Metodi di coltura per studiare interazioni apicali-specifiche utilizzando modelli organoidi intestinali
23 marzo 2021
Qui presentiamo due protocolli che consentono la modellazione di interazioni intestinali apicali-specifiche. I monostrati intestinali di derivazione organoide e le colture Air-Liquid Interface (ALI) facilitano la generazione di epitelia ben differenziate accessibili sia dal lato luminare che basolaterale, mentre gli organoidi intestinali invertiti dalla polarità espongono il loro lato apicale e sono suscettibili a test ad alta produttività.
Questi studi mirano a fornire sistemi modello robusti e riproducibili per eseguire studi specifici di orientamento dell'epitelio intestinale. Gli organoidi apicici possono essere generati in numero elevato e promettono uno screening ad alta produttività. I monostrati sono più facili da manipolare e offrono l'accesso a segni sia apicali che basali.
Assicurarsi che la dimensione degli organoidi sia di 150-250 micrometri di diametro prima di iniziare il protocollo di inversione. Rimuovere e scartare con cura il mezzo da ogni organoidi ben contenente senza interrompere la cupola ECM. Aggiungere un millilitro di soluzione di dissociazione ghiacciata ad ogni pozzo e incubare la piastra a temperatura ambiente per un minuto.
Rimuovere con cura le cupole tubazionando lentamente con una punta rivestita, facendo attenzione a non interrompere e frammentare gli organoidi. Trasferire la sospensione organoide su una piastra trattata con soluzione anti aderenza e posizionare la piastra su uno shaker a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Dopo 30 minuti rimuovere la piastra e pipettare delicatamente la soluzione su e giù utilizzando una punta di pipetta millilitro rivestita con soluzione anti aderenza.
Posizionare il piatto sullo shaker a quattro gradi Celsius per altri 30 minuti. Rimuovere la piastra e lasciare che gli organoidi si sistemino per gravità per uno o due minuti a temperatura ambiente. Dopo che gli organoidi si depositano, rimuovere la maggior parte possibile della soluzione di dissociazione e lavarli aggiungendo 1,5 millilitri di DMEM F-12.
Lasciare sedimentare gli organoidi e rimuovere il supernatante. Quindi ripetere il lavaggio. Rimuovere il più possibile il DMEM F-12 e aggiungere 0,5 millilitri di mezzo di espansione organoide intestinale.
Incubare durante la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Il giorno seguente eseguire un cambio medio parziale inclinando la piastra con un angolo da 25 a 30 gradi e rimuovendo il mezzo lungo la parete del pozzo facendo attenzione a non rimuovere gli organoidi sospesi. Aggiungere 0,4 millilitri di mezzo di espansione organoide intestinale e incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per tre giorni.
Se si sono formati aggregati utilizzare una punta di pipetta millilitro rivestita con soluzione antiaderente per tagliare gli aggregati tubazione su e giù 20 volte mentre si preme l'estremità della punta sul fondo della piastra. Aggiungere un millilitro di 0,05%Tripside-EDTA prerifampito agli organoidi di sospensione. E mescolare accuratamente per garantire una sospensione uniforme.
Aggiungere fino a un millilitro aggiuntivo di Tripside-EDTA per un gran numero di cellule o se rimane una quantità significativa di ECM. Incubare a 37 gradi Celsius per cinque-10 minuti, quindi mescolare accuratamente con una pipetta millilitro per interrompere gli organoidi in modo che siano completamente dissociati in singole cellule o piccoli frammenti. Per dissociare completamente frammenti o interi organoidi continuare l'incubazione con Tripina-EDTA a 37 gradi Celsius per altri tre o cinque minuti.
Una volta che gli organoidi sono sufficientemente dissociati aggiungere un volume uguale di DMEM F-12 e pipettare su e giù per mescolare accuratamente. Disattivare trypsin-EDTA aggiungendo il 10%FBS alle celle. Centrifugare frammenti a 200 volte G per cinque minuti a due o otto gradi Celsius.
Se gli organoidi dissociati non sono riusciti a mescolare accuratamente le cellule tubazioni su e giù e centrifugandole di nuovo. Rimuovere con cura il più possibile il supernatante. lasciando solo il pellet cellulare.
Rimorsiva le cellule in 100 microlitri di mezzo di differenziazione organoide intestinale per ogni pozzo da seminare. Regolazione del volume in modo appropriato per pozzi di dimensioni maggiori o più piccole. Rimuovere le piastre rivestite dall'incubatore e rimuovere la soluzione a matrice di membrana basale in eccesso da ogni pozzo.
Aggiungere 100 microlitri della sospensione cellulare al pozzo superiore di ogni inserto di coltura cellulare e 500 microlitri di differenziazione organoide intestinale medio al pozzo inferiore. Quindi incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Sostituire il mezzo sia nei pozzi superiore che inferiore ogni due o tre giorni.
Per stabilire una coltura ALI rimuovere il mezzo dai pozzali superiore e inferiore e aggiungere un mezzo di differenziazione organoide intestinale fresco al pozzo inferiore lasciando il pozzo superiore vuoto. Gli organoidi intestinali coltivati con mezzo di espansione organoide intestinale presentavano una morfologia cistica. Quando l'ECM viene rimosso, alcuni organoidi tendono ad aggregarsi durante i primi tre giorni e devono essere aerato per aumentare il numero organoide.
Gli organoidi intestinali coltivati nell'ECM hanno continuato ad espandersi e ad esporre la formazione spontanea di strutture in erba secondarie. Gli organoidi mantenuti per cinque giorni in assenza di matrice extracellulare presentavano forme allungate, cistiche e irregolari. L'espressione di marcatori atipici, come la villina e lo ZO-1, è stata rilevata il lato esterno dell'epitelio che è stato esposto al mezzo.
Organoidi incorporati ECM macchiati per nuclei, villina e ZO-1 che dimostrano una polarità basale apicale in cui il lato apicale era rivolto verso il lume dell'organoide. Una volta stabilito il monostrato, le celle formavano giunzioni strette e uno strato confluente. Lo strato confluente orienta anche il bordo della spazzola contenente villina verso il lato apicale dell'epitelio, formando complessi multi proteina ZO-1 tra le cellule.
La transizione verso una coltura ALI ha indotto un'ulteriore differenziazione con cellule di calice più prominenti che è stata visualizzata mediante colorazione per la proteina mucina secreta MUC2 Per indurre l'inversione di polarità è fondamentale rimuovere tutta l'ECM senza interrompere o frammentare gli organoidi. I cambiamenti dei supporti devono anche essere eseguiti con cura in modo da evitare di rimuovere nessuno degli organoidi sospesi. Garantire che vi siano cellule singole sufficienti per la creazione della coltura monostrato è un fattore determinante della sua qualità.
Funzioni specifiche apicali come l'assorbimento dei nutrienti o le interazioni patogene ospiti possono ora essere studiate in sistemi pertinenti che si adattano alle esigenze dei ricercatori.
Panoramica
Questo articolo presenta due metodi in vitro robusti per facilitare l'accesso alla superficie apicale dell'epitelio degli organoidi intestinali, consentendo studi orientati specificamente. I protocolli descrivono la generazione di organoidi tridimensionali con apice esterno (apical-out) mediante rimozione della matrice extracellulare (ECM) e la creazione di monocapati bidimensionali a partire da cellule di organoidi dissociati. Questi approcci supportano la differenziazione di specifici tipi cellulari intestinali e forniscono piattaforme avanzate per lo studio di funzioni epiteliali specifiche della regione apicale.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia cellulare
- Ricerca sulle cellule staminali
- Fisiologia gastrointestinale
Sfondo
- L'epitelio intestinale è costituito da un singolo strato di cellule specializzate con una distinta polarità apicale-basale.
- Gli organoidi intestinali tridimensionali riproducono la struttura e la funzione dell'epitelio nativo, ma limitano l'accesso alla superficie apicale.
- L'accesso al lato apicale è essenziale per lo studio dell'assorbimento dei nutrienti e delle interazioni ospite-microbo/patogeno.
- Recenti progressi permettono la manipolazione della polarità degli organoidi e la creazione di colture a monolayer.
Scopo dello studio
- Sviluppare e ottimizzare metodi per accedere alla superficie apicale degli organoidi intestinali in vitro.
- Permettere lo studio di meccanismi biologici specifici della regione apicale.
- Sostenere la differenziazione e il mantenimento di tipi cellulari intestinali maturi in coltura.
Metodi Utilizzati
- Generazione di organoidi 3D apicali esterni rimuovendo la matrice extracellulare (ECM) e invertendo la polarità epiteliale.
- Manipolazione e lavaggio accurati degli organoidi per prevenire frammentazione durante la rimozione della ECM.
- Dissociazione degli organoidi in singole cellule mediante l'uso di tripsina-EDTA per la formazione di un monostrato.
- Seeding di singole cellule su inserti rivestiti per stabilire monostrati in coltura a interfaccia aria-liquido (ALI).
Risultati principali
- Sono stati generati con successo organoidi con orientamento apicale esterno, esponendo la superficie apicale al mezzo di coltura.
- Le colture in monocstrato hanno formato strati epiteliali confluenti con giunzioni strette e bordi a spazzola apicali.
- La coltura in condizioni di interfaccia aria-liquido ha favorito un’ulteriore differenziazione, inclusa la comparsa di cellule caliciformi (positive per MUC2).
- L'immunomarcatura ha confermato il corretto posizionamento dei marcatori di polarità (villogenia, ZO-1) sia nei sistemi 3D che 2D.
Conclusioni
- I metodi descritti forniscono strumenti affidabili per accedere alla faccia apicale dell'epitelio intestinale in vitro.
- Questi sistemi permettono studi dettagliati di funzioni specifiche della regione apicale, come l'assorbimento dei nutrienti e le interazioni tra ospite e patogeno.
- I protocolli supportano l'uso di organoidi come piattaforme per la medicina di precisione e per schermature ad alto rendimento.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'accesso alla superficie apicale degli organoidi intestinali rappresenta un collo di bottiglia fondamentale per la modellizzazione dell'assorbimento dei nutrienti e delle interazioni ospite-microbo nella scoperta di farmaci. I metodi descritti di inversione della polarità e di coltura in monocstrato permettono studi orientati specificamente, sostenendo una maggiore affidabilità predittiva nella validazione precoce dei bersagli e nella riduzione dei rischi meccanicistici. Queste piattaforme migliorano la continuità traslazionale e la scalabilità per screening ad alto rendimento e iniziative di medicina di precisione.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi di vie specifiche dell'estremità apicale rilevanti per la biologia intestinale e le malattie correlate.
- Consente una riduzione del rischio meccanicistica modellando l'assorbimento dei nutrienti e le interazioni ospite-patogeno in un sistema controllato.
- Supporta la validazione funzionale degli obiettivi consentendo la manipolazione diretta e l'osservazione dell'epitelio apicale.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce sistemi riproducibili e scalabili per lo screening ad alto rendimento di composti mirati alle funzioni apicali.
- Permette letture quantitative dell'integrità della barriera epiteliale e dell'attività dei trasportatori.
- Standardizza le condizioni del saggio per garantire riproducibilità tra studi e tra gruppi di ricerca.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i modelli in vitro alla polarità epiteliale e alla composizione dei tipi cellulari rilevanti per la malattia.
- Permette la scoperta e la validazione di biomarcatori consentendo l'accesso sia ai compartimenti apicali che a quelli basali.
- Migliora il valore predittivo per la valutazione preclinica dell'assorbimento dei farmaci e della risposta dell'ospite.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questi metodi di coltura posizionano i modelli di organoidi come un ponte dalla scoperta iniziale all'identificazione dei composti promettenti e alla validazione preclinica, sostenendo sia studi meccanicistici che screening scalabili.
- Biologia della scoperta: Consente la verifica di ipotesi relative a meccanismi specifici dell'estremità apicale e alla modulazione di vie metaboliche.
- Screening: Fornisce sistemi pronti per il saggio, specifici per l'orientamento, per la valutazione di composti.
- Analisi: Fornisce output quantitativi come l'integrità delle giunzioni strette e il posizionamento dei marcatori.
- Ricerca traslazionale: Mantiene la polarità e la differenziazione rilevanti per la malattia, al fine di allineare i biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma standardizzata e riutilizzabile per diverse applicazioni di ricerca e sviluppo.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica negli studi sull'epitelio intestinale.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità, la scalabilità e la standardizzazione tra i diversi gruppi di lavoro.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione e l'efficienza del capitale grazie a dati solidi nelle fasi iniziali.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce la priorizzazione e la progressione di programmi mirati all'intestino, adeguata al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura di organoidi e nella manipolazione della polarità.
- Richiede l'accesso a infrastrutture specializzate per la coltura cellulare e l'analisi mediante imaging.
- Necessita di una rigorosa standardizzazione tra i diversi gruppi di lavoro per garantire la riproducibilità.
- Potrebbe essere necessaria un'adeguata adattamento per diverse fonti di organoidi o modelli di malattia.
- È fondamentale un'accurata manipolazione per evitare il danneggiamento degli organoidi durante la rimozione della matrice extracellulare e la formazione del monostrato.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:32
Inversion of Intestinal Organoid Polarity
2:57
Dissociating Intestinal Organoids for Monolayer Generation and Culture
5:21
Results I: Analysis and Characterisation of the Morphology and Cell Polarity of Intestinal Organoids
6:27
Results II: Analysis and Characterisation of the Morphology and Differentiation Markers of Intestinal Monolayers
7:03
Conclusion
