Differenziazione diretta di cellule endoteliali emogeniche da cellule staminali pluripotenti umane
31 marzo 2021
Presentato qui è un semplice protocollo per la differenziazione diretta delle cellule endoteliali emogeniche da cellule staminali pluripotenti umane in circa 1 settimana.
Questo protocollo descrive un metodo per generare una popolazione ben caratterizzata di cellule endoteliali emogeniche umane. Queste cellule possono essere utilizzate per studiare la regolazione molecolare e la transizione endoteliale-ematopoietica. Inizia coltivando cellule staminali embrionali umane per quattro giorni per differenziarle in cellule endoteliali primordiali.
Il quinto giorno, aspirare il mezzo sopra le cellule. Quindi lavare delicatamente le cellule con un millilitro di DMEM / F-12 per pozzetto. Aggiungere un millilitro di mezzo di differenziazione delle cellule endoteliali ematogeniche appena preparato per pozzetto e incubare le cellule per 24 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.
Il sesto e il settimo giorno, sostituire il mezzo sopra le cellule con un millilitro di mezzo di differenziazione delle cellule endoteliali omogenee appena preparato per pozzetto e incubare le cellule per altre 24 ore. L'ottavo giorno. Dopo aver staccato e lavato le celle, dividerle uniformemente in provette da microcentrifuga su ghiaccio, ciascuna contenente un minimo di 600 microlitri di cellule ad una densità di 1 volte 10 alle 5 celle per millilitro.
Aggiungere anticorpi alle provette contenenti le cellule come appropriato e incubare su ghiaccio protetto dalla luce per 30 minuti. Pellettare le celle mediante centrifugazione a 1000 volte G e 4 gradi Celsius per cinque minuti. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 600 microlitri di tampone di selezione ghiacciato.
Filtrare i campioni attraverso il tappo filtrante a rete di tubi FACS da cinque millilitri e conservare le celle su ghiaccio al riparo dalla luce per la selezione immediata delle cellule. Per isolare le cellule endoteliali emogeniche mediante FACS, prima eliminare la popolazione cellulare CD45-negativa. Quindi, all'interno della popolazione CD45-negativa, le cellule CD31-positive.
Successivamente all'interno della popolazione CD31-positiva, porta per la popolazione cellulare VE-caderina-negativa. E poi all'interno della popolazione VE-caderina-negativa, porta per le cellule c-Kit-positive. Dalla popolazione c-Kit-positiva, porta la popolazione cellulare CD34-positiva.
E infine dalla popolazione cellulare CD34-positiva, identificare e raccogliere le cellule KDR-positive. Dopo aver seminato cellule endoteliali emogeniche in un mezzo a base di metilcellulosa formulato per la crescita di cellule progenitrici ematopoietiche, le colonie di unità eritroidi formanti colonie e unità eritroidi formanti esplosione vengono contate l'ottavo giorno. Unità formante colonie-granulociti-macrofagi e unità formanti colonie-granulociti, eritroidi, macrofagi e megacariociti.
Le colonie progenitrici ematopoietiche multipotenti vengono contate il giorno 14. Per 1000 cellule endoteliali emogeniche placcate, vengono generate circa 20 unità formanti colonie. Nelle colture sono visibili anche cellule con morfologia cellulare endoteliale.
Queste sono le cellule endoteliali emogeniche che danno origine a progenitori ematopoietici multilineare a livello unicellulare. Questo protocollo è un sistema di coltura 2D privo di siero e alimentatore murino in grado di generare cellule endoteliali emogeniche umane in circa una settimana.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo per generare una popolazione ben caratterizzata di cellule endoteliali emogeno da cellule staminali pluripotenti umane in circa 1 settimana. Queste cellule possono essere utilizzate per studiare la regolazione molecolare e la transizione endoteliale-emopoietica.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Differenziazione cellulare
- Biologia delle cellule staminali
- Ematopoiesi
Conoscenze di base
- Le cellule staminali pluripotenti umane possono differenziarsi in vari tipi di cellule.
- Le cellule endoteliali emogeno svolgono un ruolo cruciale nella formazione del sangue.
- Comprendere la loro differenziazione è vitale per la medicina rigenerativa.
- Questo protocollo fornisce un approccio semplificato per generare queste cellule.
Obiettivo dello studio
- Stabilire un metodo affidabile per differenziare le cellule endoteliali emogeno.
- Facilitare la ricerca sulla transizione endoteliale-emopoietica.
- Fornire una risorsa per studiare i meccanismi molecolari nell'ematopoiesi.
Metodi utilizzati
- Coltivazione di cellule staminali embrionali umane per quattro giorni.
- Lavaggio delle cellule con mezzo DMEM/F-12.
- Aggiunta del mezzo di differenziamento delle cellule endoteliali emogeno.
- Incubazione delle cellule a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 24 ore.
Risultati principali
- Generazione con successo di cellule endoteliali emogeno.
- Caratterizzazione della popolazione cellulare differenziata.
- Intuizioni sulla regolazione molecolare dell'ematopoiesi.
- Possibili applicazioni nella medicina rigenerativa e nella modellazione delle malattie.
Conclusioni
- Questo protocollo fornisce un approccio diretto per generare cellule endoteliali emogeno.
- Aprirà nuove strade per ulteriori ricerche nello sviluppo delle cellule del sangue.
- Studi futuri potranno basarsi su questo metodo per esplorare vari disordini ematopoietici.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Directed differentiation of hemogenic endothelial cells from human pluripotent stem cells addresses a critical bottleneck in modeling hematopoietic development and generating blood lineages ex vivo. This capability enables mechanistic de-risking of endothelial-to-hematopoietic transition and supports predictive confidence in early-stage cell therapy and regenerative medicine pipelines. The protocol's feeder-free, serum-free design enhances reproducibility and scalability for enterprise R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of molecular pathways governing endothelial-to-hematopoietic transition.
- Supports functional target validation for factors influencing blood lineage specification.
- Facilitates predictive de-risking of candidate targets in hematopoietic development.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, well-characterized cell population for downstream functional assays.
- Enables quantitative assessment of hematopoietic colony formation from defined progenitors.
- Supports reproducible screening of modulators affecting endothelial or hematopoietic fate.
Translational & Preclinical Research
- Establishes a platform for modeling disease-relevant hematopoietic defects in vitro.
- Enables continuity from discovery to preclinical validation of blood cell generation strategies.
- Supports risk-adjusted advancement of cell-based therapeutic concepts.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling robust generation and isolation of hemogenic endothelial cells for mechanistic studies and functional assays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on molecular regulation of blood lineage emergence.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative colony-forming outputs for comparative analysis.
- Analytics: Provides flow cytometry-based gating and colony quantification for objective readouts.
- Translational Research: Bridges in vitro modeling with preclinical evaluation of hematopoietic potential.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, feeder-free system adaptable across stem cell lines and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in hematopoietic lineage modeling and target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of cell differentiation workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making for cell therapy and regenerative medicine programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of early-stage cell-based therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in human pluripotent stem cell culture and differentiation protocols.
- Demands access to flow cytometry instrumentation for multi-parameter cell sorting.
- Necessitates cross-team standardization of gating strategies and colony quantification.
- Adaptable to various human stem cell lines with protocol optimization.
- Dependent on validated antibody panels and methylcellulose-based functional assays.
