Name: Gestione avanzata del ritmo cardiaco applicando la fotostimolazione multi-sito optogenetica nei cuori murini (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Scopri la gestione avanzata del ritmo cardiaco mediante fotostimolazione optogenetica multi-sito su cuori murini intatti. Questo metodo consente il controllo regionale delle aritmie con mappatura ottica in tempo reale.

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Gli autori desiderano ringraziare Marion Kunze e Tina Althaus per il loro eccellente supporto tecnico durante gli esperimenti. La ricerca che ha portato ai risultati ha ricevuto finanziamenti dal Settimo programma quadro FP7/2007-2013 della Comunità europea con il numero di convenzione di sovvenzione HEALTH-F2-2009-241526. Il supporto è stato fornito anche dal Centro tedesco per la ricerca cardiovascolare, DZHK e.V. (progetto MD28), dal sito partner Goettingen, dalla Fondazione tedesca per la ricerca CRC 1002 (progetto C03) e dalla Max Planck Society. Questo lavoro è stato in parte supportato da BrainLinks-BrainTools, Cluster of Excellence finanziato dalla German Research Foundation (DFG, grant number EXC 1086).

Tutti gli esperimenti hanno seguito rigorosamente il regolamento sul benessere degli animali, in accordo con la legislazione tedesca, le disposizioni locali e in conformità con le raccomandazioni della Federazione delle associazioni europee di scienze degli animali da laboratorio (FELASA). La domanda di approvazione degli esperimenti sugli animali è stata approvata dall'autorità responsabile per il benessere degli animali e tutti gli esperimenti sono stati segnalati ai nostri rappresentanti per il benessere degli animali.
1. Preparazione dell'esperimento e materiali
<ol><li>Configurazione della mappatura ottica NOTA: la configurazione ottica e la configurazione elettrica sono illustrate nella Figura 1. Tutti i componenti utilizzati nella configurazione ottica ed elettrica sono elencati in dettaglio nella tabella dei materiali.<ol><li>Utilizzare LED 1 e LED 2 per l'induzione dell'aritmia e la defibrillazione di backup. Scegli LED ad alta potenza con una lunghezza d'onda λblu vicino a 475 nm, che è il picco della lunghezza d'onda di eccitazione di ChR26. Per restringere ulteriormente lo spettro ottico, utilizzare un filtro passa-banda da 470 ± 20 nm. NOTA: In questo lavoro, LED 1 e LED 2 hanno un flusso radiante tipico da 3,9 a 5,3 W, secondo la scheda tecnica20.</li>
		<li>Illuminare l'epicardio per la mappatura ottica con un LED rosso ad alta potenza (LED 3 in Figura 1), che emette luce con una lunghezza d'onda centrale di λrosso = 625 nm e un flusso radiante di 700 mW21. La luce rossa viene filtrata con un filtro passa banda 628 ± 20 nm e riflessa da uno specchio dicroico a passaggio lungo (DM) con una lunghezza d'onda di taglio di λDM = 685 nm.</li>
		<li>Utilizzare un filtro di emissione con λfiltro-camma = 775 ± 70 nm davanti all'obiettivo della telecamera per registrare solo l'emissione di fluorescenza dell'attività cardiaca. Utilizzare un obiettivo veloce adatto per applicazioni in condizioni di scarsa illuminazione. NOTA: La frequenza di fibrillazione di un cuore di topo varia da 20 a 35 Hz; pertanto, utilizzare una fotocamera abbastanza veloce per registrare con una frequenza da 1 a 2 kHz o anche superiore.</li>
	</ol></li>
	<li>Array di micro-LED NOTA: Gli array di micro-LED qui applicati sono realizzati utilizzando l'elaborazione di microsistemi come ulteriormente dettagliato altrove16,17.<ol><li>Spin coat uno strato di poliimmide (PI) spesso 5 μm su substrati di silicio da 4 pollici (lucidati su un solo lato, spessi 525 μm).</li>
		<li>Polimerizzare questo strato di PI ad una temperatura massima di 450 °C in atmosfera di azoto. Mantenere costante la temperatura massima per 10 minuti.</li>
		<li>Depositare e modellare un fotoresist di inversione dell'immagine (PR) utilizzando la litografia ultravioletta (UV) e lo sputter depositano uno strato di platino sottile (Pt) di 250 nm.</li>
		<li>Addensare questa metallizzazione a base di Pt galvanizzando uno strato di oro (Au) spesso 1 μm con il PR modellato che funge da strato di mascheratura.</li>
		<li>Prima di rivestire in rotazione un secondo strato di PI, esporre il wafer con il suo primo strato PI e la metallizzazione elettrolitica Au a un plasma di ossigeno che attiva chimicamente la superficie dello strato PI.</li>
		<li>Polimerizzare nuovamente il secondo strato PI a 450 °C, applicare la litografia UV per modellare uno strato PR e aprire i pad di contatto dell'array per i chip micro-LED e il circuito stampato (PCB) di interfacciamento mediante incisione ionica reattiva (RIE) utilizzando il PR modellato come strato di mascheramento. NOTA: in questa fase del processo RIE, si consiglia di applicare 200 W e 100 W per 10 e 30 minuti, rispettivamente, per definire le aperture del pad di contatto e la forma esterna dell'array di micro-LED bidimensionale (2D).</li>
		<li>Striscia il PR usando solventi e incisione al plasma. Ispessire ulteriormente i cuscinetti di contatto galvanizzando un ulteriore strato d'oro spesso 6 μm.</li>
		<li>Collegare i chip micro-LED ai pad di contatto utilizzando un bonder flip-chip.</li>
		<li>Attivare la superficie PI in un plasma di ossigeno e riempire i chip micro-LED con un adesivo privo di solventi. Polimerizzare quindi l'adesivo per 12 h a 120 °C.</li>
		<li>Per incapsulare i chip micro-LED, eseguire un altro trattamento al plasma con Argon e applicare manualmente un sottile strato di fluoropolimero. Pre-polimerizzare questo strato a 80 °C per 1 ora.</li>
		<li>Applicare manualmente il silicone come strato finale di incapsulamento dopo aver esposto l'array di micro-LED a un plasma di ossigeno, utilizzato per migliorare l'adesione del silicio allo strato di fluoropolimero sottostante. Polimerizzare lo strato di silicone a 80 °C e 180 °C per 1 h ciascuno. Queste fasi finali di polimerizzazione polimerizzano completamente anche lo strato di fluoropolimero.</li>
		<li>Saldare i pad di contatto del substrato PI a un circuito stampato che trasporta connettori a striscia per l'interconnessione dell'array a una strumentazione esterna. Coprire i cuscinetti di saldatura sul PCB usando un adesivo.</li>
	</ol></li>
	<li>Configurazione elettrica<ol><li>Utilizzare elettrodi adatti per la registrazione di un elettrocardiogramma (ECG), ad esempio elettrodi di argento/cloruro d'argento o elettrodi monofasici con potenziale d'azione (MAP) e un amplificatore ECG per monitorare continuamente l'attività elettrica del cuore. Inoltre, utilizzare un dispositivo di acquisizione appropriato (AD) per registrare tutti i segnali elettrici ottenuti.</li>
		<li>Scegli un driver adatto per i LED ad alta potenza (LED 1, LED 2 e LED 3), in grado di gestire la corrente massima applicata a ciascun dispositivo. Utilizzare un generatore di funzioni arbitrarie (AFG) per controllare con precisione l'uscita dei driver LED.</li>
		<li>Utilizzare un driver LED multicanale per controllare la corrente che scorre attraverso l'array di micro-LED. Un AFG con uscite multiple è adatto anche per questo compito. NOTA: Si consiglia di scegliere driver LED che limitino la corrente alla corrente massima del micro-LED, altrimenti i diodi potrebbero danneggiarsi. Un esempio di driver micro-LED multicanale è descritto in un altro lavoro18. Se necessario, AFG o qualsiasi altro driver LED potrebbe essere collegato a un computer per controllare a distanza le impostazioni micro-LED. In questo caso, collegare il driver LED al computer con il protocollo di comunicazione di propria scelta, ad esempio General Purpose Interface Bus (GPIB) o una connessione seriale.</li>
	</ol></li>
</ol>   

2. Procedure sperimentali
<ol><li>Preparazione della soluzione<ol><li>Preparare la soluzione di Tyrode: 130 mM NaCl, 4 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 24 mM NaHCO3, 1,8 mM CaCl 2, 1,2 mM KH2 PO4, 5,6 mM glucosio, 0,1% BSA/albumina.</li>
		<li>Preparare la soluzione di Tyrode a basso K+: la soluzione di Tyrode a basso K+ viene prodotta allo stesso modo della soluzione di Tyrode normale, tranne per il fatto che viene aggiunta solo la metà della quantità di KCl (2 mM invece di 4 mM KCl). NOTA: Per un esperimento della durata di 3 ore, di solito sono sufficienti 2-3 L di Tyrode Low-K+ (miscelati inoltre con Blebbistatin (Passo 2.1.5) se viene eseguita la mappatura ottica) e 1-2 L di Tyrode normale.</li>
		<li>Aggiungere Pinacidil alla soluzione di Low-K+ Tyrode per facilitare il processo di induzione dell'aritmia, come descritto alpunto 22, per ottenere una concentrazione di 100 mM. Indossare guanti protettivi da laboratorio quando si maneggia Pinacidil.</li>
		<li>Preparare 1 mL di 50 μM DI-4-ANBDQPQ con la soluzione normale di Tyrode. Proteggere il colorante dalla luce per evitare il fotosbiancamento.</li>
		<li>Preparare una soluzione madre 10 mM di blebbistatina. Per la mappatura ottica, miscelare Blebbistatin con la soluzione 100 mM di Pinacidil-Tyrode (Fase 2.1.3) per ottenere una soluzione da 5 μM. Indossare guanti protettivi da laboratorio quando si maneggia Blebbistatin. NOTA: Tenere da parte sia il colorante che la soluzione di blebbistatina fino all'inizio della mappatura ottica.</li>
	</ol></li>
	<li>Perfusione di Langendorff NOTA: La configurazione è composta da due serbatoi per le due soluzioni Tyrode. Sono collegati a una trappola a bolle tramite tubi con rubinetti a tre vie. Il cuore viene successivamente attaccato alla trappola a bolle da un connettore Luer lock, e viene quindi sospeso in un bagno d'acqua esagonale. Il bagno d'acqua è, a sua volta, collegato a un contenitore di rifiuti per raccogliere la soluzione di Tyrode usata.<ol><li>Pulire tutti i tubi prima di ogni esperimento con acqua completamente demineralizzata.</li>
		<li>Aerare entrambe le soluzioni di Tyrode con Carbogen (5% CO 2 e 95% O2) per 30 minuti a temperatura ambiente prima dell'inizio dell'esperimento. Regolare il valore pH delle soluzioni di Tyrode a 7,4 con NaOH.</li>
		<li>Riempire 500 mL di ogni soluzione di Tyrode nel serbatoio corrispondente e disaerare i tubi e la trappola a bolle facendo passare la soluzione di Tyrode attraverso il sistema di perfusione fino a quando non si vedono più bolle d'aria intrappolate nei tubi o nella trappola a bolle.</li>
		<li>Continuare ad aerare le soluzioni di Tyrode durante l'intero esperimento nei serbatoi con Carbogen per garantire che il pH del perfufato rimanga stabile più tardi durante la perfusione.</li>
		<li>Riscaldare il sistema di perfusione a 37 °C con una pompa di calore ad acqua. Mantenere costante la temperatura del perfusto all'interno del bagno d'acqua utilizzando un elemento riscaldante aggiuntivo come un cavo riscaldante impermeabile. NOTA: Durante l'esperimento, è fondamentale riempire i serbatoi del Tyrode prima che si svuotino. Altrimenti, le bolle d'aria possono entrare nel cuore, che può ostruire i vasi e portare all'ischemia.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione del mouse<ol><li>Iniettare per via sottocutanea 0,1 ml di 500 cioè eparina 30 minuti prima della procedura di isolamento cardiaco.</li>
		<li>Riempire una capsula di Petri da 6 cm e una siringa da 2 ml con la soluzione di Tyrode ghiacciata. Posto sotto il microscopio stereoscopico.</li>
		<li>Eseguire l'anestesia a breve termine dei topi con un ambiente saturo di isoflurano per 2 minuti e la lussazione cervicale immediata in seguito. NOTA: Al fine di verificare un'anestesia sufficiente è assolutamente necessario controllare il riflesso inter-dito negativo.</li>
		<li>Aprire il torace, rimuovere il cuore, come descritto altrove23, e metterlo nella capsula di Petri da 6 cm con la soluzione ghiacciata di Tyrode. Il battito cardiaco sarà diminuito a causa del calo di temperatura.</li>
		<li>Eseguire la preparazione fine al microscopio stereoscopico, come dettagliato altrove23. Attaccare l'aorta sull'ago smussato e fissare la nave con materiale di sutura.</li>
		<li>Come controllo, iniettare la soluzione ghiacciata di Tyrode attraverso l'ago nel cuore e controllare che il cuore sia montato saldamente. Questo passaggio risciacqua anche il sangue rimanente dal cuore.</li>
		<li>Trasferire il cuore montato al sistema di perfusione. Assicurarsi che il perfusato scorra per evitare che l'aria entri nel cuore mentre si collega l'ago con la trappola a bolle. Controllare che il cuore sia coperto con la soluzione di Tyrode a bagnomaria. I passaggi 2.3.4, 2.3.5 e 2.3.7 sono illustrati nella Figura 2.</li>
		<li>Assicurati che il cuore inizi a battere entro pochi minuti. Lasciare che il cuore si adatti alla configurazione della perfusione per 15-20 minuti, quindi passare alla soluzione di Tyrode a basso K+ con Pinacidil (Fase 2.1.3) rispettivamente alla soluzione di Tyrode a basso K+ con Pinacidil e Blebbistatina (Fase 2.1.5) se deve essere eseguita la mappatura ottica.</li>
	</ol></li>
	<li>Induzione di aritmia e defibrillazione ottica<ol><li>Posizionare uno degli elettrodi ECG il più vicino possibile alla superficie del cuore per garantire una buona qualità del segnale. Sospendere il secondo elettrodo ECG nella soluzione di Tyrode. Assicurarsi che l'ECG acquisito venga registrato dall'AD di scelta.</li>
		<li>Posizionare l'array di micro-LED sull'area di interesse dello studio, ad esempio, sul ventricolo sinistro.</li>
		<li>Cambiare la perfusione in Tyrode a basso K+ con Pinacidil e perfondere il cuore per 15-30 minuti.</li>
		<li>Per indurre l'aritmia, illuminare il cuore con LED 1 e LED 2 con un treno di 20-50 impulsi luminosi con una frequenza f ind da 25 a 35 Hz, durata dell'impulso Wind da 2 a 15 ms e intensità luminosa LIopt_ind di 2,8 mW mm-2.</li>
		<li>Ripetere il processo fino a quando non viene indotta l'aritmia. NOTA: Le aritmie sono facili da identificare nel segnale ECG perché la frequenza e la morfologia del segnale differiscono dal normale ritmo sinusale. Se l'aritmia termina entro i prossimi 5 secondi, classificarla come auto-terminata e iniziare un nuovo tentativo di induzione.</li>
		<li>Una volta rilevata visivamente un'aritmia prolungata, applicare una raffica di impulsi con diverse larghezze W def e frequenze fdef, utilizzando tre, sei o nove micro-LED dell'array a unimpulso di corrente pulsata I di 15 mA che produce un'intensità luminosa LIμLED = 33,31 ± 2,05 mW mm-2.</li>
		<li>Se l'aritmia continua dopo cinque prove di defibrillazione basate su array di micro-LED, classificare il tentativo come non riuscito e avviare la defibrillazione di backup.</li>
		<li>Per la defibrillazione di backup, utilizzare LED 1 e LED 2 utilizzando gli stessi parametri di temporizzazione impostati per l'array di micro-LED. NOTA: Poiché il cuore è esposto a stress ischemico e metabolico durante l'intero periodo sperimentale, è possibile che i tentativi di interruzione dell'aritmia non abbiano successo anche con la defibrillazione di backup. Ogni volta che ciò accade, cambiare la soluzione di perfusione con la normale Tyrode e lasciare che il cuore si riprenda per 5-10 minuti. Quando l'ECG ritorna al ritmo sinusale, ripetere nuovamente il protocollo dal passaggio 2.4.3.</li>
	</ol></li>
	<li>Mappatura ottica<ol><li>Perfondere il cuore con la soluzione di blebbistatina preparata al punto 2.1.5 e attendere fino a quando non si verifica il disaccoppiamento meccanico. Ciò si ottiene quando il cuore smette di battere, ma un segnale ECG è ancora misurabile. NOTA: Miscelando la soluzione di blebbistatina alla concentrazione menzionata e mantenendo il cuore perfuso con questa soluzione mantiene l'attività meccanica cardiaca disaccoppiata dall'attività elettrica durante l'intero esperimento.</li>
		<li>Somministrare il colorante di tensione da 1 mL DI-4-ANBDQPQ (preparato al punto 2.1.4) come bolo nella trappola a bolle della perfusione di Langendorff. Attendere da 5 a 10 minuti per consentire al colorante di perfondere uniformemente il cuore. NOTA: Evitare il fotosbiancamento del colorante spegnendo la luce rossa ogni volta che non viene effettuata alcuna registrazione. Se il rapporto segnale/rumore della registrazione diventa troppo piccolo (il segnale acquisito è troppo rumoroso), ripetere i passaggi 2.1.4 e 2.5.2.</li>
		<li>Mettere a fuoco la fotocamera sulla superficie cardiaca, accendere LED 3 e applicare una potenza ottica di 1,27 mW mm-2 .</li>
		<li>Spegni le luci del laboratorio e inizia a registrare. Assicurarsi che venga acquisito un segnale ottico confrontando la frequenza del segnale ottenuto con la frequenza dell'ECG registrato. Ciò garantisce che il segnale ottico ottenuto sia puramente correlato all'attività elettrica del cuore. NOTA: Poiché la luce di fluorescenza emessa dal colorante è molto settimanale, la mappatura ottica viene eseguita in una stanza buia. Ciò evita interferenze di segnale da qualsiasi altra fonte di luce.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Un trattamento efficace delle tachiaritmie cardiache è la chiave per la terapia cardiaca. Tuttavia, i meccanismi biofisici alla base dell'inizio, della perpetuazione e della cessazione dell'aritmia non sono completamente compresi. Pertanto, la ricerca cardiaca mira a ottimizzare la terapia con scosse elettriche verso una cessazione più delicata delle aritmie, aumentando così la qualità della vita dei pazienti 28,29,30,31.</...

Le prime indagini sulle dinamiche spazio-temporali durante l'aritmia hanno rivelato che i complessi schemi elettrici durante la fibrillazione cardiaca sono guidati da onde di eccitazione rotanti simili a vortici1. Questa scoperta ha fornito nuove informazioni sui meccanismi alla base delle aritmie, che hanno poi portato allo sviluppo di nuove terapie di terminazione elettrica basate sull'eccitazione multi-sito del miocardio 2,3,4. Tuttavia, i trattamenti che utilizzano la stimolazione del campo elettrico non sono locali e possono innervare tutte le cellule eccitabili circostanti, incluso il tessuto muscolare, causando danni cellulari e tissutali, nonché dolore intollerabile. A differenza delle terapie elettriche, gli approcci optogenetici forniscono una tecnica specifica e protettiva dei tessuti per evocare potenziali d'azione dei cardiomiociti con elevata precisione spaziale e temporale. Pertanto, la stimolazione optogenetica ha il potenziale per un controllo minimamente invasivo dei modelli di attivazione caotica durante la fibrillazione cardiaca.
L'introduzione della canalistica ionica sensibile alla lucerhodopsin-2 (ChR2) nelle cellule eccitabili tramite manipolazione genetica 5,6,7, ha permesso la depolarizzazione del potenziale di membrana delle cellule eccitabili utilizzando la fotostimolazione. Sono state sviluppate diverse applicazioni mediche, tra cui l'attivazione delle reti neuronali, il controllo dell'attività cardiaca, il ripristino della vista e dell'udito, il trattamento delle lesioni del midollo spinale e altre 8,9,10,11,12,13,14. L'applicazione di ChR2 in cardiologia ha un potenziale significativo grazie al suo tempo di risposta al millisecondo15, rendendolo adatto per il controllo mirato della dinamica cardiaca aritmica.
In questo studio, viene mostrata la fotostimolazione multi-sito di cuori intatti di un modello murino transgenico. In sintesi, una linea di topi transgenici alfa-MHC-ChR2 è stata istituita nell'ambito del Settimo Programma Quadro FP7/2007-2013 della Comunità Europea (HEALTH-F2-2009-241526) e gentilmente fornita dal Prof. S. E. Lehnart. In generale, i maschi adulti transgenici C57/B6/J, che esprimono Cre-ricombinasi sotto controllo dell'alfa-MHC, sono stati accoppiati per accoppiarsi con B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm27.1(CAG-COP4*H134R/tdTomato)Hye/J. Poiché la cassetta STOP cardiaca è stata eliminata nella seconda generazione, la prole ha mostrato un'espressione stabile di MHC-ChR2 ed è stata utilizzata per mantenere le colonie fotosensibili cardiache. Tutti gli esperimenti sono stati condotti con topi adulti di entrambi i sessi ad un'età di 36 - 48 settimane. L'illuminazione è ottenuta utilizzando un array di micro-LED 3 x 3, fabbricato come descritto in16,17 tranne per il fatto che l'alloggiamento a base di silicio e le fibre corte di vetro ottico non sono implementati. Il suo primo utilizzo in un'applicazione cardiaca si trova in18. Un array lineare di micro-LED basato su una tecnologia di fabbricazione simile è stato applicato come sonda penetrante per la stimolazione cardiaca19. I micro-LED sono disposti in un array 3 x 3 con un passo di 550 μm, fornendo sia un'elevata risoluzione spaziale che un'elevata potenza radiante su un'area molto piccola. Gli autori dimostrano in questo lavoro una versatile fotostimolazione locale multi-sito che può aprire la strada allo sviluppo di nuovi metodi di terapia anti-aritmica.
Il seguente protocollo sperimentale prevede una perfusione retrograda di Langendorff ex vivo, per la quale l'aorta cannulata funge da ingresso di perfusione. A causa della pressione di perfusione applicata e della contrazione cardiaca, il perfusato scorre attraverso le arterie coronarie, che si diramano dall'aorta. Nel lavoro presentato, il cuore viene perfuso utilizzando una configurazione a pressione costante ottenuta elevando i serbatoi di perfuso a 1 m di altezza, equivalente a 73,2 mmHg, che produce una portata di 2,633 ± 0,583 ml / min. Due tipi di soluzione di Tyrode sono usati come perfufuto durante l'esperimento. La soluzione di Regular Tyrode supporta un ritmo sinusale stabile, mentre la soluzione di Low-K+ Tyrode viene miscelata con Pinacidil per consentire l'induzione dell'aritmia nei cuori murini. L'utilizzo di un bagno d'acqua esagonale consente l'osservazione del cuore attraverso sei diverse finestre planari, consentendo l'accoppiamento di più componenti ottici con meno distorsione per rifrazione.

<table><tbody><tr><td>Componenti</td><td></td><td></td><td></td>chimici</tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>TargetMol</td><td>T6038</td><td>10 mM soluzione madre</td></tr><tr><td>BSA/Albumina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4919</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td>CaCl2</td></tr><tr><td>Carbogen</td><td>Westfalen</td><td></td><td>50 l flacone</td></tr><tr><td>DI-4-ANBDQPQ</td><td>AAT Bioquest</td><td>21499</td><td>Colorante per mappatura ottica</td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9434</td><td></td></tr><tr><td>C6H12O6 Eparina</td><td>LEO Pharma</td><td></td><td>Eparina-Natrium Leo 25.000 I.E./5 ml, disponibile solo su prescrizione</td></tr><tr><td>medica Acido cloridrico</td><td>Merck</td><td>1.09057.1000</td><td>HCl, 1 M soluzione madre</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>CP Pharma</td><td></td><td>1 ml/ml, disponibile solo su prescrizione</td></tr><tr><td>Magnesio Cloruro</td><td>Merck</td><td>8.14733.0500</td><td>MgCl2</td></tr><tr><td>Fosfato monopotassico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30407</td><td>KH2PO4</td></tr><tr><td>Pinacidil monoidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P154-500mg</td><td>10 mM soluzione madre</td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td>KCl</td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>NaHCO3</td></tr><tr><td>Sodio Cloruro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Merck</td><td>1.09137.1000</td><td>NaOH, 1 M soluzione madre</td></tr><tr><td>Configurazione elettrica</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biopac MP150</td><td>Biopac Systems</td><td>MP150WSW</td><td>sistema di acquisizione e analisi dei dati</td></tr><tr><td>ECG personalizzato, ECG100C alternativa</td><td>Biopac Systems</td><td>ECG100C</td><td>Amplificatore per elettrocardiogramma</td></tr><tr><td>Riscaldatore a bagno d'acqua su misura con cavo scaldante</td><td>Sistema di riscaldamento RMS</td><td>HK-5,0-12</td><td>Cavo scaldante 120W</td></tr><tr><td>Driver LED esagonali a bagno</td><td></td><td></td><td></td>d'acqua</tr><tr><td>Alimentatore</td><td>Thorlabs</td><td>KPS101</td><td>15 V, 2,4 A Alimentatore con connettore jack da 3,5 mm per un K-Cube o T.</td></tr><tr><td>Driver LED LEDD1B</td><td>Driver LED Thorlabs</td><td>LEDD1B</td><td>T-Cube, corrente di pilotaggio massima 1200 mA</td></tr><tr><td>MAP, elettrodo ECG</td><td>Hugo Sachs Elektronik</td><td>BS4&nbsp; 73-0200</td><td>Elettrodo mini-ECG per cuori isoaltici</td></tr><tr><td>Driver micro-LED, ad es. AFG</td><td>Agilent Instruments</td><td>A-2230</td><td>Generatore di funzioni arbitrarie (AFG)</td></tr><tr><td>Generatore di segnali</td><td>Agilent Instruments</td><td>A-2230</td><td>AFG</td></tr><tr><td>micro-LED Array Componenti</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colla epossidica</td><td>Tecnologia epossidica</td><td>EPO-TEK 353ND</td><td>Epossidica</td></tr> <tr><td>bicomponenteFluoropolimero</td><td>&nbsp; Asahi Glass Co., Ltd.</td><td>Cytop 809M</td><td>Fluoropolimero ad alta trasparenza</td></tr><tr><td>Fotoresist di inversione di immagine</td><td>Merck KGaA</td><td>AZ 5214E</td><td>Resistenza di inversione di immagine per</td></tr><tr><td>chip LED</td> ad alta risoluzione <td> Cree Inc.</td><td>C460TR2227-S2100</td><td>Fotoresist micro-LED blu</td></tr><tr><td></td><td>Merck KGaA</td><td>AZ 9260</td><td>Fotoresist positivi spessi</td></tr><tr><td>Poliimmide</td><td>UBE Industries Ltd.</td><td>U-Varnish S</td><td>Soluzione di poliimmide</td></tr><tr><td>Silicone</td><td>NuSil Technology LLC</td><td>MED-6215</td><td>Elastomero siliconico a bassa viscosità</td></tr><tr><td>Adesivo senza solventi</td><td>John P. Kummer GmbH</td><td>Epo-Tek 301-2</td><td>Resina epossidica a bassa viscosità</td></tr><tr><td>Mappatura ottica Filtro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>blu</td><td>Chroma Technology Corporation</td><td>ET470/40x</td><td>Filtro</td></tr> <tr>di eccitazione blu<td>Fotocamera</td><td>Fotometrica</td><td>Cascade 128+</td><td>Telecamera EMCCD ad alte prestazioni</td></tr><tr><td>Obiettivo della fotocamera</td><td>Navitar</td><td>DO-5095</td><td>Gli obiettivi a lunghezza focale fissa ad alta velocità Navitar funzionano con telecamere CCD e CMOS</td></tr><tr><td>Specchio dicroico</td><td>Semrock</td><td>FF685-Di02-25x36</td><td>685 nm edge BrightLine&reg; splitter dicroico standard a epifluorescenza a bordo singolo</td></tr><tr><td>Filtro Emmision</td><td>Semrock</td><td>FF01-775/140-25</td><td>775/140 nm BrightLine® filtro passa-banda a banda singola</td></tr><tr><td>Dissipatore di calore</td><td>Advanced Thermal Solutions</td><td>ATSEU-077A-C3-R0</td><td>Dissipatori di calore - LED STAR Dissipatore di calore, diametro 45 mm, 68 mm, nero/argento, piastra di base non filettata</td></tr><tr><td>Hardware LED 1 e LED 2</td><td>LED Engin Osram</td><td>LZ4-00B208</td><td>LED ad alta potenza - Colore singolo Blu, 460 nm 130 lm, 700mA</td></tr><tr><td>LED 3</td><td>Thorlabs</td><td>M625L3</td><td>625 nm, 700 mW (min) LED montato, 1000</td></tr><tr><td>mA Lenti</td><td>LED Engin Osram</td><td>LLNF-2T06-H</td><td>Lenti di illuminazione a LED Gruppi LZ4 LENS NARROW FLOOD BEAM</td></tr><tr><td>Fotodiodo per misuratore di potenza</td><td>Thorlabs</td><td>S120VC</td><td>Fotodiodo standard Sensore di potenza</td></tr><tr><td>Misuratore di potenza</td><td>Thorlabs</td><td>PM100D</td><td>Contatore compatto di potenza ed energia</td></tr><tr><td>Filtro rosso</td><td>Semrock</td><td>FF02-628/40-25</td><td>BrightLine&reg; filtro passa-banda a banda singola</td></tr></tbody></table>

gestione avanzata del ritmo cardiaco applicando la fotostimolazione multi-sito optogenetica nei cuori murini

Advanced Cardiac Rhythm Management by Applying Optogenetic Multi-Site Photostimulation in Murine Hearts

Le tachiaritmie ventricolari sono una delle principali cause di mortalità e morbilità in tutto il mondo. La defibrillazione elettrica con scosse elettriche ad alta energia è attualmente l'unico trattamento per la fibrillazione ventricolare pericolosa per la vita. Tuttavia, la defibrillazione può avere effetti collaterali, tra cui dolore intollerabile, danno tissutale e peggioramento della prognosi, indicando una significativa necessità medica per lo sviluppo di strategie di gestione del ritmo cardiaco più delicate. Oltre agli approcci elettrici che riducono l'energia, l'optogenetica cardiaca è stata introdotta come un potente strumento per influenzare l'attività cardiaca utilizzando canali ionici a membrana sensibili alla luce e impulsi luminosi. Nel presente studio, verrà descritto un metodo robusto e valido per la fotostimolazione di successo di cuori murini intatti perfusi di Langendorff basato sulla stimolazione multi-sito applicando un array 3 x 3 di diodi micro emettitori di luce (micro-LED). La mappatura ottica simultanea delle onde di tensione della membrana epicardica consente di studiare gli effetti della stimolazione regionale-specifica e valuta l'attività cardiaca appena indotta direttamente in loco. I risultati ottenuti mostrano che l'efficacia della defibrillazione dipende fortemente dai parametri scelti per la fotostimolazione durante un'aritmia cardiaca. Sarà dimostrato che l'area illuminata del cuore svolge un ruolo cruciale per il successo della terminazione e come è possibile ottenere il controllo mirato dell'attività cardiaca durante l'illuminazione per modificare i modelli di aritmia. In sintesi, questa tecnica offre la possibilità di ottimizzare la manipolazione del meccanismo in loco sulla strada per il controllo del feedback in tempo reale del ritmo cardiaco e, per quanto riguarda la specificità della regione, nuovi approcci nel ridurre il potenziale danno al sistema cardiaco rispetto all'uso di applicazioni di scosse elettriche non specifiche.

Il protocollo consente l'induzione di aritmie ventricolari in cuori murini intatti utilizzando impulsi di fotostimolazione generati da LED 1 e LED 2 (Figura 1) con una frequenza f ind compresa tra 25 Hz e 35 Hz e una durata dell'impulso Wind compresa tra 2 ms e 10 ms. Si noti che lo scopo di tali impulsi luminosi rapidi non è quello di catturare il ritmo cardiaco, ma piuttosto di sbilanciare l'attività cardiaca in modo che possano essere generate onde elettriche irregol...

Questo lavoro riporta un metodo per controllare il ritmo cardiaco di cuori murini intatti di topi transgenici channelrhodopsin-2 (ChR2) utilizzando la fotostimolazione locale con un array di micro-LED e la mappatura ottica simultanea del potenziale della membrana epicardica.

Gestione avanzata del ritmo cardiaco applicando la fotostimolazione multi-sito optogenetica nei cuori murini

Ventricular tachyarrhythmias are a major cause of mortality and morbidity worldwide. Electrical defibrillation using high-energy electric shocks is ...

La fibrillazione cardiaca e la defibrillazione fisica più sottostanti rimangono non completamente comprese. L'optogenetica può offrire un modo per ottenere maggiori informazioni sui fenomeni cardiaci in un ambiente ben controllato. La stimolazione della luce locale tramite micro LED consente l'innovazione di specifiche aree del tessuto cardiaco.Questa stimolazione mirata è un nuovo strumento per sviluppare metodi di terapia antiaritmetica delicati per il cuore. Il protocollo mostrato può essere utilizzato per studiare il comportamento cardiaco durante l'aritmia cardiaca e soprattutto durante la terminazione. In prospettiva, le tecniche sviluppate possono essere utilizzate per studiare modelli animali di grandi dimensioni clinicamente più rilevanti.Prima di ogni esperimento, pulire tutti i tubi con acqua completamente demineralizzata. Aerare le soluzioni tiroidee con carbogen per 30 minuti a temperatura ambiente e regolare il pH a 7,3 con idrossido di sodio e acido cloridrico. Riscaldare il sistema di perfusione a 37 gradi Celsius con una pompa di calore ad acqua.Mantenere costante la temperatura del perfusto all'interno del bagno d'acqua utilizzando un elemento riscaldante aggiuntivo come un cavo riscaldante impermeabile. Aggiungere 500 millilitri di ciascuna soluzione tiroidea al serbatoio corrispondente e disaerare i tubi e la trappola a bolle facendo passare la soluzione tiroidea attraverso il sistema di perfusione fino a quando non si vedono più bolle d'aria intrappolate nei tubi o nella trappola a bolle. Continuare ad aerare le soluzioni tiroidee durante l'intero esperimento nei serbatoi con carbogeno per garantire che il pH del perfusato rimanga stabile più tardi durante la perfusione.Dopo aver rimosso il cuore, eseguire la preparazione fine al microscopio stereoscopico. Attaccare l'aorta sull'ago smussato e fissare la nave con materiale di sutura. Come controllo, iniettare una soluzione tiroidea ghiacciata attraverso l'ago nel cuore e controllare che il cuore sia montato saldamente.Trasferire il cuore montato al sistema di perfusione e assicurarsi che il perfusato scorra per impedire all'aria di entrare nel cuore mentre si collega l'ago con la trappola a bolle. Controllare che il cuore sia coperto con soluzione tiroidea nel bagno d'acqua e che batta entro pochi minuti. Posizionare uno degli elettrodi ECG il più vicino possibile alla superficie del cuore per garantire una buona qualità del segnale.Sospendere il secondo elettrodo ECG nella soluzione tiroidea, assicurandosi che l'ECG venga registrato. Posizionare l'array di micro LED sull'area di interesse. Cambiare la perfusione in tiroide a basso contenuto di potassio con penecidle e esaminare il cuore per 15-30 minuti.Per indurre l'aritmia, illuminare il cuore con LED uno e LED due con un treno di 20-50 impulsi luminosi con una frequenza da 25 a 35 hertz, durata dell'impulso da due a 15 millisecondi e intensità luminosa di 2,8 milli watt per millimetri quadrati. Ripetere il processo fino a quando non viene indotta l'aritmia. Una volta rilevata visivamente un'aritmia prolungata, applicare una raffica di impulsi con larghezze e frequenze diverse utilizzando tre, sei o nove micro LED dell'array a una corrente pulsata di 15 milliampere pilastri.Se l'aritmia continua dopo cinque prove di defibrillazione basate su array di micro LED, classificare il tentativo come fallito e avviare la defibrillazione di backup, utilizzando LED uno e LED due con gli stessi parametri di temporizzazione. Perfondere il cuore con la soluzione di blebbistatina e attendere fino a quando si verifica il disaccoppiamento meccanico, che si ottiene quando il cuore smette di battere, ma un segnale ECG è ancora misurabile. Dare il colorante di tensione da un millilitro, colorare 4-A-N-B-D-Q-P-Q come bolo nella trappola a bolle della perfusione Langendorff e attendere da cinque a 10 minuti per consentire al colorante di esaminare il cuore in modo uniforme.Accendi il LED tre. Mettere a fuoco la fotocamera sulla superficie del cuore e applicare 1,27 milli watt per millimetro quadrato di potenza ottica. Spegnere le luci di laboratorio e avviare la registrazione, assicurandosi che venga acquisito un segnale ottico confrontando la frequenza del segnale ottenuto con la frequenza dell'ECG registrato.Una serie di esperimenti con frequenze diverse, numero di micro LED e durata degli impulsi sono stati testati per 11 topi, dimostrando che impulsi da 1 a 20 millisecondi possono defibrillare con diverse percentuali di successo. C'è un aumento significativo del tasso di successo dei nove LED con durata dell'impulso di un millisecondo e 20 millisecondi a una frequenza di defibrillazione di 18 e 20 hertz, che è più vicina alla frequenza media di aritmia analizzata di 22,55 di tutte le aritmie con un intervallo di errore di più o meno quattro punto zero tre hertz. Qui sono mostrati due diversi tentativi di defibrillazione con frequenza di 14 hertz con le loro registrazioni ECG e i rispettivi spettrogrammi.In un esempio di defibrillazione con impulsi di 30 millisecondi, la frequenza dominante dell'aritmia aumenta leggermente fino all'inizio della fotostimolazione. Il VF viene trasformato in un VT in cui la frequenza dominante scende a 14 hertz seguita da terminazione infruttuosa e ritorno al comportamento aritmico con una frequenza dominante di 24 hertz. Nel secondo esempio, il primo segmento mostra un VT con frequenza dominante di 23 hertz e le sue componenti armoniche fino all'inizio della fotostimolazione, con una larghezza di impulso di 20 millisecondi.Il terzo segmento mostra una terminazione riuscita che porta a un normale ritmo sinusale con una frequenza fondamentale di 3,5 hertz e le armoniche risultanti. La mappatura ottica con telecamere ad alta velocità ha mostrato un cambiamento di intensità della fluorescenza durante un singolo battito cardiaco durante un normale ritmo sinusale. La durata della perfusione deve mantenere tutte le condizioni per mantenere il cuore sano, vale a dire la temperatura, il valore del pH e l'ossidazione devono rimanere costanti.È particolarmente importante che la soluzione tiroidea non si svuoti poiché le bolle d'aria nel sistema possono danneggiare il cuore. L'array di micro realtà offre una grande flessibilità. È possibile indirizzare diverse posizioni del cuore o persino combinare più array in un unico esperimento per terminare correttamente l'aritmia.

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Sviluppo di modelli di Drosophila melanogaster per l'imaging e il controllo optogenetico della funzione cardiaca

Questo protocollo introduce la mappatura ottica a doppio colorante di cuori di topo ottenuti da animali wild-type e knock-in affetti da tachicardia ventricolare polimorfa catecolaminergica, comprese le misurazioni elettrofisiologiche del voltaggio transmembrana e dei transitori intracellulari di Ca2+ con un'elevata risoluzione temporale e spaziale.

Mappatura ottica a doppio colorante di cuori da topi knock-in RyR2R2474S di tachicardia ventricolare polimorfa catecolaminergica

Questo protocollo illustra un metodo per la stimolazione optogenetica dei neuroni cardiaci intrinseci nei cuori di topo transgenici. L'approccio descritto è utilizzato per studiare la cinetica dell'attivazione improvvisa dei neuroni cardiaci in cuori perfusi ex vivo e le interazioni tra attività colinergica e catecolaminergica.

Attivazione optogenetica dei neuroni autonomici cardiaci intrinseci nei cuori di topo perfusi asportati

L'uso della luce per controllare le cellule e i tessuti cardiaci consente la stimolazione senza contatto, preservando così lo stato naturale e la funzione delle cellule, rendendolo un approccio prezioso sia per la ricerca di base che per le applicazioni terapeutiche.

Un sistema microfisiologico cardiaco per lo studio della propagazione del Ca2+ tramite stimolazione ottica non genetica

Scopri la gestione avanzata del ritmo cardiaco mediante fotostimolazione optogenetica multi-sito su cuori murini intatti. Questo metodo consente il controllo regionale delle aritmie con mappatura ottica in tempo reale.

Gestione avanzata del ritmo cardiaco applicando la fotostimolazione multi-sito optogenetica nei cuori murini

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