Strategie per l'ottimizzazione dell'acquisizione dei dati della tomografia elettronica criogenica
March 19th, 2021
La crescente domanda di raccolta dati su larga scala nella tomografia elettronica criogenica richiede routine di acquisizione delle immagini ad alto rendimento. Qui è descritto un protocollo che implementa i recenti sviluppi di strategie di acquisizione avanzate volte a massimizzare l'efficienza temporale e il throughput della raccolta dei dati tomografici.
L'impostazione di una sessione di raccolta dati su larga scala è una procedura che richiede molto tempo e che può ridurre considerevolmente il tempo rimanente del microscopio disponibile per l'acquisizione della serie tilt. Questo metodo consente una rapida configurazione dell'acquisizione automatica dei dati di tomografia su larga scala per massimizzare l'efficienza temporale degli esperimenti di tomografia che richiedono un'attenta selezione degli obiettivi di acquisizione. Inizia aprendo un'istanza SerialEM fittizia.
Una volta mappato il primo quadrato della griglia, utilizzare l'opzione di menu del navigatore SerialEM per visualizzare il montaggio nell'istanza SerialEM fittizia. Fare doppio clic sulla finestra del navigatore per aprire la mappa quadrata della griglia. Cerca nella mappa e utilizza l'opzione fittizia del navigatore SerialEM per aggiungere punti per aggiungere punti di acquisizione di immagini sul target di interesse.
Dopo aver mappato i nuovi quadrati, salvare il file del navigatore e unire nuovamente il navigatore. Continuare fino a quando tutti i quadrati della griglia non sono mappati. Ancora una volta, unisci il file di navigazione con l'istanza SerialEM fittizia.
Eseguire lo script delle mappe virtuali Pi EM dal menu SerialEM fittizio. Selezionare gli strumenti e selezionare le mappe di ancoraggio virtuali. Questa visualizzazione potrebbe richiedere del tempo a seconda delle dimensioni e della quantità delle mappe quadrate della griglia, nonché del binning delle mappe di visualizzazione e anteprima.
Per garantire prestazioni adeguate del microscopio, utilizzare la stessa impostazione di ingrandimento e dimensione del fascio per l'acquisizione dei dati nell'ordine seguente. Eseguite l'allineamento senza coma serialEM tramite CTF. Inserite e centrate un'apertura dell'obiettivo.
Esegui SerialEM corretto astigmatismo da CTF e GIF rapida melodia. In SerialEM, apri il nuovo file navigatore. Deseleziona tutti i punti A.
Selezionare le prime mappe di visualizzazione. Seleziona comprimi. Fare clic su A due volte e deselezionare Comprimi.
Selezionare la prima posizione della mappa di visualizzazione. Premere Maiusc T, quindi selezionare l'ultima posizione della mappa di visualizzazione e premere di nuovo Maiusc T. Scegliere immagini a fotogramma singolo nelle proprietà del file per aprire una finestra di dialogo.
Nella finestra di dialogo delle proprietà del file successiva, selezionare i parametri desiderati in base alle esigenze di imaging e alla configurazione dello strumento. Quando richiesto, dare un nome con un numero e fare clic su Salva. Impostare il controller della serie tilt per la prima posizione TS.
Al termine, fare clic su OK per impostare questi parametri per tutte le serie di inclinazione dopo questo elemento di acquisizione. Tutte le mappe di anteprima sono ora selezionate come TS con un nome file numerato. Se necessario, impostare la distanza di messa a fuoco/traccia per ciascun bersaglio.
Fare doppio clic sulla mappa di visualizzazione per caricarla. Selezionare la mappa di anteprima nell'elenco dei navigatori. Quindi selezionare modifica stato attivo nella finestra del navigatore.
Nel pannello di controllo a basso dosaggio, deselezionare l'asse di rotazione tra aree per posizionare la prova e mettere a fuoco lungo l'asse di inclinazione dello stadio. Fare clic sulla regione desiderata nella mappa di visualizzazione caricata per impostare la posizione di prova di messa a fuoco per questa serie di inclinazioni e assicurarsi che l'elemento del navigatore abbia impostato TSP. Ripetere la procedura per tutti gli elementi.
Modificare l'intervallo di messa a fuoco nello script PreTomo che viene eseguito prima di ogni serie di inclinazione. Nel menu Serie di inclinazione SerialEM, controllare Esegui script in TS e selezionare il numero di script dello script DuringTomo durante ogni inclinazione. Controllare il livello del serbatoio dell'azoto e se è selezionato il turbo del caricatore automatico spento.
Controlla lo spazio libero di archiviazione dei dati. Nel menu File SerialEM, deseleziona il salvataggio continuo per il file di registro. Ogni serie di inclinazione otterrà il proprio file di registro.
Dopo aver fatto clic su acquisisci elementi nel menu di navigazione, eseguire lo script PreTomo. Selezionare l'attività principale acquisire serie di inclinazione, quindi selezionare Esegui script dopo PostTomo. Seleziona chiudi valvole a colonna alla fine e invia e-mail alla fine, quindi fai clic su Vai.
71 quadrati adatti sono stati selezionati sulla mappa della griglia a ingrandimento inferiore. Sono state acquisite mappe a medio ingrandimento con impostazioni che consentono la visualizzazione diretta e l'identificazione del campione di interesse, in questo caso i coronavirus. Il tempo di acquisizione è stato di tre minuti per quadrato, tre ore e 45 minuti in totale.
Quando è stata creata la prima mappa quadrata, un'istanza SerialEM fittizia è stata aperta su un computer separato per visualizzare la mappa quadrata e aggiungere punti su bersagli adatti per l'acquisizione di serie di inclinazione. SerialEM a basso dosaggio è stato impostato e le immagini di visualizzazione e anteprima di riferimento sono state prese e salvate come mappe. Queste ultime mappe potrebbero quindi essere utilizzate immediatamente sull'istanza SerialEM fittizia per generare la vista virtuale e l'anteprima virtuale dalle corrispondenti immagini della mappa quadrata.
Le mappe di visualizzazione virtuale sono state utilizzate per un centraggio iniziale del bersaglio, seguito da un centraggio finale eseguito all'ingrandimento effettivo dell'acquisizione della serie di inclinazione utilizzando la mappa di anteprima virtuale. Gli utenti dovrebbero concedersi un sacco di tempo per esplorare il paesaggio di esempio. Dopo aver cercato alcune mappe, si sviluppa una sensazione migliore per le aree di buona qualità da cui raccogliere i dati.
Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo progettato per migliorare l'efficienza della tomografia elettronica criogenica, affrontando la necessità di una raccolta dati su larga scala. Il metodo si concentra sull'ottimizzazione della configurazione di imaging per garantire un'elevata produttività durante l'acquisizione di serie di inclinazione, migliorando significativamente l'utilizzo del microscopio.
Componenti chiave dello studio
Area di ricerca
- Tomografia elettronica criogenica
- Acquisizione di immagini ad alto rendimento
- Tecniche di microscopia
Contesto
- Aumentata domanda di raccolta dati su larga scala
- Configurazioni che richiedono molto tempo possono limitare il tempo effettivo di utilizzo del microscopio
- Importanza di metodi efficienti di raccolta dati tomografici
Metodi utilizzati
- Protocollo per l'acquisizione automatica dei dati di tomografia
- Utilizzo di SerialEM per la navigazione nella mappatura delle griglie
- Implementazione di mappe virtuali per il centraggio del bersaglio
Principali risultati
- Sono state identificate 71 griglie quadrate per l'acquisizione dei dati
- Raccolta dati efficiente con un tempo totale di acquisizione di 3 ore e 45 minuti
- Capacità dimostrata di visualizzare efficacemente campioni di coronavirus
Conclusioni
- Questo studio illustra un approccio semplificato all'imaging ad alto rendimento in tomografia
- I risultati sottolineano l'importanza di massimizzare l'efficienza di acquisizione nella ricerca biologica
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Efficient cryogenic electron tomography (cryoET) data acquisition is critical for high-resolution structural biology, enabling rapid and reproducible 3D analysis of macromolecular complexes. Automated workflows using SerialEM and PyEM streamline grid mapping and target selection, maximizing microscope utilization and reducing operational bottlenecks. These advances directly impact early discovery and structural validation pipelines in biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Accelerates structural interrogation of biological assemblies in near-native states.
- Supports functional target validation by enabling high-throughput acquisition of tilt series.
- Improves predictive confidence in macromolecular complex analysis for portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Enables preparation of validated 3D structural datasets for downstream screening workflows.
- Standardizes acquisition routines, enhancing reproducibility and quantitative output quality.
- Facilitates scalable, automated data collection for reliable compound evaluation platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural data acquisition with disease-relevant systems, such as viral particles.
- Ensures continuity from discovery-stage imaging to preclinical structural validation.
- Reduces risk in translational research by supporting robust, high-throughput data generation.
Pipeline & Workflow Integration
This automated cryoET workflow integrates from early discovery through lead identification and preclinical research, supporting structural hypothesis testing and target de-risking.
- Discovery Biology: Enables rapid hypothesis testing and pathway clarification via high-resolution 3D imaging.
- Screening: Provides reproducible, quantitative tilt series datasets for assay readiness.
- Analytics: Delivers standardized measurements and readouts for comparative structural analysis.
- Translational Research: Supports biomarker alignment and preclinical continuity when imaging disease-relevant complexes.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable platform for automated tomography data acquisition across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in structural studies.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput of data acquisition sessions.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by maximizing instrument time.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryoEM instrumentation and data analysis software.
- Depends on access to high-end transmission electron microscopes and computational infrastructure.
- Demands cross-team standardization of acquisition parameters and data management practices.
- May require adaptation for different sample types or grid formats.
- Operational limitations include manual input for initial target selection and quality assessment.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:38
Selecting the Targets
1:31
Generate Virtual Maps
2:07
Microscope Tuning
2:43
Set up Navigator
4:05
Set the Focus/Track Positions
5:00
Set up Additional Scripts
5:27
Run
6:19
Results: Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition
7:46
Conclusion
