: Da questo punto, le cellule T raddoppiano approssimativamente ogni 24 ore. Le cellule T di solito subiscono 5-7 raddoppi di popolazione e hanno un volume cellulare di circa 300 ± 50 fL quando riposate.</li>
	<li>Una volta riposate, ruotare le cellule CAR-T ingegnerizzate CRISPR e risospenderle in congelo (1:1 X-Vivo e FBS più 10% DMSO) per la crioconservazione. Le cellule CAR-T utilizzate devono essere scongelate e riposate a 37 °C per 16 ore prima di un esperimento. NOTA: Tenere circa 10x106 celle riservate per misurare l'efficienza di knockout e l'integrazione CAR. I raddoppi attesi della popolazione e le variazioni di volume durante l'espansione sono stati mostrati nella Figura 2B,2C. Inoltre, la Figura 2D mostra i livelli di espressione di CAR su cellule CAR-T sia Mock che gene edited.</li>
</ol>4. Efficienza CRISPR
<ol><li>Estrazione genomica del DNA e amplificazione del gene bersaglio<ol>
<li>Da ogni coltura di screening, spin down 3-5 x 106 cellule T. Le cellule possono essere congelate come un pellet secco o si può procedere con l'estrazione del DNA genomico. Al momento dell'estrazione del DNA, ricaspendare i pellet in 200 μL di Phosphate Buffer Saline (PBS) ed estrarre il DNA genomico dalle cellule elettroporate utilizzando un kit di estrazione del DNA standard secondo le istruzioni del produttore.<ol>
<li>In breve, sciogliare le cellule con la proteinasi K e caricare il llisi su una colonna di legame del DNA. Durante la centrifugazione, il DNA si lega alla membrana mentre i contaminanti passeranno attraverso. Dopo due fasi di lavaggio per rimuovere i contaminanti rimanenti e gli inibitori enzimatici, eluire il DNA in acqua.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Amplificare 200-300 ng di DNA genomico utilizzando un mix PCR standard contenente DNA polimerasi, proteine accessorie, sali e dNTP e primer avanti e indietro di 10 μM che fiancheggiano la regione della rottura a doppio filamento prevista. NOTA: per la progettazione del primer PCR, la sequenza genomica di riferimento (può essere trovata utilizzando http://www.ensemble.org) che fiancheggia il sito di taglio del gRNA viene inserita nello strumento di granigliatura del primer NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast). I primer PCR devono essere progettati in modo tale che l'amplicon abbia una dimensione target di 600-700bp. Questa lunghezza consente di progettare primer di sequenziamento che si legano all'interno dell'amplicon con una distanza sufficiente dal sito di taglio del gRNA (almeno 150 bp) per garantire una buona qualità di sequenziamento intorno agli indel indotti da Cas9 (vedi 4.2.1). Ogni gRNA richiede una coppia di primer unica, a meno che i siti di taglio del gRNA non siano nelle immediate vicinanze.</li>
		<li>Eseguire l'intero prodotto PCR su un gel di agarose all'1% e purificare l'amplicon utilizzando un kit di purificazione del gel di agarose standard. NOTA: il processo di determinazione del Tm ottimale per la PCR può richiedere più cicli di risoluzione dei problemi. Questo perché la sequenza KO ha indels e il gene bersaglio dovrebbe essere innescato per il sequenziamento dove non ci sarebbero indels di solito 100 bp a monte o a valle del sito di taglio. Questo può variare ampiamente a causa di indels derivanti da unendo estremità non omologhe. La progettazione di primer di sequenziamento nidificati per i primer PCR e l'aumento della concentrazione di prodotti sequenziati possono eliminare i problemi con il sequenziamento.</li>
	</ol></li>
	<li>Sequenziamento e rilevamento indel<ol>
<li>Progetta primer di sequenziamento che si legano all'amplicon purificato dal gel e inviano ampliconi finti e knockout per il sequenziamento Sanger. Una volta completato il sequenziamento, caricare i file di traccia sul software Desktop Genetics (tide.deskgen.com, Desktop Genetics) per l'analisi TIDE.<ol>
<li>Per la progettazione del primer di sequenziamento, inserire la sequenza dell'amplicon PCR in un software di progettazione del primer standard (NCBI, Eurofins o altri strumenti disponibili pubblicamente). Il software di progettazione suggerirà più sequenze di primer adatte al sequenziamento sanger.</li>
			<li>Scegli primer avanti e indietro che si leghino all'interno dell'amplicon almeno 150 bp a monte o a valle del sito di taglio del gRNA per garantire una buona qualità di sequenziamento intorno agli indel. Il cromatogramma di sequenziamento sarà utilizzato in 4.2 per l'analisi TIDE, quindi è importante che la qualità del sequenziamento sia buona per un'accurata decomposizione indel (vedi Hultquist et al.) 25.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Utilizzare l'analisi TIDE (Tracking of Indels by DEcomposition) per rilevare l'efficienza del knock out (KO) a livello genomico26. L'algoritmo ricostruisce accuratamente lo spettro degli indel dalle tracce di sequenza e calcola i valori R2, riflettendo la bontà dell'adattamento dopo la modellazione lineare non negativa da parte del software TIDE.</li>
	</ol></li>
	<li>Rilevamento di proteine bersaglio<ol>
<li>Per i geni bersaglio il cui prodotto genico è espresso sulla superficie delle cellule T, colorare circa 1 x 10 5 cellule daciascuna coltura di screening con un anticorpo marcato con fluorocromo specifico per la proteina bersaglio. Confrontare i livelli di espressione della proteina bersaglio tra i gruppi di controllo simulato e knockout mediante citometria a flusso come mostrato in Figura 3A,3B.</li>
		<li>Per i geni bersaglio il cui prodotto genico è espresso intracellulare, lisi circa 3 x 106 milioni di cellule per gruppo di screening nel tampone di lisi e seguire protocolli standard per SDS-PAGE e western blotting. In alternativa, la citometria a flusso superficiale o intracellulare può essere utilizzata per sondare la proteina bersaglio.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Monitoraggio degli effetti off-target utilizzando iGUIDE - Preparazione della libreria, sequenziamento del DNA e analisi
NOTA: la tecnica iGUIDE consente di rilevare le posizioni della scissione guidata Cas9 e quantificare le distribuzioni di quelle rotture a doppio filamento di DNA.
<ol><li>Eseguire iGUIDE come descritto da Nobles et al.21. Gli effetti off-target di sgRNA che prendono di mira il locus TRAC utilizzando la tecnica iGUIDE sono stati dimostrati in Stadtmauer et al, 202013.</li>
</ol>

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<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-programmed+genome+editing+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">RNA-programmed genome editing in human cells.</a> Elife. 2, 00471(2013).</li>
<li>Schluns, K. S., Kieper, W. C., Jameson, S. C., Lefrançois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-7+mediates+the+homeostasis+of+naive+and+memory+CD8+T+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Interleukin-7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo.</a> Nature Immunology. 1 (5), 426-432 (2000).</li>
<li>Prlic, M., Lefrancois, L., Jameson, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+choices%3A+regulation+of+memory+CD8+T+cell+generation+and+homeostasis+by+interleukin+%28IL%29-7+and+IL-15%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Multiple choices: regulation of memory CD8 T cell generation and homeostasis by interleukin (IL)-7 and IL-15.</a> The Journal of Experimental Medicine. 195 (12), 49-52 (2002).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+%28CAR-T%29+cells+expanded+with+IL-7%2FIL-15+mediate+superior+antitumor+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+%26+Cell%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cells expanded with IL-7/IL-15 mediate superior antitumor effects.</a> Protein & Cell. 10 (10), 764-769 (2019).</li>
<li>Hultquist, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+genome+engineering+of+primary+CD4%2B+T+cells+for+the+interrogation+of+HIV-host+factor+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 genome engineering of primary CD4+ T cells for the interrogation of HIV-host factor interactions.</a> Nature Protocols. 14 (1), 1-27 (2019).</li>
<li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42 (22), 168(2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno divulgazioni.

Qui descriviamo gli approcci per modificare le cellule CAR-T utilizzando la tecnologia CRISPR Cas9 e fabbricare prodotti per testare ulteriormente la funzione e l'efficacia. Il protocollo di cui sopra è stato ottimizzato per l'esecuzione dell'editing genetico CRIPSR in cellule T umane primarie combinate con cellule T ingegneristiche con recettori dell'antigene chimerico. Questo protocollo consente un'elevata efficienza di knockout con una variabilità minima da donatore a donatore. La modifica utilizzando CRISPR può migli...

La terapia cellulare del recettore dell'antigene chimerico (CAR)-T ha rivoluzionato il campo delle terapie cellulari adottive e dell'immunoterapia del cancro. Le cellule CAR-T sono cellule T ingegnerizzate che esprimono un recettore immunitario sintetico che combina un frammento di anticorpo a catena singola antigene-specifico con domini di segnalazione derivati dalla catena TCRzeta e domini costimulatori necessari e sufficienti per l'attivazione e la co-stimolazione delle cellule T1,2,3,4 . La produzione di cellule CAR-T inizia estraendo le cellule T del paziente, seguita dalla trasduzione virale ex vivo del modulo CAR e dall'espansione del prodotto cellulare CAR-T con perle magnetiche che funzionano come antigene artificiale presentando cellule5. Le cellule CAR-T espanse vengono reinfuse nel paziente dove possono attecchire, eliminare le cellule tumorali bersaglio e persino persistere per più anni dopo l'infusione6,7,8. Sebbene la terapia con cellule CAR-T abbia portato a notevoli tassi di risposta nelle neoplasie delle cellule B, il successo clinico per i tumori solidi è stato messo alla prova da molteplici fattori tra cui la scarsa infiltrazione delle cellule T9,un microambiente tumorale immunosoppressivo10,la copertura e la specificità dell'antigene e la disfunzione delle cellule CAR-T11,12 . Un'altra limitazione dell'attuale terapia cellulare CAR-T include l'uso di cellule T autologhe. Dopo più cicli di chemioterapia e un elevato carico tumorale, le cellule CAR-T possono essere di scarsa qualità rispetto ai prodotti ALLOGENI CAR-T di donatori sani, oltre al tempo e alle spese associate alla produzione di cellule CAR-T autologhe. L'editing genetico del prodotto car-T di CRISPR/Cas9 rappresenta una nuova strategia per superare gli attuali limiti delle cellule CAR-T13,14,15,16,17.
CRISPR/Cas9 è un sistema bicomponente che può essere utilizzato per l'editing mirato del genoma nelle cellule di mammifero18,19. L'endonucleasi Associata a CRISPR Cas9 può indurre rotture a doppio filamento sito-specifiche guidate da piccoli RNA attraverso l'accoppiamento di basi con la sequenza di DNA bersaglio20. In assenza di un modello di riparazione, le rotture a doppio filamento vengono riparate dalla via NHEJ (nonhomologous end joining) soggetta a errori, con conseguenti mutazioni frameshift o codoni di arresto prematuro attraverso mutazioni di inserzione e delezione (INDL)19,20,21. Efficienza, facilità d'uso, economicità e capacità di editing del genoma multiplex rendono CRISPR/Cas9 un potente strumento per migliorare l'efficacia e la sicurezza delle cellule CAR-T autologhe e allogenei. Questo approccio può essere utilizzato anche per modificare le celle T dirette TCR sostituendo il costrutto CAR con un TCR. Inoltre, le cellule CAR-T allogeniche che hanno un potenziale limitato di causare la malattia del trapianto contro l'ospite possono anche essere generate dalla modifica genica del locus TCR, b2m e HLA.
In questo protocollo, mostriamo come l'ingegneria CRISPR delle cellule T può essere combinata con la consegna mediata da vettori virali del CAR-Transgene per generare prodotti a cellule CAR-T modificati dal genoma con maggiore efficacia e sicurezza. Un diagramma schematico dell'intero processo è mostrato nella Figura 1. Utilizzando questo approccio, abbiamo dimostrato knockout genico ad alta efficienza nelle cellule CAR-T umane primarie. La Figura 2A descrive in dettaglio la sequenza temporale di ogni passaggio per la modifica e la produzione di celle T. Vengono inoltre discusse le strategie per la progettazione dell'RNA guida e la convalida del knockout per applicare questo approccio a vari geni bersaglio.

Unità <table><tbody><tr><td>centrale 4D-Nucleofactor</td><td>Lonza</td><td>AAF-1002B</td><td></td></tr><tr><td>4D-Nucleofactor X-Unit</td><td>Lonza</td><td>AAF-1002X</td><td></td></tr><tr><td>Accuprime Pfx Supermix</td><td>ThermoFisher</td><td>12344040</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Optima XPN ultracentrifuga</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 605 anti-umano CD3 Antibody</td><td>Biolegend</td><td>317322</td><td>Clone OKT3</td></tr><tr><td>BV711 Clone</td><td>Biolegend</td><td></td> PD1 anti-umano <td>EH12.2H7</td></tr><tr><td>Cas9-Potenziatori di elettroporazione</td><td>IDT</td><td>1075915</td><td></td></tr><tr><td>CD3/CD28 Dynabeads</td><td>ThermoFisher</td><td>40203D</td><td></td></tr><tr><td>CD4+ Kit di isolamento delle cellule T</td><td>Tecnologie StemCell</td><td>15062</td><td></td></tr><tr><td>Kit di isolamento delle cellule T CD8+</td><td>Tecnologie StemCell</td><td>15063</td><td></td></tr><tr><td>Corning 0,45 micron filtro/flacone sottovuoto</td><td>Corning</td><td>430768</td><td></td></tr><tr><td>Fiaschetta per colture cellulari Corning T150</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS430825</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Millipore Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DNAeasy Kit sangue e tessuti</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag Magnet</td><td>ThermoFisher</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax supplement</td><td>ThermoFisher</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>celle HEK293T</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>ThermoFisher</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>huIL-15</td><td>PeproTech</td><td>200-15</td><td></td></tr><tr><td>huIL-7</td><td>PeproTech</td><td>200-07</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>ThermoFisher</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Nucleospin Gel e pulizia</td> <td>PCRTakara</td><td>740609.25</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>ThermoFisher</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>P3 Cellula primaria 4D-nucleofattore X Kit L</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3024</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Streptomicina-Glutammina</td><td>ThermoFisher</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>espressione di pTRPE Plasmide</td><td>in casa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coniglio Anticorpo monoclonale FMC63 scFv, (R19M), PE</td><td>CytoArt</td><td>200105</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>ThermoFisher</td><td>12633012</td><td></td></tr><tr><td>sgRNA</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spy Fi Cas9</td><td>Aldevron</td><td>9214</td><td></td></tr><tr><td>Provette per ultracentrifuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>Miscela per imballaggio virale</td><td>in casa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-Vivo-15 Media</td><td>Lonza</td><td>BE02-060F</td><td></td></tr></tbody></table>

produzione di cellule car-t umane ingegnerizzate crispr

Production of Human CRISPR-Engineered CAR-T Cells

Le terapie cellulari adottive che utilizzano cellule T del recettore dell'antigene chimerico (cellule CAR-T) hanno dimostrato una notevole efficacia clinica in pazienti con neoplasie ematologiche e sono attualmente in fase di studio per vari tumori solidi. Le cellule CAR-T sono generate rimuovendo le cellule T dal sangue di un paziente e ingegnerizzandole per esprimere un recettore immunitario sintetico che reindirizza le cellule T per riconoscere ed eliminare le cellule tumorali bersaglio. L'editing genetico delle cellule CAR-T ha il potenziale per migliorare la sicurezza delle attuali terapie cellulari CAR-T e aumentare ulteriormente l'efficacia delle cellule CAR-T. Qui, descriviamo i metodi per l'attivazione, l'espansione e la caratterizzazione delle cellule CAR-T umane CD19 progettate con CRISPR. Ciò comprende la trasduzione del vettore lentivirale CAR e l'uso di RNA guida singolo (sgRNA) ed endonucleasi Cas9 per indirizzare i geni di interesse nelle cellule T. I metodi descritti in questo protocollo possono essere universalmente applicati ad altri costrutti CAR e geni bersaglio oltre a quelli utilizzati per questo studio. Inoltre, questo protocollo discute le strategie per la progettazione del gRNA, la selezione del gRNA principale e la convalida del knockout del gene bersaglio per ottenere in modo riproducibile l'ingegneria CRISPR-Cas9 multiplex ad alta efficienza delle cellule T umane di grado clinico.

Descriviamo qui un protocollo per ingegnerizzare geneticamente le cellule T, che può essere utilizzato per generare sia cellule CAR-T autologhe che allogenei, nonché cellule T reindirizzate TCR.
La Figura 1 fornisce una descrizione dettagliata delle fasi coinvolte nel processo di produzione delle cellule T modificate crispr. Il processo inizia progettando sgRNA per il gene di interesse. Una volta che gli sgRNA sono stati progettati e sintetizzati, vengono poi util...

Qui, presentiamo un protocollo per l'editing genetico nelle cellule T umane primarie utilizzando la tecnologia CRISPR Cas per modificare le cellule CAR-T.

Produzione di cellule CAR-T umane ingegnerizzate CRISPR

Adoptive cell therapies using chimeric antigen receptor T cells (CAR-T cells) have demonstrated remarkable clinical efficacy in patients with ...

Il nostro protocollo di laboratorio consente la combinazione dell'editing del genoma umano con la terapia con cellule T CAR. La procedura di laboratorio è l'approccio con CRISPR-Cas9 al targeting di un massimo di tre geni ad alta efficienza. E infine, il nostro approccio può essere tradotto in studi clinici sull'uomo.I metodi descritti possono essere applicati ad altri costrutti CAR e geni bersaglio. Le basi delle tecniche sono abbastanza robuste da essere tradotte su larga scala e in collaboratori accademici e industriali per un ulteriore sviluppo. Quando si tenta questo protocollo per la prima volta, limitare il numero di gruppi nello schermo dell'RNA guida per consentire tempi di incubazione accurati.L'adesione alle condizioni di coltura e la densità di semina come descritto si sono dimostrate fondamentali nella nostra esperienza. Per iniziare, ottenere cellule mononucleate autologhe del sangue periferico, o PBMC, da donatori volontari sani e isolare le cellule T CD4 e CD8 positive utilizzando kit di selezione CD4 e CD8 disponibili in commercio. Combina le cellule T CD4 positive e CD8 positive in un rapporto uno a uno e incuba 3 milioni di cellule per millilitro in R10, integrate con 5 nanogrammi per millilitro di ogni IL7 umano e IL15 umano durante la notte a 37 gradi Celsius.Il giorno successivo, contare le cellule T e centrifugare da 5 a 10 milioni di cellule a 300 volte G per cinque minuti. Scartare tutto il surnatante e lavare il pellet cellulare in un siero ridotto con mezzi essenziali minimi. Sospendere di riconsedere il pellet in 100 microlitri di soluzione di affezione nucleare secondo le istruzioni del produttore.Durante il lavaggio delle cellule, preparare una ribonucleoproteina, o complesso RNP, incubando 10 microgrammi di nucleasi Cas9 con 5 microgrammi di RNA guida singola per 10 minuti a temperatura ambiente. Includi un controllo fittizio senza RNA guida singola. Combinare le celle ri-sospese con il complesso RNP e aggiungere 4,2 microlitri di quattro potenziatori di elettroporazione micromolare.Mescolare bene e trasferire in cuvette elettroporatorie. Elettroporate le celle utilizzando il codice a impulsi EH111, quindi incubare 5 milioni di cellule per millilitro in R10, integrate con 5 nanogrammi per millilitro umano IL7 e UMANO IL15 a 30 gradi Celsius per 48 ore in 12 piastre di pozzo. Dopo l'incubazione, procedere con l'attivazione e l'espansione delle cellule T.Progettare i primer di sequenziamento inserendo la sequenza dell'amplicon PCR in un software di progettazione di primer standard. Il software di progettazione suggerirà più sequenze di primer adatte per il sequenziamento Sanger. Scegli primer avanti e indietro che leghino con l'amplicon almeno 150 coppie di basi a monte o a valle del sito di taglio del gRNA per garantire una buona qualità di sequenziamento intorno agli indel.Utilizza l'analisi TIDE per rilevare l'efficienza del knockout a livello genomico. L'algoritmo ricostruisce accuratamente lo spettro degli indel dalle tracce di sequenza e calcola i valori quadrati R. Dopo l'attivazione, le cellule T vengono espanse in coltura e crioconservate per studi futuri.Durante l'espansione, il raddoppio della popolazione e le variazioni di volume vengono monitorati in tutto il protocollo sia per le cellule T CAR simulate che modificate. Non sono stati rilevati cambiamenti significativi nella proliferazione e nell'attivazione durante l'espansione. Una volta che le cellule sono state crioconservate, i livelli di espressione di CAR sono stati determinati per ulteriori studi funzionali sia per le cellule T CAR finte modificate che per quelle knockout.Non sono stati osservati cambiamenti significativi. L'efficienza di knockout può essere determinata utilizzando più tecniche. In questi grafici rappresentativi di citometria a flusso, i loci PDCD1 e TRAC sono stati presi di mira utilizzando RNA guida singolo, mostrando un'efficienza del 90% per l'RNA guida singolo PDCD1 e del 98% per l'RNA guida singolo TRAC su più donatori sani.È importante assicurarsi che i rapporti molari di Cas9 e RNA guida siano accurati. Durante la procedura, le cellule devono essere sempre mantenute a quattro gradi Celsius e non essere lasciate nella soluzione di elettroporazione per lunghi periodi di tempo. Dopo la conservazione della CAR, le cellule T CAR ingegnerizzate CRISPR possono essere utilizzate per saggi funzionali in vitro e in vivo, come saggi di citotossicità, produzione di citochine e modelli murini di tumori singenetici o xenografici.Il nostro approccio utilizzando la tecnologia CRISPR Cas9 viene ora applicato agli studi clinici. L'approccio può essere utilizzato sia per il cancro, sia per un disordine genetico non maligno, come le emoglobinofatà, che colpiscono milioni di bambini e adulti in tutto il mondo.

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Immunologia e Infezioni

Il video delinea un processo per la creazione di cellule CAR T geneticamente modificate attraverso il sistema CRISPR-Cas9. L'infezione delle cellule T con lentivirus CRISPR e CAR provoca modifiche al gene bersaglio e la sintesi di un recettore chimerico dell'antigene o CAR, portando infine alla formazione di cellule T CAR geneticamente modificate.

Cellule CAR T geneticamente modificate utilizzando un sistema CRISPR-Cas9

Questo video mostra un test per l'esecuzione dell'editing genetico in cellule T umane utilizzando la tecnologia CRISPR-Cas9. Una miscela di cellule T primarie CD4+ e CD8+ è combinata con un complesso ribonucleoproteico CRISPR-Cas9, mirato a geni specifici per il knockout. Dopo l'elettroporazione, l'sgRNA guida Cas9 verso la sequenza di DNA bersaglio, creando tagli precisi. Questi tagli vengono poi riparati dal meccanismo di giunzione non omologa della cellula, portando al knockout genico.

Una tecnica CRISPR-Cas9 per l'editing genetico nelle cellule T

Questo video dimostra una tecnica per generare cellule T del recettore chimerico dell'antigene (CAR) antigene-specifico attraverso la trasduzione retrovirale. Le cellule T CD8+ murine attivate vengono aggiunte a una piastra a micropozzetti rivestita con frammenti di fibronectina ricombinante. Vengono quindi introdotti vettori retrovirali contenenti RNA transgenico che codifica per un recettore chimerico dell'antigene (CAR) antigene-specifico e la piastra viene centrifugata per facilitare la...

Una tecnica per la generazione di cellule T CAR antigene-specifiche

Cellule T CD19-che esprimono un recettore chimerico specifico antigene (CAR) sono infusi come trattamento sperimentale di tumori maligni delle cellule B nelle nostre prove gene first-in-umani terapia. Descriviamo modificazione genetica delle cellule T con...

Applicazione clinica della<em&gt; Bella Addormentata</em&gt; Artificiale e cellule presentanti l&#39;antigene per modificare geneticamente le cellule T da sangue del cordone ombelicale e periferico

Gli effetti linfodepletivi e immunomodulatori della chemioterapia e dello standard di cura delle radiazioni possono essere sfruttati per migliorare l'efficacia antitumorale dell'immunoterapia con cellule T. Descriviamo un metodo per generare cellule T del recettore chimerico dell'antigene (CAR) specifiche per EGFRvIII e somministrarle nel contesto dello standard di cura del glioblastoma.

Generazione di cellule CAR T per adottiva terapia nel contesto di Glioblastoma standard di cura

Qui, presentiamo un protocollo per modificare geneticamente le cellule CAR-T tramite un sistema CRISPR/Cas9.

Utilizzo di CRISPR/Cas9 per eliminare GM-CSF nelle celle CAR-T

Questo protocollo semplifica la produzione di vettori retrovirali e la trasduzione delle cellule T murine, facilitando la generazione efficiente di cellule CAR-T di topo.

Generazione efficiente di cellule T del recettore chimerico murino dell'antigene (CAR)-T

Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro semplificato per generare e testare cellule T regolatorie del recettore dell'antigene chimerico umano (CAR Tregs).

Generazione di cellule T regolatorie del recettore dell'antigene chimerico umano

Viene fornito un protocollo dettagliato per l'utilizzo della tecnologia CRISPR/Cas9 per ottenere un knock-in mirato altamente efficiente di grandi costrutti multicistronici in cellule T umane primarie attraverso la via di riparazione del DNA HMEJ (omologia-mediata da end joining). Le cellule T ingegnerizzate con questo protocollo adattabile alle cGMP mantengono un'eccellente espansione cellulare, citotossicità e produzione di citochine.

Ingegnerizzazione non virale di cellule T umane primarie tramite integrazione mirata di giunzione terminale mediata da omologia di grandi modelli di DNA

Questo protocollo descrive i passaggi essenziali per la coltivazione delle cellule T primarie, inclusi il loro isolamento, attivazione, espansione e trasfezione transitoria tramite elettroporazione dell'mRNA. Inoltre, viene proposto un flusso di lavoro e un pannello di anticorpi per l'analisi citometrica a flusso del fenotipo, dei marcatori di attivazione, della vitalità e dell'espressione del recettore antigenico chimerico (CAR).

Isolamento, coltivazione e trasfezione transitoria delle cellule T primarie umane per generare cellule T del recettore antigenico chimerico (CAR)

Scopri la produzione di cellule CAR-T umane ingegnerizzate CRISPR per l'immunoterapia antitumorale. Questo protocollo robusto consente l'editing genico multiplex con elevata efficienza e facilita la traduzione clinica.

Produzione di cellule CAR-T umane ingegnerizzate CRISPR

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