Name: Epatotectomia parziale nel pesce zebra adulto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 6 s
Description: Scopri il protocollo di epatectomia parziale in Danio rerio adulti per studiare la rigenerazione epatica. Questo metodo consente analisi precise dei meccanismi molecolari e cellulari con rilevanza clinica per le malattie umane.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

I.M.O. è supportato dal NIAAA (F32AA027135). W.G. è supportato da R01DK090311, R01DK105198, R24OD017870 e dal Claudia Adams Barr Program for Excellence in Cancer Research. W.G. è uno studioso di scienze biomediche di Pew.

Zebrafish sono stati allevati e allevati secondo procedure standard. Gli esperimenti sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali del Brigham and Women's Hospital (2016N000405). I pesci zebra adulti sono stati digiunati per 24 ore prima dell'inizio del protocollo. L'acqua del sistema si riferisce all'acqua nei serbatoi di alloggiamento del pesce zebra nella struttura acquatica.
1. Preparazione e anestesizzazione
<ol><li>Preparare la soluzione di Tricaine 0,016% nell'acqua del sistema. ATTENZIONE: La tricaina è irritante se viene a contatto con gli occhi, la pelle o le vie respiratorie.</li>
	<li>Preparare una spugna per tenere il pesce zebra anestetizzato durante il protocollo di dissezione. Tagliare una spugna piena in quarti. Utilizzando una lama di rasoio, rimuovere un sottile cuneo di spugna che corre parallelo al lungo asse del quarto di spugna.<ol>
<li>La fessura dovrebbe essere abbastanza lunga da ospitare un pesce adulto (questo varierà tra diverse dimensioni di pesce). Ad esempio, per un pesce adulto di 35 mm di lunghezza, la lunghezza della fessura dovrebbe essere di 20 mm. La testa e il corpo sono comodamente tenuti nella spugna, ma la coda corre oltre il bordo della spugna (Figura 1B).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Immergere la spugna in soluzione di Tricaine allo 0,016%.</li>
	<li>Posizionare il pesce zebra adulto (maschio o femmina) in 625 mL di soluzione di Tricaine 0,016%.</li>
	<li>Incubare per 6 minuti o fino a quando il pesce non risponde al tatto.</li>
	<li>Utilizzando le flessure, rimuovere con cura il pesce dal serbatoio di Tricaine e posizionare il lato ventrale del pesce nella scanalatura dellaspugna (Figura 1A - B).</li>
	<li>Posizionare la spugna sotto un microscopio sezionato con illuminazione dall'alto verso il basso.</li>
</ol>2. Chirurgia
<ol><li>Usando forcep fini, pizzicare la pelle e ridimensionare medialmente, appena posteriore al cuore (Figura 1B).</li>
	<li>Utilizzando forbici a molla, effettuare un taglio sotto le forcep per creare un foro nella cavità corporea (Figura 1C - D). Fare attenzione a non ferire il cuore o un vaso sanguigno principale, in quanto ciò comporterà un aumento della mortalità.</li>
	<li>Utilizzando forbici a molla, fare un'incisione di 3-4 mm lungo l'addome, elaborando posteriormente fino a quando l'incisione arriva alle pinne pelviche(Figura 1D - E). A questo punto, il lobo ventrale del fegato può essere visibile attraverso l'incisione.</li>
	<li>Spremere i lati della spugna con una mano per forzare gli organi viscerali fuori dalla cavità corporea. Il lobo ventrale del fegato sarà visibile sopra l'intestino(figure 1F,2A-B). Il fegato apparirà come una struttura rosa o arancione distribuita sull'intestino bruno-dorato. A questo punto vengono recuperati animali designati come controlli fittizi.</li>
	<li>Spremere le forcep sottili in modo che i due denti si tocchino. Pur mantenendo la pressione sulla spugna, far scorrere i denti delle forcep fini tra il fegato e l'intestino (Figura 1G). Fai attenzione a non forare l'intestino, poiché ciò comporterà un aumento della mortalità.</li>
	<li>Rilassare lentamente la pressione sui farsa in modo che i denti si allontanino l'uno dall'altro(Figura 1H). Questa azione scorrevole aggredisce i numerosi attacchi delle vene portale tra il lobo ventrale e l'intestino(Figura 2B),ed è necessaria per rimuovere in modo pulito il lobo ventrale. Ripetere questo processo fino a quando tutte le connessioni del portale tra fegato e intestino non sono state recise.</li>
	<li>Sbucciare il lobo ventrale dall'intestino usando forcep fini e tagliare il lobo ventrale libero dal resto del fegato (Figura 1I).</li>
	<li>Questa procedura si traduce in un'epatotectomia parziale di un terzo (figura 1J).</li>
</ol>3. Recupero
<ol><li>Rimuovere con cura il pesce dalla spugna e posizionarelo in un serbatoio di acqua di sistema.</li>
	<li>Il sistema pipette innaffia sulle branchie per alcuni minuti fino a quando il pesce nuota da solo(Figura 1K).</li>
	<li>Monitorare i pesci per 2-4 ore prima di rimetterli sul sistema. Non nutrire il pesce per un pieno 24 ore dopo l'intervento chirurgico.</li>
	<li>Monitorare quotidianamente i pesci per tutta la durata dell'esperimento.</li>
	<li>Con il tempo, l'incisione nella parete corporea guarirà naturalmente senza la necessità di suture(Figura 1L,2C).</li>
</ol>4. Analisi della lunghezza da lobo ventrale a intestino
<ol><li>Eutanasia di tutti gli animali destinati all'analisi in acqua ghiacciata per 10 minuti fino a quando non cessano tutti i movimenti opercolari.</li>
	<li>Rimuovere il pesce dall'acqua ghiacciata e posizionarlo lato ventrale verso l'alto nel solco di una spugna.</li>
	<li>Utilizzando forbici a molla, fare un'incisione nella parete del corpo ventrale nella posizione anteriore-posteriore del cuore. Quindi fare altre due incisioni che corrono lungo l'asse anteriore-posteriore dalla prima incisione fino alle pinne pelviche. (Figura 2A).</li>
	<li>Sbucciare la pelle e il muscolo per rivelare gli organi viscerali (Figura 2A).</li>
	<li>Acquisire immagini luminose e fluorescenti degli organi viscerali utilizzando un microscopio a epifluorescenza. Questo campo visivo includerà l'area in cui è stato rispecchiato il lobo ventrale. Poiché gli animali vengono eutanasiati prima dell'analisi, questo tipo di analisi impedisce l'imaging a lungo termine dello stesso pesce.</li>
</ol>5. Analisi del rapporto fegato/peso corporeo
<ol><li>Eutanasia di tutti gli animali destinati all'analisi in acqua ghiacciata per 10 minuti fino a quando non cessano tutti i movimenti opercolari.</li>
	<li>Mettere il pesce in un tubo conico da 50 ml.</li>
	<li>Aggiungere 25 ml di paraformaldeide al 4% in 1x PBS e 0,3% di Interpolazione al tubo. ATTENZIONE: La formaldeide è tossica e le soluzioni contenenti formaldeide devono sempre essere lavorate in una cappa chimica.</li>
	<li>Nutato per 48 h a 4 °C.</li>
	<li>Eseguire quattro lavaggi da 10 minuti in 1x PBS e 0,3% tween.</li>
	<li>Recuperare il pesce con le affelli e asciugare su un tovagliolo di carta.</li>
	<li>Registrare il peso dell'intero pesce.</li>
	<li>Utilizzando forbici a molla, fare un'incisione nella parete del corpo ventrale nella posizione anteriore-posteriore del cuore. Quindi, fare altre due incisioni che corrono lungo l'asse anteriore-posteriore dalla prima incisione fino alle pinne pelviche. (Figura 2A).</li>
	<li>Sbucciare la pelle e il muscolo per rivelare gli organi viscerali (Figura 2A).</li>
	<li>Acquisire immagini a campo luminoso del fegato utilizzando un microscopio a epifluorescenza.</li>
	<li>Sezionare il fegato, posizionando i pezzi di fegato su una barca di pesatura.</li>
	<li>Registrare il peso del fegato.</li>
</ol>

<ol><li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+liver+regeneration+and+growth+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">Principles of liver regeneration and growth homeostasis.</a> Comprehensive Physiology. 3, 485-513 (2013).</li>
<li>Wang, S., Miller, S. R., Ober, E. A., Sadler, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+it+new+again%3A+insight+into+liver+development%2C+regeneration%2C+and+disease+from+zebrafish+research%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Making it new again: insight into liver development, regeneration, and disease from zebrafish research.</a> Current Topics in Developmental Biology. 124, (2017).</li>
<li>Michalopoulos, G. K., Bhushan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+regeneration%3A+biological+and+pathological+mechanisms+and+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Liver regeneration: biological and pathological mechanisms and implications.</a> Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. , (2020).</li>
<li>Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+for+complex+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model for complex tissue regeneration.</a> Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).</li>
<li>Sadler, K. C., Krahn, K. N., Gaur, N. A., Ukomadu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+growth+in+the+embryo+and+during+liver+regeneration+in+zebrafish+requires+the+cell+cycle+regulator+uhrf1%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Liver growth in the embryo and during liver regeneration in zebrafish requires the cell cycle regulator uhrf1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 1570-1575 (2007).</li>
<li>Goessling, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APC+mutant+zebrafish+uncover+a+changing+temporal+requirement+for+wnt+signaling+in+liver+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development.</a> Developmental Biology. 320, 161-174 (2008).</li>
<li>Dovey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topoisomerase+II+is+required+for+embryonic+development+and+liver+regeneration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Topoisomerase II is required for embryonic development and liver regeneration in zebrafish.</a> Molecular and Cellular Biology. 29, 3746-3753 (2009).</li>
<li>Kan, N. G., Junghans, D., Belmonte, J. C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensatory+growth+mechanisms+regulated+by+BMP+and+FGF+signaling+mediate+liver+regeneration+in+zebrafish+after+partial+hepatectomy%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Compensatory growth mechanisms regulated by BMP and FGF signaling mediate liver regeneration in zebrafish after partial hepatectomy.</a> The FASEB Journal. 23, 3516-3525 (2009).</li>
<li>Zhu, Z., Chen, J., Xiong, J. W., Peng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haploinsufficiency+of+Def+activates+p53-dependent+TGF%CE%B2+signalling+and+causes+scar+formation+after+partial+hepatectomy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Haploinsufficiency of Def activates p53-dependent TGFβ signalling and causes scar formation after partial hepatectomy.</a> PLoS One. 9, (2014).</li>
<li>Feng, G., Long, Y., Peng, J., Li, Q., Cui, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+characterization+of+the+dorsal+lobes+after+hepatectomy+of+the+ventral+lobe+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic characterization of the dorsal lobes after hepatectomy of the ventral lobe in zebrafish.</a> BMC Genomics. 16, 979(2015).</li>
<li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Liver regeneration.</a> Journal of Cellular Physiology. 213, 286-300 (2007).</li>
<li>Grisham, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organizational+principles+of+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22The+Liver%3A+Biology+and+Pathobiology%3A+Fifth+Edition%22%5BJournal%5D)">Organizational principles of the liver.</a> The Liver: Biology and Pathobiology: Fifth Edition. , 1-15 (2009).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Le differenze anatomiche tra zebrafish e modelli di mammiferi per la rigenerazione del fegato presentano sfide uniche per la resezione epatica. Il fegato nei pesci zebra è nelle immediate vicinanze del cuore e dell'intestino; inavvertitamente dannoso per entrambi gli organi si traduce in un aumento della mortalità. Il fegato di zebrafish non è incapsulato, rendendo più difficile separarsi dall'intestino. Il fegato riceve sangue ricco di nutrienti dall'intestino attraverso le vene portale. Nei mammiferi, le vene che lasci...

Tra gli organi solidi nell'uomo, il fegato è l'unico organo in grado di rigenerazione1. Questo è fondamentale, in quanto il fegato è un organo essenziale, responsabile delle principali funzioni metaboliche, conservazione dell'energia, disintossicazione del sangue, secrezione di proteine plasmatiche e produzione di bile2. Gli epatociti persi a causa di danni tossici o infiammatori vengono sostituiti principalmente attraverso la divisione degli epatociti rimanenti1. Un modello sperimentale classico per lo studio della rigenerazione epatica è l'epatomia parziale, in cui vengono rimossi i singoli lobi del fegato, lasciando intatti i lobirimanenti 3. Questa procedura è stata inizialmente sviluppata nei ratti, in cui vengono rimossi circa due terzi della massa epatica. Dopo un'epatomia parziale nei mammiferi, la rigenerazione compensativa si verifica nei lobi rimanenti fino a quando il fegato non recupera la sua massa iniziale. In particolare, il fegato di mammifero non sostituisce i lobi mancanti.
I pesci zebra (Danio rerio) rappresentano un modello trattabile per lo studio della rigenerazione di organi adulti4. Il fegato di zebrafish, sebbene strutturalmente diverso dal fegato di mammifero, è costituito dagli stessi tipi di cellule e svolge la stessa funzione dei mammiferi2. È composto da tre lobi, con due lobi dorsali e un singolo lobo ventrale che sono appiattiti lungo l'intestino. L'epatotomia parziale è stata precedentemente eseguita in zebrafish, con resoconti contrastanti sulla modalità precisa di rigenerazione. Tipicamente, un'epatotectomia parziale di un terzo viene eseguita rimozione dell'intero lobo ventrale. I primi rapporti indicavano che dopo la rimozione del lobo ventrale, è stato completamente rigenerato entrouna settimana 5,6,7, suggerendo che a differenza del fegato di mammifero, il fegato di zebrafish è in grado di rigenerazione epimorfica. Studi successivi hanno dimostrato che la rimozione del lobo ventrale ha portato alla rigenerazione compensativa nei lobi dorsali, piuttosto che alla rigenerazione del lobo ventrale mancante e, in ultima analisi, al recupero della massa epatica entrouna settimana 8,9. La profilazione trascrittamica dei lobi dorsali a seguito della resezione del lobo ventrale ha rivelato cambiamenti significativi associati alla rigenerazionecompensativa 10. Dato che la modalità di rigenerazione epatica può variare con l'entità dellalesione 8, abbiamo ipotizzato che le discrepanze nei risultati possano essere dovute a variazioni tecniche nel protocollo parziale di epatomia tra gruppi di ricerca.
Questo protocollo descrive una procedura per eseguire un'epatotectomia parziale di un terzo sul pesce zebra adulto rimuovendo il lobo ventrale. Questa tecnica sarà preziosa per valutare i meccanismi di rigenerazione epatica.

<table><tbody><tr><td>Soluzione acquosa di paraformaldeide al 16%,</td><td>microscopia elettronica</td> di grado EM Sciences <td>15700</td><td></td></tr><tr><td>Provette per centrifuga Falcon da 50 mL, polipropilene, sterile</td><td>Corning</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>AS 82/220.R2 PLUS Bilancia analitica</td><td>Bilancia analitica Bay State Scale & Sistemi, INC.</td><td>WL-104-1051</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Pinze</td><td>Strumenti per le scienze fini</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>EMS Kuehne Coverglass/Pinze per campioni Microscopia</td><td>elettronica Scienze</td><td>72997-07</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio per epifluorescenza</td><td>Zeiss</td><td>Discovery.V8</td><td></td></tr><tr><td>Mastertop Spugna per pulizia in cellulosa</td><td>Amazon</td><td>B07CBSM53Z</td><td></td></tr><tr><td>PBS10X Liquid Conc 4L</td><td>EMD Millipore</td><td>6505-4L</td><td></td></tr><tr><td>Micro forbici super fini, 3 1/4" dritte</td><td>Strumenti di ricerca biomedica</td><td>11-1020</td><td></td></tr><tr><td>Tricaina metansolfonato</td><td>Syndel</td><td>TRIC-M-GR-0010</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20, Fisher BioReagents</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr></tbody></table>

epatotectomia parziale nel pesce zebra adulto

Partial Hepatectomy in Adult Zebrafish

L'insufficienza epatica è una delle principali cause di morte in tutto il mondo e la mortalità per malattie croniche del fegato sta aumentando bruscamente negli Stati Uniti. I fegati sani sono in grado di rigenerarsi da danni tossici, ma nelle malattie epatiche avanzate, la naturale capacità del fegato di rigenerarsi è compromessa. Zebrafish è emerso come un potente sistema sperimentale per lo studio della rigenerazione. Sono un modello ideale per studiare la rigenerazione epatica dall'epatomia parziale, una procedura con rilevanza clinica diretta in cui parte del fegato viene rimossa chirurgicamente, lasciando intatto il resto. Non esiste un protocollo standard per l'epatotomia parziale; studi precedenti che utilizzano questo modello hanno utilizzato protocolli leggermente diversi e riportato risultati disparati. Qui descritto è un protocollo efficiente e riproducibile per eseguire un'epatotectomia parziale nel pesce zebra adulto. Usiamo questa tecnica per dimostrare che i pesci zebra sono in grado di rigenerazione epimorfica del lobo reinsediato. Questo protocollo può essere utilizzato per interrogare ulteriormente i meccanismi necessari per la rigenerazione epatica nel pesce zebra.

Al fine di esaminare il potenziale rigenerativo del fegato di zebrafish adulto, abbiamo eseguito un'epatotectomia parziale (PHX) nel pesce zebra adulto. In generale, sono stati selezionati grandi adulti (30-40 mm di lunghezza), che vanno da 1,5 a 2,5 anni. All'interno dei singoli esperimenti, gli animali venivano selezionati dallo stesso serbatoio e corrispondevano all'età e alle dimensioni. Come controllo appropriato, abbiamo utilizzato interventi chirurgici fittizi in cui l'animale è stato anestetizzato e ha ricevuto u...

Questo protocollo descrive la procedura per rimuovere il lobo ventrale del fegato nel pesce zebra adulto per consentire lo studio della rigenerazione epatica.

Epatotectomia parziale nel pesce zebra adulto

Liver failure is one of the leading causes of death worldwide, and mortality from chronic liver disease is rising sharply in the United States. Healthy ...

Questo protocollo consentirà ai ricercatori di sfruttare gli strumenti chimici e genetici disponibili per studiare i meccanismi di rigenerazione epatica nel pesce zebra. L'epatomia parziale consente la rimozione precisa dei tessuti per stimolare la rigenerazione epatica senza la necessità degli effetti a livello corporeo di lesioni epatiche tossiche. Solo comprendendo i meccanismi molecolari e cellulari di rigenerazione epatica possiamo progettare nuove terapie per trattare pazienti con malattie epatiche avanzate.Per iniziare, rimuovere il pesce dal serbatoio di Tricaine usando le forcep e incorporarli nel solco di una spugna imbevuta di Tricaine con il lato ventrale verso l'alto. Quindi posizionare la spugna sotto un microscopio sezionato con illuminazione dall'alto verso il basso. Pizzicare la pelle e le squame appena posteriori al cuore con forcep fini e creare un buco nella cavità corporea facendo un taglio sotto le forcep con la forbice caricata a molla.Ruotare la spugna e fare un'incisione da tre a quattro millimetri lungo l'addome tagliando posterialmente verso le pinne pelviche. Quindi ruotare la spugna indietro. Spremere i lati della spugna con una mano per forzare gli organi viscerali fuori dalla cavità corporea.Il lobo ventrale del fegato è presente sopra l'intestino e il fegato è una struttura rosa o arancione distribuita sull'intestino marrone dorato e può essere chiaramente visualizzato con la fluorescenza CFP. Spremere le forcep fini in modo che i denti si tocchino a vicenda e far scorrere i denti tra il fegato e l'intestino. Quindi separare lentamente i denti per rompere gli attacchi delle vene portale tra il fegato e l'intestino.Ripetere questo processo fino a quando tutte le connessioni del portale tra fegato e intestino sono state recise e estrarre il lobo ventrale dall'intestino usando forcep fini. Tagliare il lobo ventrale libero dal resto del fegato. L'esame dell'animale con fluorescenza CFP dimostra che il lobo ventrale è stato rimosso.Al termine, trasferire attentamente il pesce dalla spugna nel serbatoio contenente acqua del sistema e trasmettere l'acqua del sistema sulle branchie per alcuni minuti fino a quando il pesce non si riprende e nuota da solo. Dopo aver eutanasiato il pesce, rimuoverlo dall'acqua ghiacciata. Posizionarlo nella scanalatura di una spugna con il lato ventrale verso l'alto e fare un'incisione della parete del corpo ventrale nella posizione posteriore anteriore del cuore.Quindi fare altre due incisioni dai bordi della prima incisione che corrono lungo l'asse posteriore anteriore alle pinne pelviche e sbucciare la pelle e il muscolo per rivelare gli organi viscerali. Gli organi viscerali possono ora essere visualizzati sia con il campo luminoso che con la microscopia a fluorescenza. Il recupero del fegato dopo l'epatomia parziale è stato stimato calcolando il rapporto fegato/peso corporeo, che era dell'1,8% per i maschi e del 3,3% per le femmine.Il rapporto fegato/peso corporeo di entrambi i sessi è stato determinato al giorno zero post-intervento e al settimo giorno in epatectomia parziale e controlli fittizi. Al giorno zero post-intervento chirurgico, gli animali fittizi hanno un lobo ventrale visibile, ma negli animali dell'epatomia parziale, il lobo ventrale era completamente assente, il che ha comportato una riduzione del 30% dei maschi e del 20% delle femmine dei rapporti fegato/peso corporeo. Al settimo giorno post-intervento chirurgico negli animali dell'epatomia parziale, il lobo ventrale non è stato rigenerato e i rapporti fegato/peso corporeo in epatomia parziale e controlli fittizi erano comparabili, indicando la massa epatica riconquistata dopo l'epatomia parziale.L'effetto del tempo sulla rigenerazione del lobo ventrale è stato determinato eseguendo un'epatectomia parziale completa di 1/3 e misurando il lobo ventrale al rapporto lunghezza intestino. Il lobo ventrale occupava dal 50 al 100% della lunghezza dell'intestino nei controlli fittizi, ma è stato gravemente ridotto in 1/3 animali epatectomia parziale. Gli animali dell'epatomia parziale nel giorno post-intervento 36 hanno avuto un aumento del rapporto lobo ventrale/intestino rispetto al primo giorno post-intervento chirurgico.Un aumento statisticamente significativo delle dimensioni del lobo ventrale è stato osservato negli animali che si stanno riprendendo dall'epatomia parziale nel giorno post-intervento 36 rispetto al primo giorno, ma non nei controlli fittizi. Alcuni animali hanno rigenerato il lobo ventrale, ma alcuni no, indicando variazioni nella risposta chirurgica. La parte più critica di questo protocollo è separare in modo pulito il fegato e l'intestino in modo che il lobo ventrale possa essere completamente rimosso.L'epatomia parziale nel pesce zebra può essere eseguita in linee mutanti o transgeniche per dire che il fabbisogno genetico per la rigenerazione epatica.

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Il trapianto di midollo renale intero in Zebrafish adulti

Il rene zebrafish è la patria di entrambi renale ematopoietiche adulte e cellule staminali / progenitrici, e rappresenta una straordinaria opportunità per studiare questi tipi di cellule e la loro progenie in un organismo modello vertebrato. Qui, dimostriamo una procedura dettagliata dissezione che consente al ricercatore di identificare e rimuovere chirurgicamente il rene adulto pesce zebra, che può essere utilizzata per applicazioni quali l'isolamento delle cellule, il trapianto, e studi di...

Dissezione del rene Zebrafish adulti

L'articolo descrive l'ablazione epatica mirata, un metodo per indurre la morte degli epatociti con metronidazolo in larve di pesce zebra transgenico. Il protocollo di esempio descrive il processo per la generazione, la manipolazione e la valutazione dell'ablazione epatica mirata nel pesce zebra.

Ablazione epatica mirata: induzione della morte degli epatociti con metronidazolo nelle larve di pesce zebra transgenico

L'uso del pesce zebra per la ricerca cardiovascolare si sta espandendo verso la ricerca sui cuori adulti. Per queste applicazioni, l'isolamento rapido e semplice dei tessuti cardiaci è fondamentale per evitare modifiche post-mortem e per ottenere un numero adeguato di campioni. Qui, descriviamo un metodo rapido e riproducibile per sezionare i cuori di pesce zebra adulto.

Recupero di Zebrafish adulti cuori per applicazioni ad alta velocità effettiva

Per aiutare a valutare i meccanismi molecolari alla base della rigenerazione epatica guidata dalle vie biliari del pesce zebra, abbiamo stabilito un modello di danno epatico in cui gli epatociti che esprimono nitroreduttasi vengono geneticamente ablati dopo il trattamento con metronidazolo.  In questo protocollo, descriviamo come manipolare, monitorare e analizzare abilmente l'ablazione degli epatociti e la rigenerazione epatica indotta dalle vie biliari.

Ablazione specifiche Hepatocyte in Zebrafish allo Studio biliare-driven Liver Regeneration

La fibrosi sostenuta con deposizione di proteine della matrice extracellulare eccessive porta alla cirrosi. L'abuso di alcol è una delle principali cause di gravi malattie del fegato. Abbiamo stabilito un modello di fegato fibrotico di zebrafish indotto da etanolo per studiare i meccanismi e le strategie di promozione della rigenerazione degli epatociti in seguito a danno indotto dall'alcol.

Sviluppo di un modello di fegato Fibrotic etanolo-indotta in zebrafish per studiare progenitrici cellulo-mediata epatociti Rigenerazione

Questo protocollo descrive le analisi istologiche dei fegati delle larve di zebrafish che sono state trattate con 2% di etanolo per 24 ore. Tale trattamento di etanolo acuto provoca steatosi epatica e gonfiore della vasculatura epatica.

Analisi istologiche di lesioni al fegato acuto alcolico in Zebrafish

Rimane una grande sfida di sviluppare condizionale gene knock-out o efficace gene-atterramento in organi di zebrafish adulto. Qui segnaliamo un protocollo per la performante siRNA nanoparticella-mediata silenziamento genico nel cuore adulto zebrafish, fornendo così un nuovo metodo di perdita di funzione per lo studio di organi adulti in zebrafish e altri organismi di modello.

Nanoparticelle-mediata siRNA silenziamento genico nel cuore di Zebrafish adulto

Qui dimostriamo un metodo per quantificare le dimensioni del fegato nel pesce zebra larvale, fornendo un modo per valutare gli effetti delle manipolazioni genetiche e farmacologiche sulla crescita e lo sviluppo del fegato.

Quantificare le dimensioni del fegato nel pesce zebra Larval utilizzando la microscopia Brightfield

Qui, presentiamo come generare un modello di zebrafish con carcinoma epatocellulare (HCC) associato alla malattia del fegato grasso non alcolico (NAFLD) per studiare l'impatto del surplus di colesterolo sul microambiente epatico e sul panorama delle cellule immunitarie.

Analisi del microambiente epatico durante la progressione precoce del carcinoma epatocellulare associato alla steatosi epatica non alcolica nel pesce zebra

Viene descritto un nuovo metodo di iniezione intraperitoneale (IP) nel pesce zebra adulto. Quando si maneggiano composti tossici come la doxorubicina, questa procedura è più efficace dei due metodi IP precedentemente riportati. La tecnica è progettata per essere facilmente adottata da ricercatori con esperienza limitata nel modello del pesce zebra.

Una tecnica di iniezione intraperitoneale nel pesce zebra adulto che riduce al minimo i danni al corpo e la mortalità associata

Scopri il protocollo di epatectomia parziale in Danio rerio adulti per studiare la rigenerazione epatica. Questo metodo consente analisi precise dei meccanismi molecolari e cellulari con rilevanza clinica per le malattie umane.

Epatotectomia parziale nel pesce zebra adulto

Esplora altri video