Name: Gen ve Protein İfade Analizi için Murin İnterskapüler Kahverengi Yağ Dokusundan Kahverengi Adipositlerin İzolesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Öğrenin, enzimatik sindirim ve iyodiksanol yoğunluk ayrıştırması kullanarak fare interskapüler kahverengi yağ dokusundan saf kahverengi adiposit izolasyonunu. Bu yöntem, gen ve protein ifade analizleri için yüksek saflıkta hücre sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Z. Lin, Ulusal Sağlık Enstitüleri HL138454-01 ve Masonik Tıbbi Araştırma Enstitüsü fonları tarafından desteklenmiştir.

Tüm fareler patojensiz koşullarda tutuldu ve tüm prosedürler Masonik Tıbbi araştırma Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı. UCP1::Cre9 ve Rosa 26tdDomates fareleri hatları13 daha önce bildirilmişti. Tüm fareler 12 saatlik bir ışık / karanlık döngüsü ile oda sıcaklığında tutuldu.
1. Solüsyonların ve kahverengi yağ dokusunun (BAT) hazırlanması
<ol><li>15 mL santrifüj tüplerinde sindirim çözeltisi ve ayırma çözeltisi hazırlayın.</li>
	<li>10 mL BAT Sindirim çözeltisi: 10 mL steril fosfat tamponlu salin (PBS) için, BAT sindirim çözeltisi yapmak için 3.5 mg / mL Dispase II, 1 mg / mL Kollajenaz II ve 10 mM CaCl2 ekleyin.</li>
	<li>10 mL% 12 iyodiksanol çözeltisi (ayırma çözeltisi): % 12 iyodiksanol elde etmek için 1 mL 10x PBS, 2 mL% 60 iyodiksanol, 0.01 mL 1 M MgCl 2, 0.025 mL 1 M KCl, 0.1 mL 0.2 M etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ve 6.865 mL ddH2O karıştırın.</li>
	<li>CO2 doz aşımı ile bir yetişkin fareyi ötenazileştirin. Kısaca, fare kafesini min/min% 10-30 kafes hacmi yer değiştirme oranında% 100 CO2 ile doldurun. 5 dakika sonra, gözle görülür nefes alıp almadığınızı kontrol ederek ölümü onaylayın.</li>
	<li>Hayvanı disseke edin ve interskapular BAT'yi toplayın. WAT ve kas katmanlarını stereo mikroskop altında çıkarın.</li>
	<li>Yeterli sindirime sahip olmak için, her BAT lobunu ~ 3mm3 parçalara bölün ve metal bir karıştırma çubuğu ve 5 mL sindirim çözeltisi ile temiz bir 50 mL şişeye yerleştirin. Sindirime başlamadan önce, BAT ve sindirim tamponu içeren şişenin 1 saat boyunca buz üzerinde oturmasına izin verin. NOT: Aşağıdaki adımlarda, kahverengi adiposit izolasyonu için yaklaşık 80 mg BAT kullanılmıştır.</li>
</ol>2. BA'ların izolasyon prosedürü
<ol><li>Şişeyi bir inkübatörün içine yerleştirilmiş manyetik bir karıştırıcıya yerleştirin. Karıştırma hızını sırasıyla 60 rpm'ye ve inkübatörün sıcaklığını 35 ° C'ye ayarlayın. Sindirim yaklaşık 30 dakika sürecektir. BAT dilimleri sindirim sırasında karıştırıcı çubuğun etrafında kümeler oluşturursa, toplanan dokuları bozmak için 1 mL'lik bir pipet ucu kullanın.</li>
	<li>Temiz bir 50 mL santrifüj tüpünün üzerine 70 μm'lik bir süzgeç filtresi yerleştirin. Pipet, süzgeçten yaklaşık 4 mL hücre süspansiyonu sağlar. Süzgeci 4 mL% 12 iyodiksanol çözeltisi ile yıkayın. Hücreleri ve iyodiksanol çözeltisini karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin. Hücre karışımını iki berrak 5 mL polistiren test tüpüne aktarın. NOT: Sindirimin sonunda, sindirim çözeltisi bulanık olmalı ve yeterli sindirimi göstermelidir. Her seferinde taze sindirim çözeltisi kullanın. Hazırlandıktan sonra, sindirim çözeltisi 2 saat içinde kullanılmalıdır.</li>
	<li>Sindirim yeterli değilse, adım 2.2 ve 2.3'ü bir kez daha tekrarlayın.</li>
	<li>Ayırma çözeltisini ve BA'ları içeren şeffaf polistiren tüpleri 1 saat boyunca buz üzerinde bırakın. BA'lar üstte bir katman oluşturacaktır.</li>
	<li>Mikroskop incelemesi için izole edilmiş BA'ların 20 μL'sini çıkarın.</li>
</ol>3. BA'lardan RNA ve protein izolasyonu
<ol><li>BA'ları RNA ve protein izolasyonu için iki adet 1.7 mL mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin. BA tabakasını bozmadan aşırı iyodiksanol çözeltisini dikkatlice çıkarın.</li>
	<li>RNA, DNA ve proteini hücre çözeltisine aynı anda izole etmek için 1 mL Trizol ekleyin. Hücreleri lize etmek için yeterince karıştırın.</li>
	<li>Fazları ayırmak için 200 μL Kloroform ekleyin.</li>
	<li>Tüpü 4 ° C'de 10 dakika boyunca 9.981 x g santrifüj edin.</li>
	<li>Santrifüjlemeden sonra, RNA izolasyonu için sulu fazı kullanın. Bu çalışmada ters transkripsiyon için total RNA kullanılmış ve Gerçek Zamanlı PCR ile kantitatif RT-PCR gerçekleştirilmiştir. Astar dizileri Malzeme Tablosunda listelenmiştir.</li>
	<li>Organik fazın 300 μL'sini 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.</li>
	<li>Organik faza, 10 s için 2.5 hacimli% 100 etanol ve vorteks ekleyin.</li>
	<li>10 s için 200 μL 1-Bromo-3-kloropropan ve vorteks ekleyin.</li>
	<li>600 μL çift damıtılmış su ve 10 sn için vorteks ekleyin.</li>
	<li>Karışık çözeltinin oda sıcaklığında 10 dakika bekletin.</li>
	<li>4 °C'de 10 dakika boyunca 9.981 x g'de santrifüj. Bu adımda, aşamalar ayrılacaktır. Protein fazı orta tabakada lokalizedir.</li>
	<li>Üst sulu çözeltiyi çıkarın. Kalan çözeltiye 1 mL% 100 etanol ekleyin.</li>
	<li>10 dakika, 9.981 x g, 4 °C santrifüj. Santrifüjlemeden sonra, protein peleti oluşacaktır. Süper natantı atın.</li>
	<li>Peleti 1 mL% 100 etanol ile yıkayın.</li>
	<li>10 dakika, 9981 x g, 4 °C santrifüj. Peleti kurtarın ve süpernatanı atın.</li>
	<li>Peleti oda sıcaklığında 10 dakika boyunca hava ile kurulayın.</li>
	<li>Islak peletin ağırlığını ölçün. 20 μL/mg pelet oranında %1 SDS çözeltisi ekleyin.</li>
	<li>Tüpü ısıtılmış bir çalkalayıcıya koyarak peleti çözün. Sıcaklığı 55 ° C'ye ve hızı 11 x g'ye ayarlayın. Protein peletinin tamamen çözülmesi genellikle 5-10 dakika sürer. NOT: Çözünmüş proteinin konsantrasyonu BCA testi14 ile ölçülebilir.</li>
</ol>

<ol><li>Zwick, R. K., Guerrero-Juarez, C. F., Horsley, V., Plikus, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical%2C+physiological%2C+and+functional+diversity+of+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Anatomical, physiological, and functional diversity of adipose tissue.</a> Cell Metabolism. 27, 68-83 (2018).</li>
<li>Symonds, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+adipose+tissue+growth+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Scientifica%22%5BJournal%5D)">Brown adipose tissue growth and development.</a> Scientifica. 2013, Cairo. 305763(2013).</li>
<li>Giralt, M., Villarroya, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((White%2C+brown%2C+beige%2Fbrite%3A+Different+adipose+cells+for+different+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">White, brown, beige/brite: Different adipose cells for different functions.</a> Endocrinology. 154, 2992-3000 (2013).</li>
<li>Cannon, B., Nedergaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+adipose+tissue%3A+function+and+physiological+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Brown adipose tissue: function and physiological significance.</a> Physiological Reviews. 84, 277-359 (2004).</li>
<li>Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adipose+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Prostaglandins%2C+Leukotrienes+and+Essential+Fatty+Acids%22%5BJournal%5D)">The adipose organ.</a> Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids. 73, 9-15 (2005).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beige+adipocytes+are+a+distinct+type+of+thermogenic+fat+cell+in+mouse+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human.</a> Cell. 150, 366-376 (2012).</li>
<li>Cypess, A. M., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+fat+as+a+therapy+for+obesity+and+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Endocrinology%2C+Diabetes+and+Obesity%22%5BJournal%5D)">Brown fat as a therapy for obesity and diabetes.</a> Current Opinion in Endocrinology, Diabetes and Obesity. 17, 143-149 (2010).</li>
<li>Schoettl, T., Fischer, I. P., Ussar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+adipose+tissue+in+development+and+metabolic+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of adipose tissue in development and metabolic function.</a> Journal of Experimental Biology. 221, (2018).</li>
<li>Kong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRF4+is+a+key+thermogenic+transcriptional+partner+of+PGC-1%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">IRF4 is a key thermogenic transcriptional partner of PGC-1α.</a> Cell. 158, 69-83 (2014).</li>
<li>Lee, Y. H., Petkova, A. P., Konkar, A. A., Granneman, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+origins+of+cold-induced+brown+adipocytes+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Cellular origins of cold-induced brown adipocytes in adult mice.</a> The FASEB Journal. 29, 286-299 (2015).</li>
<li>Kim, W. -S., Park, H. -S., Sung, J. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pivotal+role+of+PDGF+and+its+receptor+isoforms+in+adipose-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Histology+and+Histopathology%22%5BJournal%5D)">The pivotal role of PDGF and its receptor isoforms in adipose-derived stem cells.</a> Histology and Histopathology. 30 (7), 793-799 (2015).</li>
<li>Hagberg, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+of+mouse+and+human+adipocytes+for+the+analysis+of+browning+and+cellular+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Report%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry of mouse and human adipocytes for the analysis of browning and cellular heterogeneity.</a> Cell Report. 24, 2746-2756 (2018).</li>
<li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13, 133-140 (2010).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical biochemistry. 150, 76-85 (1985).</li>
<li>Chey, S., Claus, C., Liebert, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+method+for+simultaneous+isolation+of+proteins+and+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Improved method for simultaneous isolation of proteins and nucleic acids.</a> Analytical Biochemistry. 411, 164-166 (2011).</li>
<li>Ford, T., Graham, J., Rickwood, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iodixanol%3A+A+nonionic+iso-osmotic+centrifugation+medium+for+the+formation+of+self-generated+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Iodixanol: A nonionic iso-osmotic centrifugation medium for the formation of self-generated gradients.</a> Analytical Biochemistry. 220, 360-366 (1994).</li>
<li>Kovacovicova, K., Vinciguerra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+senescent+cells+by+iodixanol+%28OptiPrep%29+density+gradient-based+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Proliferation%22%5BJournal%5D)">Isolation of senescent cells by iodixanol (OptiPrep) density gradient-based separation.</a> Cell Proliferation. 52, 12674(2019).</li>
<li>Lock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((versatile+manufacturing+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors+at+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">versatile manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors at scale.</a> Human Gene Therapy. 21, 1259-1271 (2010).</li>
<li>Marin, R. D., Crespo-Garcia, S., Wilson, A. M., Sapieha, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RELi+protocol%3A+Optimization+for+protein+extraction+from+white%2C+brown%2C+and+beige+adipose+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">RELi protocol: Optimization for protein extraction from white, brown, and beige adipose tissues.</a> MethodsX. 6, 918-928 (2019).</li>
<li>Sonna, L. A., Fujita, J., Gaffin, S. L., Lilly, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invited+Review%3A+effects+of+heat+and+cold+stress+on+mammalian+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Invited Review: effects of heat and cold stress on mammalian gene expression.</a> Journal of Applied Physiology. 92, 1725-1742 (2002).</li>
<li>Gensch, N., Borchardt, T., Schneider, A., Riethmacher, D., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+autonomous+myogenic+cell+populations+revealed+by+ablation+of+Myf5-expressing+cells+during+mouse+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Different autonomous myogenic cell populations revealed by ablation of Myf5-expressing cells during mouse embryogenesis.</a> Development. 135, 1597-1604 (2008).</li>
</ol>

Bu çalışmada, gen ve protein ekspresyon analizi için BA'ları izole etmek için yeni bir yöntem geliştirilmiştir.
Yayınlanmış bir BA izolasyon protokolünde, BA'ları zenginleştirmek için% 3 BSA çözeltisi kullanılmıştır12. Bununla birlikte, bu yayınlanmış protokol ile elde edilen zenginleştirilmiş BA'lar, protein ekspresyon analizi için doğrudan kullanılamamıştır. Bunun nedeni, BA çözeltisinde bulunan konsantre BSA'nın, takip eden protein ekstraksiyonuna müdahale etmesidir....

Hem fareler hem de insanlar iki tür yağ dokusuna sahiptir: beyaz yağ dokusu (WAT) ve kahverengi yağ dokusu (BAT)1. WAT enerjiyi beyaz adipositlerde trigliseritler şeklinde depolar ve BAT'ın kahverengi adipositleri (BA'lar) kimyasal enerjiyi ısı2 olarak dağıtır. Gelişimsel kökenlerine bağlı olarak, BA'lar embriyo gelişimi sırasında oluşan klasik BA'lar (cBA'lar) ve beyaz adipositler türevi BA'lar (stres koşulları altında beyaz adipositlerden dönüştürülen bej / brit hücreleri) olarak kategorize edilir3. BA'lar multilokülerdir ve termojenik protein ayrışma proteini 1'i (UCP1)4 eksprese eder. İnterskapüler BAT (iBAT) deposu, küçük memelilerde birincil cBA depolarından biridir5, bej hücreler ise WAT6 içinde dağılmıştır. 
Enerjiyi dağıtma doğası gereği, BA'lar obeziteyi azaltmak için terapötik bir hedef olarak çok dikkat çekmiştir7. Obeziteyi tedavi etmek amacıyla BA'lardan yararlanmak için, BA'ların işlevini, hayatta kalmasını ve işe alımını kontrol eden moleküler mekanizmaları anlamak önemlidir. BAT ve WAT gibi yağ dokuları heterojendir. Adipositler dışında, yağ dokuları endotel hücreleri, mezenkimal kök hücreler ve makrofajlar8 gibi birçok başka hücre tipi içerir. UCP1: Cre hat9 gibi farelerde aday genleri spesifik olarak tüketmek için genetik araçlar mevcut olsa da, BA'ları BAT veya WAT'tan arındırma teknikleri sınırlıdır ve bu da BA'ları tek hücreli tip düzeyinde incelemeyi zorlaştırmaktadır. Ek olarak, saf BA'lar elde edilmeden, BA'lar ve BA'lar olmayanlar arasındaki ilişki açıkça tanımlanmayacaktır. Örneğin, trombosit kaynaklı büyüme faktörü reseptörü alfa (PDGFRa), farklılaşmamış mezenkimal hücreler için bir belirteç olarak kullanılmıştır ve BAT'nin endotel ve interstisyel hücrelerinde eksprese edilir. Soğuk stresli BAT'ta, PDGFRα pozitif progenitör hücreler yeni BA10'a yol açar. PDGFRa, mezenkimal hücrelerin büyümesini ve çoğalmasını düzenleyen bir büyüme faktörü olan ligand PDGF'si tarafından aktive edilir11; Bununla birlikte, BA'ların PDGF'yi salgılayarak PDGFRα pozitif progenitör hücrelerin davranışını etkileyip etkilemediği açık değildir. 
Son zamanlarda, floresan ile aktive edilmiş hücre sıralamaya (FACS) dayanan bir BA izolasyon protokolü yayınlanmıştır12. Bu protokolde, BA'ları BA olmayanlardan ayırmak için% 3 sığır serum albümini (BSA) çözeltisi kullanıldı ve zenginleştirilmiş BA'lar FACS tarafından daha da saflaştırıldı. Bu protokolün uygulanması, hem ekipmana hem de FACS operasyon deneyimlerine dayanan FACS sürecinin gerekliliği ile sınırlıdır. Bu çalışmada, BA'ları BAT'tan izole etmek için yeni bir protokol geliştirilmiştir. Bu protokol tarafından izole edilen BA'lar doğrudan gen ve protein ekspresyon çalışmaları için kullanılabilir. Ayrıca, bu çalışmadan elde edilen veriler, BA'ların önemli bir PDGF kaynağı olduğunu göstermektedir.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Antikorlar< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü >Antijen< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Şirket< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Katalog< ></td><td></td></tr> <tr><td>PPAR ve gama;</td><td>LSBio</td><td>Ls-C368478</td><td></td></tr><tr><td>PDGFRa</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-398206</td><td></td></tr><tr><td>UCP1</td><td>Ar-Ge D sistemi</td><td>IC6158P</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Kimyasal ve çözeltiler</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz, Tip II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17101015</td><td></td></tr><tr><td>1-Bromo-3-kloropropan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B62404</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümini (BSA)&nbsp;</td><td>Goldbio</td><td>A-421-10</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür</td><td>Bio Basic</td><td>CT1330</td><td></td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>IBI Bilimsel</td><td>IB05040</td><td></td></tr><tr><td>Dispas II, proteaz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5693</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bio Basic</td><td>EB0107</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>IBI Bilimsel</td><td>IB15724</td><td></td></tr><tr><td>LiQuant Evrensel Yeşil qPCR Master Mix</td><td>LifeSct</td><td>LS01131905Y</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum Klorür Hekzahidrat</td><td>Boston BioProducts</td><td>P-855</td><td></td></tr><tr><td>OneScrip Plus cDNA Sentezi SuperMix</td><td>ABM</td><td>G454</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep (İodiksanol)</td><td>Cosmo Bio Türkiye</td><td>AXS-1114542</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10x)</td><td>Keson Laboratuvarları</td><td>PBL07</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x)</td><td>Keson Laboratuvarları</td><td>PBL06</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Test Kiti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Klorür</td><td>Boston BioProducts</td><td>P-1435</td><td></td></tr><tr><td>SimplyBlue güvenli Leke</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum dodesil sülfat (SDS)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>75746</td><td></td></tr><tr><td>Trizol reaktifi</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Primers</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gen adı (Tür)&nbsp;</td><td>İleri</td><td>Geri Pdgfra</td><td></td></tr><tr><td>(Fare)</td><td>CTCAGCTGTCTCCTCACAgG</td><td>CAACGCATCTCAGAGAAAAGG</td><td></td></tr><tr><td>Pdgfa (Fare)</td><td>TGTGCCCATTCGCAGGAAGAG</td><td>TTGGCCACCTTGACACTGCG</td><td></td></tr><tr><td>36B4(Fare)</td><td>TGCTGAACATCCCCCTTCTC</td><td>TCTCCACACACAATGCCAGGAC</td><td></td></tr><tr><td>Ucp1</td><td>ACTGCCACACCTCCAGTCATT</td><td>CTTTGCCTCACTCAGGATTGG</td><td></td></tr><<tr><td> güçlü > Ekipman< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Adı< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Şirket< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Uygulama< / güçlü ></td><td></td></tr> <tr><td>Anahtar BZ-X700</td><td>Keyence</td><td>Görüntüleme kahverengi adipositler</td><td></td></tr><tr><td>Manyetik karıştırıcı</td><td>VWR</td><td>Ayrışması BAT</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 6 Flex Gerçek Zamanlı PCR Sistemi</td><td>Uygulandı Biyosistem</td><td>Kantitatif PCR</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Fc Görüntüleme sistemi</td><td>LI-COR</td><td>Western blot görüntüleme</td><td></td></tr></tbody></table>

gen ve protein İfade analizi için murin İnterskapüler kahverengi yağ dokusundan kahverengi adipositlerin İzolesi

Isolating Brown Adipocytes from Murine Interscapular Brown Adipose Tissue for Gene and Protein Expression Analysis

Kahverengi yağ dokusu (BAT) memelilerde titremeyen termojenezden sorumludur ve kahverengi adipositler (BA'lar) BAT'ın fonksiyonel birimleridir. BA'lar hem multiloküler lipid damlacıkları hem de bol miktarda mitokondri içerir ve ayrışma proteini 1'i (UCP1) eksprese ederler. BA'lar, kökenlerine göre iki alt tipe ayrılır: embriyo kaynaklı klasik BA'lar (cBA'lar) ve beyaz adipositlerden türetilmiş BA'lar. Nispeten düşük yoğunlukları nedeniyle, BA'lar geleneksel santrifüjleme yöntemiyle BAT'tan izole edilemez. Bu çalışmada, gen ve protein ekspresyon analizi için BA'ları farelerden izole etmek için yeni bir yöntem geliştirilmiştir. Bu protokolde, yetişkin farelerden interskapuler BAT, Kollajenaz ve Dispase çözeltisi ile sindirildi ve ayrışmış BA'lar% 6 iyodiksanol çözeltisi ile zenginleştirildi. İzole BA'lar daha sonra RNA, DNA ve proteinin eşzamanlı izolasyonu için Trizol reaktifi ile lize edildi. RNA izolasyonundan sonra, lizatın organik fazı protein ekstraksiyonu için kullanıldı. Verilerimiz,% 6'lık iyotiksanol çözeltisinin, takip geni ve protein ekspresyon çalışmalarına müdahale etmeden BA'ları verimli bir şekilde zenginleştirdiğini göstermiştir. Trombosit kaynaklı büyüme faktörü (PDGF), mezenkimal hücrelerin büyümesini ve çoğalmasını düzenleyen bir büyüme faktörüdür. Kahverengi yağ dokusu ile karşılaştırıldığında, izole BA'lar Pdgfa'nın anlamlı derecede daha yüksek ekspresyonuna sahipti. Özetle, bu yeni yöntem, kahverengi adipositlerin biyolojisini tek bir hücre tipi seviyesinde incelemek için bir platform sağlar.

Kahverengi adiposit izolasyonu için interakapuler BAT'ın hazırlanması Kahverengi adipositler (BA'lar) izolasyon süreci Şekil 1A'da gösterilmiştir. BAT ve sindirim / ayırma çözeltilerinin hazırlanmasından izole edilmiş BA'ların elde edilmesine kadar tüm süreç yaklaşık 4 saat sürecektir.
Yetişkin farelerde, interskapuler bölgede bol miktarda BAT bulunur. Bu interskapuler BAT (iBAT) kas katmanları ve WAT ile kaplıdır (Şekil 1B...

Bu çalışmada, gen ve protein ekspresyon analizi için murin kahverengi adipositlerin izole edilmesinde yeni bir yöntem açıklanmaktadır.

Gen ve Protein İfade Analizi için Murin İnterskapüler Kahverengi Yağ Dokusundan Kahverengi Adipositlerin İzolesi

Brown adipose tissue (BAT) is responsible for non-shivering thermogenesis in mammals, and brown adipocytes (BAs) are the functional units of BAT. BAs ...

Kahverengi yağ dokusunun biyoloji yönlerini araştırmak için, saflaştırılmış kahverengi yağ boyutunu temizlemek önemlidir. Şu anda kahverengi yağ büyüklüğünde saflaştırma yapılmadı ve kütleler mevcut. Bu çalışmada, bu konuyu ele almak için basit bir protokol geliştirdik.Şimdi, bu protokol için bir beceri gereklidir. Diğer yöntemlerden çok daha az çalışma materyaline ihtiyaç duyar ve saflaştırılmış kahverengi yağ boyutu doğrudan gen ve protein ekspresyon analizi için kullanılabilir. Bu protokol, klasik kahverengi yağ boyutunun biyolojisini incelemek için yeni bir yöntem sağlar.Beyaz adipositlerin kahverengileşme sürecini incelemek için de uygulanabilir. Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir araştırma görevlisi olan Amanda olacak. BAT ve sindirim çözeltisi içeren şişeyi, 35 santigrat derecelik bir inkübatörde dakikada 60 dönüşte manyetik bir karıştırıcıya 30 dakika boyunca yerleştirerek başlayın.Karıştırıcı çubuğunun etrafındaki BAT dilimlerinin toplanmış doku kümelerini bozmak için bir mililitrelik pipet kullanın. Sindirimden sonra, 50 mililitrelik temiz bir santrifüj tüpünün üzerine 70 mikrometrelik bir süzgeç filtresi yerleştirin ve süzgeçten yaklaşık dört mililitre hücre süspansiyonu pipet yerleştirin. Daha sonra dört mililitre% 12 iyodiksanol çözeltisi ile yıkayın.Hücreleri iyotlaksanol çözeltisi ile karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin, ardından hücre karışımını iki şeffaf beş mililitrelik polistiren test tüpüne aktarın. Hücre karışımını içeren polistiren tüpleri bir saat boyunca buz üzerine yerleştirin ve BA'ların üstte bir tabaka oluşturmasına neden olun. Mikroskop incelemesi için izole edilmiş BA'ların 20 mikrolitresini çıkarın.RNA ve protein izolasyonu için, BA tabakasını iki adet 1.7 mililitrelik mikrocenterfuge tüpüne pipetleyin. Ardından, BA tabakasını bozmadan aşırı iyodiksonal çözeltiyi dikkatlice çıkarın. Daha sonra RNA, DNA ve proteini aynı anda izole etmek için hücre çözeltisine bir mililitre TRIzol ekleyin ve hücreleri lize etmek için yeterince karıştırın.Fazları ayırmak için, tüpe dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 9.981 G'de 200 mikrolitre kloroform ve santrifüj ekleyin. Santrifüjlemeden sonra, RNA izolasyonu için sulu fazı kullanın. Organik fazın 300 mikrolitresini iki mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 750 mikrolitre% 100 etanol ekleyin.10 saniye boyunca vorteksten sonra, 200 mikrolitre 1-Bromo-3-kloropropan ekleyin ve 10 saniye boyunca tekrar vorteks ekleyin. 10 saniye boyunca vortekslemeden önce 600 mikrolitre çift damıtılmış su ekleyin. Karışık çözeltinin oda sıcaklığında 10 dakika bekletin.Santrifüjlemeden sonra, dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 9.981 G ekleyin. Fazlar, orta tabakada lokalize olan protein fazı ile ayrılacaktır. Üst sulu çözeltiyi çıkarın ve kalan çözeltiye bir mililitre% 100 etanol ekleyin.Dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 9, 981 G'de santrifüjlemeyi takiben, süpernatantı atın ve peleti bir mililitre% 100 etanol ile yıkayın. Dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 9.981 G'de santrifüj. Süpernatanı çıkardıktan sonra, pelet oda sıcaklığında 10 dakika boyunca hava ile kurutun ve ıslak peletin ağırlığını ölçün.Pelet miligramı başına 20 mikrolitre oranında %1 SDS çözeltisi ekleyin. Tüpü beş ila 10 dakika boyunca 55 santigrat derece ve 11 G'de ısıtılmış bir çalkalayıcıya koyarak peleti tamamen çözün. Protokolde, BA'ları BAT'den ayırmak için %3 BSA içeren PBS kullanılmıştır.İzole edilen hücreler, içinde multiloküler lipid damlacıkları ile ahududu şeklindeydi ve tdTom pozitifti ve BA olduklarını doğruladı. Protein, geliştirilmiş bir GTPC protokolü ile BA'lardan izole edildi ve daha sonra bir SDS-PAGE jeli ile incelendi. BA örneğinde BSA ile ilişkili baskın bir bant gözlendi ve bu da protein ekstraksiyonuna girişimini düşündürdü.BSA girişimini önlemek için, tipik bir ahududu şekline sahip olan ve çok loküler lipit damlacıkları içeren BA'ların izolasyonu için% 6'lık bir iyodiksonal çözelti kullanıldı. Bu BA'lardan ekstrakte edilen proteinler SDS-PAGE jelinde iyi ayrıldı. Bu hücrelerin tdDomates pozitif olduğu bulunurken, peletten geri kazanılan hücreler belirgin lipit damlacıkları olmadan tdDomates negatifti, bu da BA'ların yağ olmayan hücrelerden etkili bir şekilde ayrıldığını düşündürmektedir.Gen ekspresyon analizinde, UCP1 ve PDGFA'nın mRNA seviyeleri izole BA'larda anlamlı derecede yüksekti. Ancak PDGFRA'nın mRNA'sı sadece BAT'de tespit edildi. UCP1 proteini izole BA'larda zenginleştirilmiş olarak bulundu.EDGFR alfa BAT'ta tespit edildi, ancak izole BA'larda tespit edilmedi. Bu sonuçlar, BA'ları izole etme yönteminin etkinliğini doğrulamakta ve izole edilen BA'ların gen ve protein ekspresyon çalışmaları için uygun olduğunu göstermektedir. Bu protokolü denerken, kahverengi yağ dokusunu ayrıştırmak ve sindirim döneminde doku kümelenmesi oluşumunu önlemek için taze sindirim tamponu kullanın.Bu yeni yöntem, kahverengi yağ dokusunun biyolojisini tek bir hücre musluk seviyesinde araştırmayı kolaylaştırır. Bu yöntemi uygulayarak, orijinal olarak yağsız hücrelerden kontaminasyon konusunda endişelenmeden, kahverengi adipositler gen ekspresyon programını hassas bir şekilde diseke eden saf kahverengi adipositlerle GN ve protein ekspresyon çalışmaları yapılabilir.

isolating-brown-adipocytes-from-murine-interscapular-brown-adipose

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Farelerde beyaz adipoz dokulardan izole İlköğretim beyaz preadipositlerden bej / brite hücrelerine ayırt edilebilir. Burada sunulan beyaz yağ "esmerleşme" moleküler düzenlenmesi okumak için güvenilir hücresel modeli sistemidir.

Bej / Brite Hücreler Stromal Vasküler Hücre İzolasyonu ve Farklılaşma

Nedeniyle obezite ve diğer yandaş arasındaki şiddetli ve negatif bağlantı, rol adipoz araştırma hastalığında oynadığı ve genel sağlık garantilidir. Biz izolasyon ve yerinde kullanarak adipoz çalışması için izin yağ depolarında eksizyonu ve in vitro yöntemler bir protokol mevcut.

Yerelleştirme, Kimlik ve Eksizyon Kemirgen Yağ depolarının

Burada verimli kromatin immunoprecipitation (ChIP) için bir protokol yüksek üretilen iş DNA sıralama (ChIP-seq) kahverengi yağ dokusundan izole bir fare (BAT), ardından açıklayın. Bu iletişim kuralı, hem histon değişiklikler eşleme ve genom çapında yerelleştirme sigara histon proteinleri ilgi içinde vivo, soruşturma için uygundur.

Kromatin Immunoprecipitation fare kahverengi yağ dokusunun

Bu yayın, çekirdeklerin olgun adipositlerden izole edilmesi, floresan-aktive sıralama ile arınma ve tek hücre düzeyinde transkripsiyon için bir protokol açıklar.

Tek Hücreli Genomik Uygulamalar için Yağ Dokusu Çekirdeklerinin İzolasyon

Bu protokol, adipojenik ve fibro-inflamatuar stromal hücre alt popülasyonlarını murin karın içi beyaz yağ dokusu (WAT) depolarından floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması veya immünmanyetik boncuk ayırma yoluyla izole etmek için teknik yaklaşımı açıklar.

Murin İntraabdominal Yağ Depolarından Adipojenik ve Fibroinflamatuar Stromal Hücre Alt Popülasyonlarının İzolasyonu

Bu rapor, birincil kahverengi ve beyaz preadipositlerin yenidoğan farelerden eşzamanlı izolasyonu için bir protokol açıklanmaktadır. İzole hücreler kültürde yetiştirilebilir ve tamamen olgun beyaz ve kahverengi adipozitlere farklılaşmaya teşvik edilebilir. Yöntem, kültürdeki primer yağ hücrelerinin genetik, moleküler ve fonksiyonel olarak karakterizeini sağlar.

Primer Beyaz ve Kahverengi Preadipositlerin Yenidoğan Farelerden İzolasyonu ve Farklılaşması

Preadipositler, yenidoğan farelerden alınan interskapular kahverengi yağ dokusunun stromal vasküler fraksiyonundan izole edilir ve lipid damlacıkları biriktiren, moleküler belirteçleri eksprese eden ve olgun kahverengi adipositlerin mitokondriyal morfolojisini gösteren hücrelere farklılaşır. Bu hücreler ayrıca immünofloresan ve transmisyon elektron mikroskobu ile analiz edilir.

Yenidoğan Farelerden İnterskapular Yağ Dokusunun Stromal Vasküler Fraksiyonundan Kahverengi Adipositlerin Farklılaşması ve Görüntülenmesi

Bu protokol, preadipositleri elde etmek ve in vitro adiposit diferansiyasyonunu sağlamak için stromal vasküler fraksiyonun (SVF) murin yağ dokusundan yarı otomatik izolasyonunu tanımlar. Kollajenaz sindirimi için bir doku ayrıştırıcısı kullanmak deneysel varyasyonu azaltır ve tekrarlanabilirliği arttırır.

Bir Doku Dissosiyatör Kullanarak Stromal Vasküler Fraksiyonun Murin Beyaz Yağ Dokusundan Yarı Otomatik İzolasyonu

Burada, murin supraklaviküler kahverengi yağ dokusunun diseksiyonu ve histolojik ve gen ekspresyon analizlerinin yapılması için pratik bir prosedür sunuyoruz.

Murin Supraklaviküler Kahverengi Yağ Dokusunun Diseksiyonu, Histolojik İşlemi ve Gen Ekspresyon Analizi

Bu yazıda, özel ligandlar lökositlerin kemotaktik yanıt belirlemek ve hücre yüzey reseptörleri ve sitozolik proteinler canlı hücre görüntüleme teknikleri kullanarak arasındaki etkileşimleri tanımlamak için metodolojiyi tanımlamaktadır.

Lökotrien B Gerçek zamanlı görüntüleme 4 Hücre aracılığı ile Göç ve β-arrestin BLT1 Etkileşimleri

Öğrenin, enzimatik sindirim ve iyodiksanol yoğunluk ayrıştırması kullanarak fare interskapüler kahverengi yağ dokusundan saf kahverengi adiposit izolasyonunu. Bu yöntem, gen ve protein ifade analizleri için yüksek saflıkta hücre sağlar.

Gen ve Protein İfade Analizi için Murin İnterskapüler Kahverengi Yağ Dokusundan Kahverengi Adipositlerin İzolesi

Daha fazla video keşfet