Spettroscopia eco-spin neutronica come sonda unica per la dinamica della membrana lipidica e le interazioni membrana-proteina

Questo protocollo descrive la preparazione del campione e la riduzione dei dati necessari per studi di successo sull'eco di spin neutronico delle fluttuazioni collettive della membrana di rilevanza per le funzioni biologiche e le applicazioni pratiche delle membrane lipidiche. NSE accede direttamente alla dinamica della membrana sulle scale temporali dei nanosecondi delle funzioni chiave della membrana con il vantaggio unico della sensibilità isotopica per sondare le caratteristiche selettive della membrana inaccessibili con altre tecniche. Gli studi sulla dinamica di membrana su scala nanometrica sono essenziali per comprendere le proprietà di membrana sottostanti del meccanismo molecolare e le interazioni membrana-proteina implicate in varie patologie cellulari.

Il metodo fornisce ai ricercatori nuovi di NSE linee guida dettagliate sulla progettazione, la preparazione e la caratterizzazione delle vescicole lipidiche per esperimenti di successo e successiva analisi e interpretazione della riduzione dei dati. A dimostrare la procedura saranno Teshani Kumarage e Julie Nguyen, una studentessa laureata e una studentessa universitaria del laboratorio. Lavorando all'interno di un cappuccio, preparare la sospensione lipidica sciogliendo i lipidi pesati accuratamente in un millilitro di solvente con miscelazione manuale.

Asciugare la soluzione lipidica facendo scorrere delicatamente un gas inerte nel flaconcino mentre lo ruota lentamente ad angolo. Per rimuovere accuratamente il solvente residuo, posizionare i flaconcini durante la notte in un forno sottovuoto a 35 gradi Celsius. Il giorno successivo, idratare il film lipidico con due millilitri di acqua pesante per ottenere una concentrazione lipidica di 50 milligrammi per millilitro e vorticare la sospensione lipidica idratata fino a quando il film lipidico non è completamente disciolto.

Quindi, eseguire cinque cicli di congelamento-scongelamento conservando la fiala della sospensione lipidica idratata a meno 80 gradi Celsius fino al congelamento. E poi trasferirlo a un bagno d'acqua a 35 gradi Celsius per scongelare la sospensione lipidica. Vortice della sospensione scongelata fino ad essere omogenea prima di procedere al ciclo successivo.

Prima di iniziare l'esperimento, assemblare la configurazione dell'estrusore utilizzando una membrana in policarbonato tra due supporti a membrana e aggiungere due filtri di carta su ciascun lato per fornire ulteriore supporto. Utilizzare siringhe di vetro eretiche per idratare la membrana in policarbonato facendo passare più volte 0,3 millilitri di acqua pesante attraverso il gruppo membrana. Dopo aver idratato la membrana, inserire una siringa a tenuta di gas da un millilitro con una soluzione lipidica di colore bianco latte preparata in un'estremità e una siringa vuota all'estremità opposta dell'apparato estrusore.

Una volta collegate le siringhe, posizionare il gruppo nel blocco dell'estrusore. Programmare la pompa tenendo premuto il pulsante Rate per inserire la velocità di estrusione e premere il pulsante Diameter per inserire il diametro della siringa. Quindi, premere Ritira fino a quando la spia non si accende.

Premere start e attendere che il campione inizi a erogare nella siringa vuota. Premere il pulsante Stop appena prima che la siringa campione sia completamente vuota. Registrare il volume erogato, quindi tenere premuto il pulsante Rate fino a quando la fase uno non viene visualizzata sullo schermo.

Tenendo spenta la spia di prelievo, premere il pulsante del volume per inserire il volume erogato registrato in precedenza. Premere nuovamente il pulsante Tariffa e utilizzare la freccia più su destra per accedere alla fase due. Premere volume per immettere lo stesso valore del volume erogato registrato in precedenza.

In questa fase, premere il pulsante Preleva fino a quando la spia Prelievo non è accesa. Ripetere il ciclo per la fase tre premendo il pulsante del volume fino a quando LP:SE appare sullo schermo e impostarlo su 20. Infine, premere il pulsante Rate, accedere alla fase quattro e premere il pulsante del volume per accedere alla funzione Stop per completare la configurazione della pompa.

Dopo aver programmato la pompa, premere Start per iniziare il ciclo di estrusione. Eseguire da 15 a 20 cicli di estrusione prima di raccogliere la sospensione lipidica estrusa blu opalino trasparente in un flaconcino pulito per le misurazioni. Aprire il software DAVE e selezionare Riduci dati NSE dal menu Riduzione dati.

Caricare i file di dati su valori Q diversi utilizzando l'opzione Apri file echo dal menu file. I file caricati verranno visualizzati sotto i set di dati disponibili. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul file selezionato ed etichettarlo in base alla misurazione a cui corrisponde come Campione, Cella o Risoluzione.

Utilizzando la scheda Set di dati, raggruppare i pixel del rilevatore in 2 X 2 per migliorare il rapporto segnale/rumore. Applicare lo stesso binning a tutti i file di Risoluzione, Cella e Esempio. Ispeziona i dati su tutti i gruppi di pixel e maschera quelli con segnali scadenti premendo il tasto Fine sulla tastiera.

Premi Invio per accedere a una finestra pop-up per applicare la stessa maschera a tutti e quattro i tuoi tempi. I pixel mascherati diventano verdi. Assicurarsi che i dati raccolti siano sotto forma di segnale eco.

Inizia a montare il file di risoluzione dall'elenco dei file caricati facendo clic con il pulsante destro del mouse sul file desiderato e selezionando Adatta operazioni, Adatta risoluzione echi dal menu a comparsa. Assicurarsi che gli adattamenti dei segnali eco producano parametri di adattamento ragionevoli. Per ispezionare l'errore associato a ciascun parametro di raccordo sull'intero rilevatore, selezionate Opzioni immagine (Image Options), quindi selezionate il parametro di raccordo di interesse.

Quindi, fare clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine del rilevatore per accedere a una finestra pop-up che mostra una mappa della barra degli errori. Se l'adattamento su un pixel specifico non è soddisfacente, riadattare il segnale su quel pixel selezionandolo, premendo la scheda Adattamento e quindi premendo Adatta pixel. Immettere nuovi parametri iniziali per la fase e il periodo nella scheda Raccordo (Fitting).

Ridurre il file di esempio selezionando il file corrispondente dall'elenco dei file caricati ed etichettati. Ispeziona tutti i pixel e maschera quelli poveri come descritto sopra. Quindi, fare clic con il pulsante destro del mouse sul file e selezionare Adatta operazioni, Importa fasi.

Per il file di risoluzione, adattare i segnali eco come descritto in precedenza con i valori del periodo invariati e il punto di fase dell'eco importato dagli adattamenti di risoluzione. Immettere il centro del fascio per tutti i file di dati accedendo alla scheda Generale e immettendo i valori del centro del raggio X e Y registrati dall'esperimento. Una volta completati gli adattamenti, calcolare la funzione di scattering intermedio normalizzato facendo clic con il pulsante destro del mouse sul file di esempio desiderato dall'elenco dei file adattati e selezionando Calcola I di Q dal menu a comparsa.

Immettere le informazioni richieste per i file di risoluzione e di cella e il numero di archi Q nella finestra pop-up, quindi premere OK per visualizzare i risultati. Si noti che i dati in ciano mostrano un segnale scarso a causa degli effetti del bordo del rilevatore e devono essere eliminati durante la compilazione di diversi set di dati Q. Infine, salvare i set di dati ridotti come file ASCII e salvare l'intera sessione come progetto DAVE nella cartella desiderata.

In questo studio, sono state effettuate le misurazioni NSE di campioni liposomiali preparati con diversi schemi di deuterazione. Le misurazioni NSE delle fluttuazioni di flessione della membrana vengono eseguite su liposomi completamente contrastati. Questo schema di deuterazione si traduce in una grande differenza di lunghezza di scattering tra il nucleo della membrana e l'ambiente del fluido deuterato, migliorando significativamente il segnale di scattering dalle membrane liposomiali e migliorando le statistiche di misurazione della dinamica di flessione.

D'altra parte, le misurazioni NSE delle fluttuazioni dello spessore della membrana dei liposomi mostrano deviazioni relative alla Q alla terza dipendenza delle fluttuazioni di flessione. Per isolare il segnale di fluttuazione dello spessore, il segnale ottenuto è diviso per Q al terzo e le dinamiche in eccesso sono adattate a una funzione lorentziana in Q.Questo metodo è subordinato a dati di buona qualità, che è più realizzabile con campioni di alte concentrazioni e forti segnali di scattering. Le dinamiche sonde da NSE possono essere esplorate sinergicamente mediante relaxometria NMR al deuterio e simulazioni molecolari-dinamiche per illustrare come le strutture lipidiche molecolari e i motivi di impacchettamento influenzano le funzioni della membrana.

Gli studi NSE sulle membrane lipidiche gettano nuova luce sulla biofisica delle membrane, sulle intricate relazioni tra struttura e dinamica della membrana e su come influenzano le funzioni della membrana e le interazioni membrana-proteina.