Name: Differenziazione diretta di cellule endoteliali emogeniche da cellule staminali pluripotenti umane (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 23 s
Description: Scopri un protocollo per differenziare cellule endoteliali emogeniche da cellule staminali pluripotenti umane in circa una settimana. Questo metodo senza siero e senza feeder facilita lo studio della transizione endoteliale-ematopoietica.

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Questo lavoro è stato parzialmente supportato dalle sovvenzioni NIH HL128064 e U2EB017103. Un ulteriore supporto è stato fornito dalla sovvenzione CT Innovations 15-RMB-YALE-04.

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L'autore non ha nulla da rivelare.

Qui, vengono delineati i passaggi per la produzione di cellule endoteliali emogeniche da cellule staminali embrionali umane in circa 1 settimana utilizzando un sistema di coltura 2D senza siero e alimentatore murino (Figura 1). Questo protocollo espande un metodo descritto da Sriram et al. (2015) per ottenere EC primordiali38. La natura primordiale e il potenziale di specificazione delle EC CD31+ CD45- sono dimostrate coltivando queste cellule su...

Le cellule endoteliali (ECs) sono una popolazione eterogenea di cellule che svolgono molteplici funzioni in tutto il corpo umano e nei tessuti ingegnerizzati. Oltre a sostenere e regolare altri tipi di cellule (ad esempio, cardiomiociti1, cellule osteoblastiche2), queste funzioni includono la formazione di una barriera selettiva tra sangue e tessuti e l'assistenza nella formazione dei tessuti3. La differenziazione delle EC mature durante lo sviluppo normale richiede diverse vie di segnalazione. Le EC primordiali derivano dai progenitori del mesoderma e sono quindi specificate verso fenotipi arteriosi, venosi, capillari e linfatici maturi4. Inoltre, un piccolo sottogruppo di EC nel sacco vitellino extraembrionale e nella regione embrionale Aorta-Gonad-Mesonephros (AGM) sono anche specificati per diventare EC emogeniche, che danno origine a cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC) che migrano verso il fegato fetale e il midollo osseo fetale, dove rimangono postnatali e generano tutti i tipi di cellule del sangue per tutta la vita4. La vasta gamma di fenotipi EC è essenziale per lo sviluppo e il mantenimento di tutti i tessuti.
Pertanto, le EC e i loro derivati sono componenti critiche di studi volti a modellare e chiarire i meccanismi dello sviluppo umano e / o delle malattie, nonché della medicina rigenerativa e delle applicazioni di ingegneria tissutale 5,6,7,8. Tuttavia, la limitazione principale per questi tipi di studi è la mancanza di disponibilità di EC umane primarie nella quantità richiesta. È stato stimato che per la maggior partedelle applicazioni terapeutiche sarebbero necessarie almeno 3 x 108 CE. Per risolvere questo problema, è stato proposto l'uso di cellule staminali embrionali umane (hESC) e cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSCs) a causa del loro diverso potenziale di lignaggio e della loro capacità di generare un gran numero di progenie 6,9.
Infatti, l'utilità delle cellule derivate da hESCs o hiPSCs è stata dimostrata in molteplici studi incentrati sulla modellizzazione della malattia e sullo screening dei farmaci10,11,12. La tecnologia Organ-on-a-Chip (OOC) è stata utilizzata per ricapitolare più fedelmente la fisiologia del corpo umano integrando cellule e tessuti in scaffold tridimensionali. Inoltre, la connessione di più OOC individuali (un cosiddetto body- o human-on-a-chip, BOC / HOC) può essere realizzata tramite microfluidica per consentire la diafonia tra gli organi di interesse13,14,15. I tessuti di supporto, come il sistema vascolare, sono componenti critici di OOC e BOC / HOC; L'incorporazione della vascolarizzazione consente il trasporto di nutrienti, ossigeno e fattori paracrini in tutti i tessuti, promuovendo così il microambiente tessuto-specifico richiesto 3,12. Pertanto, i metodi per derivare EC umane mature, come le EC arteriose, venose, linfatiche ed emogeniche, sono cruciali per far progredire questi approcci di ingegneria tissutale.
Sono stati pubblicati protocolli multipli che descrivono in dettaglio le fasi per la derivazione di EC primordiali o progenitrici umane da hESC o hiPSCs 5,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 . Molti di questi protocolli si basano sulla formazione di corpi embrioidi (EB) o sulla co-coltura di ESCs/iPSCs con uno strato murino di cellule stromali. Queste strategie tendono ad essere difficili e richiedono tempo, con basse rese EC e / o contaminazione di EC umane con cellule murine. I protocolli che si basano strettamente sulla coltura 2D senza l'uso di cellule stromali spesso richiedono lunghe induzioni, utilizzano complesse combinazioni di fattori di crescita e / o inibitori per l'induzione, hanno periodi di espansione prolungati dopo la separazione cellulare o una combinazione di questi fattori. L'avanzamento della conoscenza delle vie di segnalazione e dei fattori coinvolti nella derivazione di tipi maturi di EC in vivo fornisce le basi per un protocollo di differenziazione in vitro semplice e robusto.
In precedenza, sono stati identificati ruoli chiave per le vie di segnalazione di Notch e acido retinoico (RA) nella specifica delle EC arteriose murine ed emogeniche, rispettivamente, durante lo sviluppo. La via di segnalazione di Notch svolge molteplici ruoli nella specificazione e nel mantenimento del fenotipo EC arterioso. Il lavoro che utilizza il modello di vascolarizzazione retinica murina ha identificato un percorso in cui lo stress di taglio del fluido induce un asse di segnalazione Notch-Cx37-p27, promuovendo l'arresto del ciclo cellulare G1, che consente la specifica EC arteriosa27. È stato ipotizzato che gli stati del ciclo cellulare svolgano un ruolo nelle decisioni sul destino cellulare fornendo finestre di opportunità distinte in cui le cellule sono ricettive a determinati segnali che possono indurre espressione genica e cambiamenti fenotipici28. Questo arresto G1 mediato da Notch ha permesso l'espressione di geni arricchiti nelle EC arteriose, tra cui ephrinB2, Cx40, DLL4, Notch1 e Notch 4 (recensito in29,30). È stato anche dimostrato che la specifica EMOGENIC EC è promossa in vivo tramite la segnalazione RA31,32. Ulteriori studi hanno identificato che, a valle della segnalazione RA, l'espressione di c-Kit e Notch upregola p27, che consente la specificazione emogenica nel sacco vitellino murino e AGM33. Le EC emogeniche murine possono essere minimamente identificate dall'espressione di entrambi i marcatori endoteliali (CD31, KDR) ed ematopoietici (c-Kit, CD34)4. Infine, le EC emogeniche subiscono una transizione endoteliale-ematopoietica (EHT) per formare HSPC, che può dare origine a tutti i tipi di cellule del sangue 4,34,35.
Lavori recenti hanno testato se questa stessa gerarchia di segnalazione può promuovere la specifica EC ematogena umana. Per fare ciò, è stato sviluppato un protocollo di coltura 2D privo di siero e alimentatore per derivare EC emogeniche da hESC, e queste EC emogeniche sono state caratterizzate a livello di singola cellula come CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherin-CD45-. Questo studio ha anche sfruttato il reporter FUCCI (Fluorescent Ubiquitination Cell Cycle Indicator), che identifica diversi stati del ciclo cellulare, utilizzando H9-hESC che esprimono il costrutto del reporter FUCCI (H9-FUCCI-hESC)36. Negli studi con queste cellule, è stato dimostrato che l'AR promuove l'arresto precoce del ciclo cellulare G1 nelle EC e lo stato precoce di G1 consente la specifica ematogena in vitro37. Qui viene fornito un protocollo dettagliato per la differenziazione di queste cellule endoteliali emogeniche umane e saggi che confermano la loro identità. Questo semplice metodo fornisce un mezzo utile per generare questo sottoinsieme specializzato di EC per studi futuri sui meccanismi di sviluppo delle cellule del sangue umano.

<table><tbody><tr><td>Piastre da 15 cm</td><td>Corning</td><td>430599</td><td>trattate con coltura tissutale</td>Piastre</tr> da <tr><td>35 mm</td><td>Corning</td><td>430165</td> piastre a 6 pozzetti <td>trattate con coltura tissutale</td></tr><tr><td></td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Reagente antimicrobico Marca: Normocin</td><td>Invitrogen</td><td>ant-nr-1</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R& Sistemi D</td><td>233-FB-025</td><td>uso a 50 ng/mL</td></tr><tr><td>BMP4</td><td>BioLegend</td><td>595202</td><td>uso a 25 ng/mL</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-1</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di distacco cellulare Marca: Accutase</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7913</td><td></td></tr><tr><td>DLL4</td><td>R& D systems</td><td>1506-D4/CF</td><td>ricombinante umano; uso a 10 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>DMEM:F12</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbco (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Terreno di crescita delle cellule endoteliali Marca: EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit (EGM-2)</td><td>Tubi Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>FACS</td><td>Corning</td><td>352235</td><td>polistirene fondo rotondo con tappo filtrante</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Gemini Bio</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>33016015</td><td>uso a 4 &mu; g/cm2</td></tr><tr><td>GSK3i/CHIR99021</td><td>Stemgent</td><td>04-0004-02</td><td>10 mM stock; utilizzare a 5 &mu; M</td></tr><tr><td>Hanks Soluzione salina bilanciata (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico (HCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144S-500</td><td></td></tr><tr><td>Proteina della matrice&nbsp; Marca: Matrigel</td><td>Corning</td><td>356230</td><td>Fattore di crescita ridotto. Fare riferimento al certificato di analisi del lotto per determinare la concentrazione di proteine (Matrigel). Questa concentrazione è necessaria per calcolare il volume di Matrigel che contiene 1 mg di proteine.</td></tr><tr><td>Terreno a base di metilcellulosa Marca: MethoCult H4435 Enriched</td><td>Stemcell Technologies</td><td>4435</td><td></td></tr><tr><td>Terreno di differenziazione di cellule staminali pluripotenti Marca: STEMdiff APEL 2</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5270</td><td></td></tr><tr><td>Cellule staminali pluripotenti: H1, H9, H9-FUCCI</td><td>WiCell</td><td>WA09 (H9), WA01 (H1)</td><td>umano; H9-FUCCI sono stati ottenuti dal laboratorio del Dr. Ludovic Vallier presso il Cambridge Stem Cell Institute</td></tr><tr><td>Protein-Free Hybridoma Medium (PFMH)</td><td>Gibco</td><td>12040077</td><td></td></tr><tr><td>Acido retinoico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R2625-50mg</td><td>utilizzare a 0,5 &mu; M</td></tr><tr><td>Master mix di trascrizione inversa Marca: iScript Trascrizione inversa Supermix</td><td>BioRad</td><td>1708840 Kit di estrazione dell'RNA</td><td></td></tr><tr><td> Marca: RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio (NaOH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS255-1</td><td></td></tr><tr><td>Terreno di crescita delle cellule staminali Marca: mTeSR1</td><td>Stemcell Technologies</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Verde master mix Marca: iTaq Universal SYBR Green Master Mix</td><td>BioRad</td><td>1725121</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25299956</td><td>0,25%</td></tr><tr><td>VEGF165 (VEGF-A)</td><td>PeproTech</td><td>100-20</td><td>uso a 50 ng/mL</td></tr><tr><td>&alfa;-CD31-FITC</td><td>BioLegend</td><td>303104</td><td>2 &mu; g/mL*</td></tr><tr><td>&alpha;-CD34-Blu Pacifico</td><td>BioLegend</td><td>343512</td><td>2 &mu; g/mL*</td></tr><tr><td>&alfa;-CD45-APC/Cy7</td><td>BioLegend</td><td>304014</td><td>2 &mu; g/mL*</td></tr><tr><td>&alpha;-c-Kit-APC</td><td>BioLegend</td><td>313206</td><td>2 &mu; g/mL*</td></tr><tr><td>&alpha;-Flk-1-PE/Cy7</td><td>BioLegend</td><td>359911</td><td>2 &mu; g/mL*</td></tr><tr><td>&alpha;-VE-Caderina-PE</td><td>BioLegend</td><td>348506</td><td>2 &mu; g/mL*</td></tr><tr><td>* I coniugati fluorescenti anticorpali devono essere ottimizzati in base al selezionatore di cellule utilizzato. Di seguito sono presentate le concentrazioni finali utilizzate in questo studio.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

differenziazione diretta di cellule endoteliali emogeniche da cellule staminali pluripotenti umane

Directed Differentiation of Hemogenic Endothelial Cells from Human Pluripotent Stem Cells

I vasi sanguigni sono distribuiti ubiquitariamente all'interno di tutti i tessuti del corpo e svolgono diverse funzioni. Pertanto, la derivazione di cellule endoteliali vascolari mature, che rivestono i lumi dei vasi sanguigni, da cellule staminali pluripotenti umane è cruciale per una moltitudine di applicazioni di ingegneria e rigenerazione tissutale. In vivo, le cellule endoteliali primordiali derivano dalla linea mesodermica e sono specificate verso sottotipi specifici, tra cui arterioso, venoso, capillare, emogenico e linfatico. Le cellule endoteliali emogeniche sono di particolare interesse perché, durante lo sviluppo, danno origine a cellule staminali e progenitrici ematopoietiche, che generano quindi tutte le linee di sangue per tutta la vita. Pertanto, la creazione di un sistema per generare cellule endoteliali emogeniche in vitro offrirebbe l'opportunità di studiare la transizione endoteliale-ematopoietica e potrebbe portare alla produzione ex vivo di prodotti sanguigni umani e a una ridotta dipendenza da donatori umani. Mentre esistono diversi protocolli per la derivazione di cellule endoteliali progenitrici e primordiali, non è stata descritta la generazione di cellule endoteliali emogeniche ben caratterizzate da cellule staminali umane. Qui viene presentato un metodo per la derivazione di cellule endoteliali emogeniche da cellule staminali embrionali umane in circa 1 settimana: un protocollo di differenziazione con cellule striate primitive formate in risposta all'inibitore GSK3β (CHIR99021), quindi induzione della linea mesodermica mediata da bFGF, seguita dallo sviluppo di cellule endoteliali primordiali promosso da BMP4 e VEGF-A, e infine specificazione di cellule endoteliali emogeniche indotte dall'acido retinoico. Questo protocollo produce una popolazione ben definita di cellule endoteliali emogeniche che possono essere utilizzate per comprendere ulteriormente la loro regolazione molecolare e la transizione endoteliale-ematopoietica, che ha il potenziale per essere applicata alle applicazioni terapeutiche a valle.

Uno schema che delinea le specifiche delle EC primordiali e delle EC emogeniche dalle hESC e un'immagine rappresentativa delle cellule 24 ore dopo la placcatura sono mostrati nella Figura 1. Seguendo le specifiche, le EC primordiali e le EC emogeniche sono FACS purificate rispettivamente nei giorni 5 e 8. Le EC primordiali sono definite come CD31+ CD45- e le EC emogeniche sono definite come CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherin- CD45-...

Presentato qui è un semplice protocollo per la differenziazione diretta delle cellule endoteliali emogeniche da cellule staminali pluripotenti umane in circa 1 settimana.

Differenziazione diretta di cellule endoteliali emogeniche da cellule staminali pluripotenti umane

Blood vessels are ubiquitously distributed within all tissues of the body and perform diverse functions. Thus, derivation of mature vascular endothelial ...

Questo protocollo descrive un metodo per generare una popolazione ben caratterizzata di cellule endoteliali emogeniche umane. Queste cellule possono essere utilizzate per studiare la regolazione molecolare e la transizione endoteliale-ematopoietica. Inizia coltivando cellule staminali embrionali umane per quattro giorni per differenziarle in cellule endoteliali primordiali.Il quinto giorno, aspirare il mezzo sopra le cellule. Quindi lavare delicatamente le cellule con un millilitro di DMEM / F-12 per pozzetto. Aggiungere un millilitro di mezzo di differenziazione delle cellule endoteliali ematogeniche appena preparato per pozzetto e incubare le cellule per 24 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.Il sesto e il settimo giorno, sostituire il mezzo sopra le cellule con un millilitro di mezzo di differenziazione delle cellule endoteliali omogenee appena preparato per pozzetto e incubare le cellule per altre 24 ore. L'ottavo giorno. Dopo aver staccato e lavato le celle, dividerle uniformemente in provette da microcentrifuga su ghiaccio, ciascuna contenente un minimo di 600 microlitri di cellule ad una densità di 1 volte 10 alle 5 celle per millilitro.Aggiungere anticorpi all

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Generazione di linfociti T da staminali pluripotenti indotte (iPS), le cellule fornisce un approccio alternativo di utilizzare cellule staminali embrionali per T cell-based immunoterapia. Il metodo dimostra che utilizzando...

Differenziazione Regia di cellule staminali pluripotenti indotte verso Linfociti T

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Noi, sulla base delle conoscenze della biologia dello sviluppo e della ricerca pubblicata, abbiamo sviluppato un protocollo ottimizzato per generare in modo efficiente neuroni dopaminergici del mesencefalo A9 sia da cellule staminali embrionali umane che da cellule staminali pluripotenti indotte umane, che sarebbero utili per la modellazione della malattia e la terapia di sostituzione cellulare per il morbo di Parkinson.

Regia neuroni dopaminergici differenziazione da cellule staminali pluripotenti umane

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Regia di differenziazione dei progenitori ematopoietici primitivi e definitivo da cellule staminali pluripotenti umane

Qui, presentiamo un protocollo per formare con precisione l'endotelio emogenico dalle cellule staminali pluripotenti umane in una condizione senza alimentatore e xeno. Questo metodo avrà ampie applicazioni nella modellazione della malattia e nello screening per i composti terapeutici.

Differenziazione dell'endotelio endogenico dalle cellule staminali pluripotenti umane in una condizione definita senza alimentatore e Xeno

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