Strategie per l'ottimizzazione dell'acquisizione dei dati della tomografia elettronica criogenica

La crescente domanda di raccolta dati su larga scala nella tomografia elettronica criogenica richiede routine di acquisizione delle immagini ad alto rendimento. Qui è descritto un protocollo che implementa i recenti sviluppi di strategie di acquisizione avanzate volte a massimizzare l'efficienza temporale e il throughput della raccolta dei dati tomografici.

L'impostazione di una sessione di raccolta dati su larga scala è una procedura che richiede molto tempo e che può ridurre considerevolmente il tempo rimanente del microscopio disponibile per l'acquisizione della serie tilt. Questo metodo consente una rapida configurazione dell'acquisizione automatica dei dati di tomografia su larga scala per massimizzare l'efficienza temporale degli esperimenti di tomografia che richiedono un'attenta selezione degli obiettivi di acquisizione. Inizia aprendo un'istanza SerialEM fittizia.

Una volta mappato il primo quadrato della griglia, utilizzare l'opzione di menu del navigatore SerialEM per visualizzare il montaggio nell'istanza SerialEM fittizia. Fare doppio clic sulla finestra del navigatore per aprire la mappa quadrata della griglia. Cerca nella mappa e utilizza l'opzione fittizia del navigatore SerialEM per aggiungere punti per aggiungere punti di acquisizione di immagini sul target di interesse.

Dopo aver mappato i nuovi quadrati, salvare il file del navigatore e unire nuovamente il navigatore. Continuare fino a quando tutti i quadrati della griglia non sono mappati. Ancora una volta, unisci il file di navigazione con l'istanza SerialEM fittizia.

Eseguire lo script delle mappe virtuali Pi EM dal menu SerialEM fittizio. Selezionare gli strumenti e selezionare le mappe di ancoraggio virtuali. Questa visualizzazione potrebbe richiedere del tempo a seconda delle dimensioni e della quantità delle mappe quadrate della griglia, nonché del binning delle mappe di visualizzazione e anteprima.

Per garantire prestazioni adeguate del microscopio, utilizzare la stessa impostazione di ingrandimento e dimensione del fascio per l'acquisizione dei dati nell'ordine seguente. Eseguite l'allineamento senza coma serialEM tramite CTF. Inserite e centrate un'apertura dell'obiettivo.

Esegui SerialEM corretto astigmatismo da CTF e GIF rapida melodia. In SerialEM, apri il nuovo file navigatore. Deseleziona tutti i punti A.

Selezionare le prime mappe di visualizzazione. Seleziona comprimi. Fare clic su A due volte e deselezionare Comprimi.

Selezionare la prima posizione della mappa di visualizzazione. Premere Maiusc T, quindi selezionare l'ultima posizione della mappa di visualizzazione e premere di nuovo Maiusc T. Scegliere immagini a fotogramma singolo nelle proprietà del file per aprire una finestra di dialogo.

Nella finestra di dialogo delle proprietà del file successiva, selezionare i parametri desiderati in base alle esigenze di imaging e alla configurazione dello strumento. Quando richiesto, dare un nome con un numero e fare clic su Salva. Impostare il controller della serie tilt per la prima posizione TS.

Al termine, fare clic su OK per impostare questi parametri per tutte le serie di inclinazione dopo questo elemento di acquisizione. Tutte le mappe di anteprima sono ora selezionate come TS con un nome file numerato. Se necessario, impostare la distanza di messa a fuoco/traccia per ciascun bersaglio.

Fare doppio clic sulla mappa di visualizzazione per caricarla. Selezionare la mappa di anteprima nell'elenco dei navigatori. Quindi selezionare modifica stato attivo nella finestra del navigatore.

Nel pannello di controllo a basso dosaggio, deselezionare l'asse di rotazione tra aree per posizionare la prova e mettere a fuoco lungo l'asse di inclinazione dello stadio. Fare clic sulla regione desiderata nella mappa di visualizzazione caricata per impostare la posizione di prova di messa a fuoco per questa serie di inclinazioni e assicurarsi che l'elemento del navigatore abbia impostato TSP. Ripetere la procedura per tutti gli elementi.

Modificare l'intervallo di messa a fuoco nello script PreTomo che viene eseguito prima di ogni serie di inclinazione. Nel menu Serie di inclinazione SerialEM, controllare Esegui script in TS e selezionare il numero di script dello script DuringTomo durante ogni inclinazione. Controllare il livello del serbatoio dell'azoto e se è selezionato il turbo del caricatore automatico spento.

Controlla lo spazio libero di archiviazione dei dati. Nel menu File SerialEM, deseleziona il salvataggio continuo per il file di registro. Ogni serie di inclinazione otterrà il proprio file di registro.

Dopo aver fatto clic su acquisisci elementi nel menu di navigazione, eseguire lo script PreTomo. Selezionare l'attività principale acquisire serie di inclinazione, quindi selezionare Esegui script dopo PostTomo. Seleziona chiudi valvole a colonna alla fine e invia e-mail alla fine, quindi fai clic su Vai.

71 quadrati adatti sono stati selezionati sulla mappa della griglia a ingrandimento inferiore. Sono state acquisite mappe a medio ingrandimento con impostazioni che consentono la visualizzazione diretta e l'identificazione del campione di interesse, in questo caso i coronavirus. Il tempo di acquisizione è stato di tre minuti per quadrato, tre ore e 45 minuti in totale.

Quando è stata creata la prima mappa quadrata, un'istanza SerialEM fittizia è stata aperta su un computer separato per visualizzare la mappa quadrata e aggiungere punti su bersagli adatti per l'acquisizione di serie di inclinazione. SerialEM a basso dosaggio è stato impostato e le immagini di visualizzazione e anteprima di riferimento sono state prese e salvate come mappe. Queste ultime mappe potrebbero quindi essere utilizzate immediatamente sull'istanza SerialEM fittizia per generare la vista virtuale e l'anteprima virtuale dalle corrispondenti immagini della mappa quadrata.

Le mappe di visualizzazione virtuale sono state utilizzate per un centraggio iniziale del bersaglio, seguito da un centraggio finale eseguito all'ingrandimento effettivo dell'acquisizione della serie di inclinazione utilizzando la mappa di anteprima virtuale. Gli utenti dovrebbero concedersi un sacco di tempo per esplorare il paesaggio di esempio. Dopo aver cercato alcune mappe, si sviluppa una sensazione migliore per le aree di buona qualità da cui raccogliere i dati.