Name: Sonde di tensione del DNA per mappare le forze transitorie del recettore di Piconewton da parte delle cellule immunitarie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Scopri come mappare le forze molecolari transitorie generate dalle cellule immunitarie utilizzando sonde di tensione del DNA con meccanismo di blocco. Questo protocollo permette di quantificare forze a scala di piconewton mediante microscopia a fluorescenza convenzionale.

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Questo lavoro è stato supportato da NIH Grants R01GM131099, NIH R01GM124472 e NSF CAREER 1350829. Ringraziamo il NIH Tetramer Facility per i ligandi pMHC. Questo studio è stato supportato, in parte, dall'Emory Comprehensive Glycomics Core.

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<li>Galior, K., Liu, Y., Yehl, K., Vivek, S., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titin-based+nanoparticle+tension+sensors+map+high-magnitude+integrin+forces+within+focal+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Titin-based nanoparticle tension sensors map high-magnitude integrin forces within focal adhesions.</a> Nano Letters. 16 (1), 341-348 (2016).</li>
<li>Zhang, Y., Ge, C., Zhu, C., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-based+digital+tension+probes+reveal+integrin+forces+during+early+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">DNA-based digital tension probes reveal integrin forces during early cell adhesion.</a> Nature Communications. 5, 5167(2014).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-based+nanoparticle+tension+sensors+reveal+that+T-cell+receptors+transmit+defined+pN+forces+to+their+antigens+for+enhanced+fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">DNA-based nanoparticle tension sensors reveal that T-cell receptors transmit defined pN forces to their antigens for enhanced fidelity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (20), 5610-5615 (2016).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+integrins+exhibit+anisotropic+mechanosensing+and+harness+piconewton+forces+to+mediate+platelet+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Platelet integrins exhibit anisotropic mechanosensing and harness piconewton forces to mediate platelet aggregation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (2), 325-330 (2018).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinetics+of+two-dimensional+TCR+and+pMHC+interactions+determine+T-cell+responsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The kinetics of two-dimensional TCR and pMHC interactions determine T-cell responsiveness.</a> Nature. 464 (7290), 932-936 (2010).</li>
<li>Ma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+probes+that+store+mechanical+information+reveal+transient+piconewton+forces+applied+by+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">DNA probes that store mechanical information reveal transient piconewton forces applied by T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (34), 16949-16954 (2019).</li>
<li>Hui, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+costimulatory+receptor+CD28+is+a+primary+target+for+PD-1-mediated+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition.</a> Science. 355 (6332), 1428-1433 (2017).</li>
<li>Whitley, K. D., Comstock, M. J., Chemla, Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elasticity+of+the+transition+state+for+oligonucleotide+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Elasticity of the transition state for oligonucleotide hybridization.</a> Nucleic Acids Research. 45 (2), 547-555 (2016).</li>
<li>Brockman, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+super-resolved+PAINT+imaging+of+piconewton+cellular+traction+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Live-cell super-resolved PAINT imaging of piconewton cellular traction forces.</a> Nature Methods. 17 (10), 1018-1024 (2020).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Con le procedure dettagliate fornite qui, è possibile preparare substrati di sonda di tensione a forcina di DNA per mappare e quantificare la tensione del recettore prodotta dalle cellule immunitarie. Quando le cellule vengono placcate sul substrato della sonda di tensione della forcina del DNA, atterrano, si attaccano e si diffondono mentre i recettori percepiscono i ligandi sia chimicamente che meccanicamente, l'ultimo dei quali viene rilevato dalle nostre sonde. Tuttavia, in alcuni casi le cellule potrebbero non riusc...

Le cellule immunitarie difendono dagli agenti patogeni e dalle cellule tumorali strisciando e scansionando continuamente le superfici delle cellule bersaglio alla ricerca di antigeni, costellando la loro superficie 1,2. Il riconoscimento dell'antigene viene avviato al momento del legame tra il recettore delle cellule T (TCR) e il complesso di istocompatibilità peptide-maggiore MHC (pMHC) espresso sulla superficie delle cellule bersaglio. Poiché il riconoscimento TCR-pMHC avviene alla giunzione tra due cellule mobili, è stato a lungo sospettato di sperimentare forze meccaniche. Inoltre, questo ha portato al modello meccanosensore di attivazione TCR, che suggerisce che le forze TCR contribuiscono alla sua funzione 3,4. Per capire quando, dove e come le forze meccaniche contribuiscono alla funzione delle cellule T, è imperativo sviluppare strumenti per visualizzare le forze molecolari trasmesse dalle cellule T. Tradizionalmente, metodi come la microscopia della forza di trazione (TFM) e gli array di micropilastri sono usati per studiare le forze cellulari 5,6. Tuttavia, la sensibilità alla forza degli array di TFM e micropilastri è alla scala nanonewton (nN) e quindi è spesso insufficiente per studiare le forze molecolari di piconewton (pN) trasmesse dai recettori cellulari7. Per migliorare la forza e la risoluzione spaziale per il rilevamento, il nostro laboratorio ha aperto la strada allo sviluppo di sonde di tensione molecolare, che sono state inizialmente sintetizzate utilizzando polimeri di polietilenglicole (PEG)7. Le sonde di tensione molecolare sono costituite da una "molla" molecolare estensibile (PEG, proteina, DNA) affiancata da un fluoroforo e un quencher e sono ancorate su una superficie. Le forze applicate al terminale della sonda portano alla sua estensione, separando il fluoroforo e il quencher, e generando così un forte segnale di fluorescenza (Figura 1A)8,9,10.
Negli ultimi dieci anni abbiamo sviluppato una libreria di diverse classi di sonde di tensione molecolari con elementi a molla costituiti da acidi nucleici11, proteine10 e polimeri8. Tra questi, le sonde di tensione basate sul DNA forniscono il più alto rapporto segnale/rumore e la massima sensibilità alla forza, che è facilmente sintonizzata da pochi pN fino a ~20 pN11. Abbiamo utilizzato queste sonde di tensione del DNA in tempo reale per studiare le forze molecolari generate da molti diversi tipi di cellule, tra cui fibroblasti, cellule tumorali, piastrine e cellule immunitarie11,12,13. Questo manoscritto descriverà i protocolli per sintetizzare e assemblare sonde di tensione del DNA su una superficie per mappare le forze dei recettori molecolari con risoluzione della forza pN utilizzando un microscopio a fluorescenza convenzionale. Mentre l'attuale procedura include modifiche chimiche all'acido nucleico per introdurre il reporter fluorescente (Figura 1B), è importante notare che molte delle fasi di modifica e purificazione possono essere esternalizzate a società di sintesi del DNA personalizzate. Pertanto, la tecnologia delle sonde di tensione del DNA è facile e accessibile alle più ampie comunità di biologia cellulare e meccanobiologia.
In breve, per assemblare i sensori di tensione del DNA, una forcina di DNA viene ibridata con un filamento di ligando fluorescente su un braccio e un filamento di ancoraggio di quencher sull'altro braccio e quindi immobilizzato su un substrato di vetro (Figura 1C, tensione in tempo reale). In assenza di forza meccanica, la forcina viene chiusa e quindi la fluorescenza viene spenta. Tuttavia, quando la forza meccanica applicata è maggiore di F1/2 (la forza all'equilibrio che porta a una probabilità del 50% di dispiegarsi), la forcina si scioglie meccanicamente e viene generato un segnale fluorescente.
Basandoci sul sensore di tensione del DNA in tempo reale, descriviamo anche i protocolli per mappare le forze accumulate, che è particolarmente utile per studiare le interazioni tra i recettori sulle cellule immunitarie e il loro ligando naturale. Questo perché i recettori immunitari spesso mostrano legami di breve durata 3,14. Le forze accumulate vengono visualizzate utilizzando un filamento di "bloccaggio" che si lega preferenzialmente alle forcine di DNA aperte e consente la memorizzazione di segnali di fluorescenza associati a eventi di trazione meccanica (Figura 1C, tensione bloccata). Il filo di bloccaggio è progettato per legare un sito di legame criptico che viene esposto alla fusione indotta meccanicamente della forcina e bloccare la forcina nello stato aperto bloccando la ripiegatura della forcina, memorizzando così il segnale di tensione e generando una mappa di tensione accumulata. Inoltre, il filo di bloccaggio è progettato con un appiglio a otto nucleotidi, che consente una reazione di spostamento del filamento mediata dalla presa con il suo complemento completo, il filamento "sbloccante". Con l'aggiunta del trefolo di sblocco, il filo di bloccaggio legato viene rimosso dal costrutto a forcina, cancellando il segnale di tensione memorizzato e ripristinando la forcina allo stato in tempo reale.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62348/62348fig01.jpg"> Figura 1: Schema delle sonde di tensione molecolari all'avanguardia . (A) Progettazione generale della sonda di tensione molecolare in tempo reale, (B) Filamenti per il costrutto della sonda di tensione basata sul DNA e (C) sonde di tensione basate sul DNA ingegnerizzate e loro commutazione tra stato in tempo reale e stato bloccato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62348/62348fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
Il protocollo principale consiste di quattro sezioni principali: preparazione degli oligonucleotidi, preparazione della superficie, imaging e analisi dei dati. Questo protocollo è stato dimostrato con successo dal nostro laboratorio e da altri in cellule T CD8+ OT-1 naïve e attivate, cellule CD4+ OT-II e ibridomi e può essere applicato per interrogare diversi recettori delle cellule immunitarie tra cui il recettore delle cellule T, il recettore della morte cellulare programmata (PD1) e le forze dell'antigene 1 associato alla funzione linfocitaria (LFA-1). Le cellule T CD8 + naïve OT-1 sono usate come linea cellulare di esempio in questo articolo.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; acido 3-idrossipicolinico (3-HPA)</td><td>Sigma</td><td>56197</td><td>matrice maldi-TOF-MS</td></tr>&<tr><td>nbsp; mPEG-SC</td><td>Biochempeg</td><td>MF001023-2K</td><td>preparazione della superficie</td></tr> <tr><td>(3-amminopropil)trietossisilano</td><td>Acros</td><td>AC430941000</td><td>preparazione della superficie</td></tr><tr><td>10x tampone per lisi dei globuli rossi</td><td>Biolegend</td><td>00-4333-57</td><td>tampone</td></tr><tr><td>8,8 nm nanoparticelle d'oro, acido tannico</td><td>Nanocomposix</td> ordine <td>personalizzato</td><td>preparazione della superficie</td></tr><tr><td>Atto647N NHS estere</td><td>Sigma</td><td>18373-1MG-F</td><td>fluoroforo, oligo prep</td></tr><tr><td>Attofluor Camera cellulare, per microscopia</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A7816</td><td>imaging</td></tr><tr><td>BD Siringhe solo con Luer-Lok</td><td>BD bioscience cellule</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>biotinilato anti-topo CD3e</td><td>ebioscience</td><td>13-0031-82</td><td>anticorpo/ligando</td></tr><tr><td>pMHC biotinilato (SIINFEKL)</td><td>NIH Tetramer Core Facility presso la Emory University</td><td>Anticorpo NA</td><td>/ligando</td></tr><tr><td>albumina sierica bovina</td><td>Sigma</td><td>735078001</td><td>blocca interazioni non specifiche</td></tr><tr><td>Filtri cellulari</td><td>Biologix</td><td>15-1100</td><td>cellule</td></tr><tr><td>Coverslip Mini-Rack, teflon</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C14784</td><td>preparazione della superficie</td></tr><tr><td>Cy3B NHS estere</td><td>GE Healthcare</td><td>PA63101</td><td>fluoroforo, oligo prep</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS)</td><td>Corning</td><td>21-031-CM</td><td>etanolo tampone</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td></td><td>459836 preparazione della superficie</td></tr><tr><td>Hank' sali bilanciati (HBSS)Perossido</td> di idrogeno <td>tampone</td> <td>Sigma</td><td>H8264</td></tr><tr><td></td><td>Preparazione della superficie</td><td>Sigma</td><td>H1009</td></tr><tr><td>LA-PEG-SC</td><td>Biochempeg</td><td>HE039023-3.4K</td><td>preparazione della superficie</td></tr><tr><td>Kit di avvio Midi MACS (LS) Miltenyi</td><td>Biotec</td><td>130-042-301</td><td>cellule</td>Kit</tr><tr><td>di isolamento delle cellule T CD8+ del topo</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-104-075</td><td>cellule</td></tr><tr><td>Dispositivi centrifughi Nanosep MF</td><td>Pall laboratory</td><td>ODM02C35</td><td>oligo prep</td></tr><tr><td>No. 2 vetrini coprioggetti rotondi VWR</td><td></td><td>48382-085</td><td>preparazione della superficie</td></tr><tr><td>NTA-SAM</td><td>Dojindo Molecular Technologies</td><td>N475-10</td><td>preparazione della superficie</td></tr><tr><td>P2 gel</td><td>Bio-rad</td><td>1504118</td><td>oligo prep</td></tr><tr><td>acido suforico</td><td>EMD Millipore Corporation</td><td>SX1244-6</td> preparazione della <td>superficie</td></tr><tr><td>Sulfo-NHS</td><td>acetato Thermo Fisher Scientific</td><td>26777</td><td>preparazione della superficie</td></tr><tr><td><forte>Attrezzatura</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colonna Agilent AdvanceBio Oligonucleotide C18, 4,6 x 150 mm, 2,7 &; m</td><td>653950-702</td><td></td><td>preparazione di oligonucleotidi</td></tr><tr><td>Barnstead Sistema di purificazione dell'acqua nanopura</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>acqua</td></tr><tr><td>CFI Apo 100&volte; NA 1.49 obiettivo</td><td>Nikon</td><td></td><td>Microscopia</td></tr><tr><td>Cy5 cube</td><td>CHROMA</td><td></td><td>Microscopia</td></tr><tr><td>evolve dispositivo ad accoppiamento di carica moltiplicatrice di elettroni (EMCCD)</td><td></td><td>Microscopia fotometrica</td><td></td></tr><tr><td>Cromatografia liquida ad alte prestazioni</td><td>Preparazione di oligonucleotidi</td><td>Agilent 1100</td><td></td> Sorgente</tr> di <tr><td>epifluorescenza a luce intensa</td><td>Nikon</td><td></td><td>Microscopia</td></tr><tr><td>Spettrometro di massa a tempo di volo con desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice (MALDI-TOF-MS)Preparazione</td> di <td>oligonucleotidi</td> <td>Voyager STR</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro UV-Vis Nanodrop 2000</td><td>Preparazione di oligonucleotidi</td><td>Thermo Fisher</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertito Nikon Eclipse Ti</td><td>Microscopia Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema di messa a fuoco perfetta</td><td>Nikon</td><td></td><td>Microscopia</td></tr><tr><td>Software NIS Elements</td><td>Nikon</td><td></td><td>Microscopy</td></tr><tr><td>quad band TIRF 405/488/561/647 cubo</td><td>Microscopia CHROMA</td><td></td><td>Microscopia</td></tr><tr><td>RICM cubo CHROMA</td><td></td><td></td><td>Lanciatore</td></tr><tr><td>TIRF con 488 nm (50 mW), 561 nm (50 mW) e 640 nm</td><td></td><td></td><td>Microscopia</td></tr><tr><td>TRITC cubo</td><td>CHROMA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>oligo name</td><td>5' modifica / 3' modifica</td><td>sequence (da 5' a 3')</td><td>Use</td></tr><tr><td>15mer ammina locking strand</td><td>5' modifica: nessuna modifica 3' modifica: /3AmMO/</td><td>AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA</td><td>blocco segnale di tensione in tempo reale</td></tr><tr><td>15mer Atto647N bloccaggio strand</td><td>5' modifica: Atto647N 3' modifica: /3AmMO/</td><td>AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA</td><td>blocco segnale di tensione in tempo reale</td></tr><tr><td>15mer trefolo</td> <td>di bloccaggio non fluorescente5' modifica: nessuna modifica 3' modifica: nessuna modifica</td><td>A AAA AAC ATT TAT Blocco AC</td> segnale <td>di tensione in tempo reale per analisi quantitativa</td></tr><tr><td>4.7 pN hairpin strand</td><td>5' modifica: nessuna modifica 3' modifica: nessuna modifica</td><td>GTGAAATACCGCACAGATGCGT TTGTATAAATGTTTTTTTCATTTAT ACTTTAAGAGCGCCACGTAGCC Sonda a</td><td>forcina</td>CAGC</tr><tr><td>filamento del ligando dell'ammina strand</td><td>5' modifica: /5AmMC6/ 3' modifica: /3Bio/</td><td>CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT</td><td>sonda a forcina</td></tr><tr><td>BHQ2 filo di</td> <td>ancoraggio5' modifica: /5ThiolMC6-D/ 3' modifica: /3BHQ_2/</td><td>TTTGCTGGGCTACGTGGCGCTCTT</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; Sonda a forcina</td></tr><tr><td>Cy3B ligando filamento</td><td><forte>5' modifica:</forte> Cy3B <forte>3' modifica:</forte> /3Bio/</td><td>CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT</td><td>sblocco della sonda a forcina</td></tr><tr><td><</td><td>forte>5' modifica:</forte> nessuna modifica <forte>3' modifica: </forte> nessuna modifica</td><td>TAG, GTA, GGG, TAT, AAA, TGT, TTT, TTT, C, sblocco</td>, <td>segnale di tensione accumulata</td></tr></tbody></table>,

sonde di tensione del dna per mappare le forze transitorie del recettore di piconewton da parte delle cellule immunitarie

DNA Tension Probes to Map the Transient Piconewton Receptor Forces by Immune Cells

Le forze meccaniche trasmesse alla giunzione tra due cellule vicine e alla giunzione tra le cellule e la matrice extracellulare sono fondamentali per regolare molti processi che vanno dallo sviluppo all'immunologia. Pertanto, lo sviluppo di strumenti per studiare queste forze su scala molecolare è fondamentale. Il nostro gruppo ha sviluppato una suite di sensori di tensione molecolare per quantificare e visualizzare le forze generate dalle cellule e trasmesse a ligandi specifici. La classe più sensibile di sensori di tensione molecolare è costituita da forcine ad anello stelo di acido nucleico. Questi sensori utilizzano coppie fluoroforo-quencher per segnalare l'estensione meccanica e lo sviluppo delle forcine del DNA sotto forza. Una sfida con i sensori di tensione a forcina del DNA è che sono reversibili con un rapido ripiegamento della forcina al termine della tensione e quindi le forze transitorie sono difficili da registrare. In questo articolo, descriviamo i protocolli per la preparazione di sensori di tensione del DNA che possono essere "bloccati" e impediti di ripiegarsi per consentire la "memorizzazione" di informazioni meccaniche. Ciò consente la registrazione di forze piconewton altamente transitorie, che possono essere successivamente "cancellate" dall'aggiunta di acidi nucleici complementari che rimuovono la serratura. Questa capacità di alternare tra la mappatura della tensione in tempo reale e la memorizzazione di informazioni meccaniche rivela forze deboli, di breve durata e meno abbondanti, che sono comunemente impiegate dalle cellule T come parte delle loro funzioni immunitarie.

Qui mostriamo immagini rappresentative del controllo della qualità della superficie (Figura 4). Una superficie di alta qualità dovrebbe avere uno sfondo pulito nel canale RICM (Figura 4B) e un'intensità di fluorescenza uniforme nel canale Cy3B (Figura 4C). Con le stesse apparecchiature di imaging e identiche condizioni di acquisizione dell'imaging a fluorescenza, l'intensità della fluorescenza di fondo dovrebbe essere coerente e rip...

Questo documento descrive un protocollo dettagliato per l'utilizzo di sonde di tensione basate sul DNA per visualizzare le forze recettoriali applicate dalle cellule immunitarie. Questo approccio può mappare le forze recettoriali >4.7pN in tempo reale e può integrare le forze nel tempo.

Sonde di tensione del DNA per mappare le forze transitorie del recettore di Piconewton da parte delle cellule immunitarie

Mechanical forces transmitted at the junction between two neighboring cells and at the junction between cells and the extracellular matrix are critical ...

Questo protocollo offre un metodo per mappare le forze molecolari generate dalle cellule e in particolare dalle cellule immunitarie. Il protocollo è fondamentale per i laboratori interessati a studiare la meccanotrasduzione in meccanobiologia. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è super facile e consente di utilizzare la microscopia a fluorescenza convenzionale per quantificare la trasmissione della forza nelle cellule immortalizzate e primarie.Per iniziare, posizionare i coprivetrini da 25 millimetri su un rack di politetrafluoroetilene in un becher da 50 millilitri e sciacquare i coperchi tre volte immergendoli in acqua. Mescolare volumi uguali di etanolo e acqua e aggiungere 40 millilitri di questa soluzione al becher contenente il rack e i vetrini di copertura. Quindi, sigillare il becher con nastro parafilm.Pulire i vetrini di copertura sonicando il becher per 15 minuti in un pulitore ad ultrasuoni e scartare il liquido dopo la sonicazione. Quindi, sciacquare il becher contenente il rack e i coprivetrini con acqua almeno sei volte per rimuovere eventuali residui di solvente organico. Per preparare una soluzione di piranha fresca, aggiungere 30 millilitri di acido solforico in un becher da 50 millilitri e aggiungere lentamente 10 millilitri di perossido di idrogeno.Mescolare delicatamente la soluzione di piranha usando l'estremità di una pipetta di vetro. Per avviare l'incisione, trasferire il rack contenente i vetrini di copertura nel becher contenente la soluzione di piranha e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente per pulire e idrossilare i vetrini di copertura. Quindi, trasferire il rack utilizzando pinzette in acciaio o politetrafluoroetilene in un becher pulito da 50 millilitri e risciacquare con acqua sei volte.Per rimuovere completamente l'acqua, immergere il rack che tiene i coperchi in un becher da 50 millilitri con 40 millilitri di etanolo. Quindi, scartare l'etanolo. Quindi, immergere il rack in 40 millilitri di etanolo contenente il 3% di amminopropiltrietossisilano per un'ora a temperatura ambiente per avviare la reazione con il gruppo ossidrile sui vetrini di copertura.Risciacquare la superficie dei coperchi sei volte immergendoli in 40 millilitri di etanolo e asciugarli in forno a 80 gradi Celsius per 20 minuti. Coprire il fondo interno della capsula di Petri con un nastro parafilm per evitare che i vetrini scivolino all'interno della capsula di Petri. Quindi posizionare i coprivetrini ricoperti di ammina con il lato da funzionalizzare con sonde di tensione del DNA rivolte verso l'alto.Coprire i coprivetrini a 20 gradi Celsius per un uso futuro. Per modificare i gruppi amminici sui vetrini, aggiungere acido lipoico PEG NHS e mPEG NHS e incubare la capsula di Petri a temperatura ambiente per un'ora. Alla fine dell'incubazione, sciacquare la superficie tre volte con acqua.Successivamente, aggiungere 100 microlitri di bicarbonato di sodio 0,1 molare contenente un milligrammo per millilitro di solfo-NHS-acetato a una serie di coprivetrini sandwich e incubare per 30 minuti affinché si verifichi la passivazione. Aggiungere 0,5 millilitri di nanoparticelle d'oro a ciascun coprivetrino e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, sciacquare i coperchi con acqua tre volte.Dopo aver aggiunto il filamento Black Hole Quencher 2 alla sonda di tensione del DNA ricotto con un rapporto di dieci a uno, aggiungere 100 microlitri della miscela per due vetrini per fare il sandwich. Posizionare con cautela una sfera di tessuto da laboratorio bagnata nella capsula di Petri lontano dai vetrini di copertura e sigillare la capsula con nastro parafilm per evitare che la soluzione si asciughi. Dopo di ciò, coprire il piatto con un foglio e incubarlo a quattro gradi Celsius durante la notte.Il giorno successivo, assemblare la camera di imaging, avendo cura di evitare fessurazioni superficiali mentre si stringe la camera. Quindi, aggiungere da 0,5 a un millilitro di soluzione salina bilanciata di Hank alla camera di imaging. Utilizzare il canale Cy3B con un obiettivo 100X per catturare i segnali fluorescenti delle cellule placcate sulle sonde di tensione della forcina del DNA quando iniziano a diffondersi.Dopo aver preparato il filamento di bloccaggio non fluorescente da 100 microMolar, al punto temporale desiderato, aggiungerlo alle celle ad una concentrazione finale di un microMolar nella camera di imaging per memorizzare il segnale di tensione e mescolarlo con le cellule mediante pipettaggio. Dopo circa 10 minuti di blocco, acquisire filmati time-lapse o immagini endpoint in epifluorescenza sia per la mappatura qualitativa della tensione che per l'analisi quantitativa. Una superficie di successo aveva un colore rosa pallido.L'alta qualità della superficie è stata dimostrata con uno sfondo pulito e la microscopia a contrasto di interferenza di riflessione o canale RICM e intensità di fluorescenza uniforme nel canale Cy3B. Le immagini time-lapse del blocco della tensione hanno indicato che entrambi i segnali di tensione TCR anti-CD3 epsilon e TCR-peptide-MHC sono stati amplificati a causa del blocco della forcina e dell'accumulo del segnale. Il filamento di bloccaggio ha registrato eventi di trazione meccanica di breve durata del peptide TCR MHCN4 a partire da zero minuti, che hanno facilitato l'analisi quantitativa e rivelato il modello distinto della forza MHC del peptide TCR che assomigliava al modello bullseye delle sinapsi immunitarie.Ogni passaggio, la preparazione del substrato della sonda intenzionale richiede attenzione ai dettagli e un'attenta gestione dei materiali. Questa tecnologia consente la visualizzazione delle forze molecolari transitorie che si verificano sulla superficie cellulare quando interagisce con l'ambiente, specialmente nelle cellule immunitarie alla ricerca di antigeni.

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