Gestione avanzata del ritmo cardiaco applicando la fotostimolazione multi-sito optogenetica nei cuori murini

La fibrillazione cardiaca e la defibrillazione fisica più sottostanti rimangono non completamente comprese. L'optogenetica può offrire un modo per ottenere maggiori informazioni sui fenomeni cardiaci in un ambiente ben controllato. La stimolazione della luce locale tramite micro LED consente l'innovazione di specifiche aree del tessuto cardiaco.

Questa stimolazione mirata è un nuovo strumento per sviluppare metodi di terapia antiaritmetica delicati per il cuore. Il protocollo mostrato può essere utilizzato per studiare il comportamento cardiaco durante l'aritmia cardiaca e soprattutto durante la terminazione. In prospettiva, le tecniche sviluppate possono essere utilizzate per studiare modelli animali di grandi dimensioni clinicamente più rilevanti.

Prima di ogni esperimento, pulire tutti i tubi con acqua completamente demineralizzata. Aerare le soluzioni tiroidee con carbogen per 30 minuti a temperatura ambiente e regolare il pH a 7,3 con idrossido di sodio e acido cloridrico. Riscaldare il sistema di perfusione a 37 gradi Celsius con una pompa di calore ad acqua.

Mantenere costante la temperatura del perfusto all'interno del bagno d'acqua utilizzando un elemento riscaldante aggiuntivo come un cavo riscaldante impermeabile. Aggiungere 500 millilitri di ciascuna soluzione tiroidea al serbatoio corrispondente e disaerare i tubi e la trappola a bolle facendo passare la soluzione tiroidea attraverso il sistema di perfusione fino a quando non si vedono più bolle d'aria intrappolate nei tubi o nella trappola a bolle. Continuare ad aerare le soluzioni tiroidee durante l'intero esperimento nei serbatoi con carbogeno per garantire che il pH del perfusato rimanga stabile più tardi durante la perfusione.

Dopo aver rimosso il cuore, eseguire la preparazione fine al microscopio stereoscopico. Attaccare l'aorta sull'ago smussato e fissare la nave con materiale di sutura. Come controllo, iniettare una soluzione tiroidea ghiacciata attraverso l'ago nel cuore e controllare che il cuore sia montato saldamente.

Trasferire il cuore montato al sistema di perfusione e assicurarsi che il perfusato scorra per impedire all'aria di entrare nel cuore mentre si collega l'ago con la trappola a bolle. Controllare che il cuore sia coperto con soluzione tiroidea nel bagno d'acqua e che batta entro pochi minuti. Posizionare uno degli elettrodi ECG il più vicino possibile alla superficie del cuore per garantire una buona qualità del segnale.

Sospendere il secondo elettrodo ECG nella soluzione tiroidea, assicurandosi che l'ECG venga registrato. Posizionare l'array di micro LED sull'area di interesse. Cambiare la perfusione in tiroide a basso contenuto di potassio con penecidle e esaminare il cuore per 15-30 minuti.

Per indurre l'aritmia, illuminare il cuore con LED uno e LED due con un treno di 20-50 impulsi luminosi con una frequenza da 25 a 35 hertz, durata dell'impulso da due a 15 millisecondi e intensità luminosa di 2,8 milli watt per millimetri quadrati. Ripetere il processo fino a quando non viene indotta l'aritmia. Una volta rilevata visivamente un'aritmia prolungata, applicare una raffica di impulsi con larghezze e frequenze diverse utilizzando tre, sei o nove micro LED dell'array a una corrente pulsata di 15 milliampere pilastri.

Se l'aritmia continua dopo cinque prove di defibrillazione basate su array di micro LED, classificare il tentativo come fallito e avviare la defibrillazione di backup, utilizzando LED uno e LED due con gli stessi parametri di temporizzazione. Perfondere il cuore con la soluzione di blebbistatina e attendere fino a quando si verifica il disaccoppiamento meccanico, che si ottiene quando il cuore smette di battere, ma un segnale ECG è ancora misurabile. Dare il colorante di tensione da un millilitro, colorare 4-A-N-B-D-Q-P-Q come bolo nella trappola a bolle della perfusione Langendorff e attendere da cinque a 10 minuti per consentire al colorante di esaminare il cuore in modo uniforme.

Accendi il LED tre. Mettere a fuoco la fotocamera sulla superficie del cuore e applicare 1,27 milli watt per millimetro quadrato di potenza ottica. Spegnere le luci di laboratorio e avviare la registrazione, assicurandosi che venga acquisito un segnale ottico confrontando la frequenza del segnale ottenuto con la frequenza dell'ECG registrato.

Una serie di esperimenti con frequenze diverse, numero di micro LED e durata degli impulsi sono stati testati per 11 topi, dimostrando che impulsi da 1 a 20 millisecondi possono defibrillare con diverse percentuali di successo. C'è un aumento significativo del tasso di successo dei nove LED con durata dell'impulso di un millisecondo e 20 millisecondi a una frequenza di defibrillazione di 18 e 20 hertz, che è più vicina alla frequenza media di aritmia analizzata di 22,55 di tutte le aritmie con un intervallo di errore di più o meno quattro punto zero tre hertz. Qui sono mostrati due diversi tentativi di defibrillazione con frequenza di 14 hertz con le loro registrazioni ECG e i rispettivi spettrogrammi.

In un esempio di defibrillazione con impulsi di 30 millisecondi, la frequenza dominante dell'aritmia aumenta leggermente fino all'inizio della fotostimolazione. Il VF viene trasformato in un VT in cui la frequenza dominante scende a 14 hertz seguita da terminazione infruttuosa e ritorno al comportamento aritmico con una frequenza dominante di 24 hertz. Nel secondo esempio, il primo segmento mostra un VT con frequenza dominante di 23 hertz e le sue componenti armoniche fino all'inizio della fotostimolazione, con una larghezza di impulso di 20 millisecondi.

Il terzo segmento mostra una terminazione riuscita che porta a un normale ritmo sinusale con una frequenza fondamentale di 3,5 hertz e le armoniche risultanti. La mappatura ottica con telecamere ad alta velocità ha mostrato un cambiamento di intensità della fluorescenza durante un singolo battito cardiaco durante un normale ritmo sinusale. La durata della perfusione deve mantenere tutte le condizioni per mantenere il cuore sano, vale a dire la temperatura, il valore del pH e l'ossidazione devono rimanere costanti.

È particolarmente importante che la soluzione tiroidea non si svuoti poiché le bolle d'aria nel sistema possono danneggiare il cuore. L'array di micro realtà offre una grande flessibilità. È possibile indirizzare diverse posizioni del cuore o persino combinare più array in un unico esperimento per terminare correttamente l'aritmia.