Name: Isolamento di popolazioni di astrociti umani adulti dalla corteccia appena congelata mediante selezione dei nuclei attivati dalla fluorescenza (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Scopri l'isolamento di nuclei di astrociti umani adulti dalla corteccia congelata mediante FANS. Questo metodo consente analisi molecolari specifiche per studiare la biologia degli astrociti in tessuto cerebrale sano e patologico.

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Ci piace ringraziare i membri in Patologia e Neurochirurgia presso la Icahn School of Medicine del Monte Sinai per l'aiuto con l'approvvigionamento di tessuto cerebrale de-identificato e la citometria a flusso CORE di ISMMS per la consulenza di esperti. Lo studio è stato parzialmente finanziato da NIH RF1DA048810, R01NS106229, R03NS101581 (a N.M.T.) e R61DA048207 (a S.A.).

NOTA: Il programma per la protezione dei soggetti umani presso la Icahn School of Medicine del Monte Sinai (ISMMS) e il suo Institutional Review Board (IRB) assicurano la condotta etica della ricerca e la conformità con le normative federali, statali e istituzionali. In questo studio, tutti i campioni post-mortem utilizzati sono stati de-identificati, ottenuti con il consenso appropriato attraverso il biorepository, e sono stati esenti dalla designazione di "ricerca umana" dall'IRB dell'ISMMS (HS # 14-01007).
1. Preparazione del buffer
NOTA: se si esegue il sequenziamento dell'RNA a valle, trattare accuratamente tutti gli spazi di lavoro e gli strumenti con la soluzione di decontaminazione RNase per prevenire la degradazione dell'mRNA.
<ol><li>Preparare il buffer di lisi.<ol>
<li>Sciogliere quanto segue in H2O distillato fino a 50 mL: 5,47 g di saccarosio (0,32 M finale), 250 μL di 1 M CaCl2 (5 mM finale), 150 μL di 1 M Mg(CH3COO)2 (3 mM finale), 10 μL di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) (0,1 mM finale), 500 μL di 1 M Tris-HCl (pH 8) (10 mM finale), 50 μL di Triton X-100 (0,1% finale) e 17 μL di 3 M ditiotreitolo (DTT, 1 mM finale, aggiungere fresco) (vedere la tabella dei materiali).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare il tampone di saccarosio<ol>
<li>Sciogliere quanto segue in H2O distillato fino a 50 mL: 30,78 g di saccarosio (1,8 M finale), 150 μL di 1 M Mg(CH3COO)2 (3 mM finale), 500 μL di 1 M Tris-HCl (pH 8) (10 mM finale), 17 μL di 3 M DTT (1 mM finale, aggiungere fresco).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Dissociazione del tessuto congelato in sospensione monocucle
<ol><li>Aggiungere 4 mL di tampone di lisi ghiacciato a un douncer di tessuto di vetro da 7 mL (grinder) e mantenere sul ghiaccio. Sezionare circa 200-400 mg di corteccia umana adulta appena congelata, dounce circa 50x e trasferire l'omogeneizzato tissutale in un tubo di polipropilene ultracentrifuga da 12 mL.</li>
	<li>Utilizzando una pipetta da 5 mL, aggiungere 6,5 mL di tampone di saccarosio ghiacciato sul fondo del tubo ultracentrifuga, facendo attenzione a non disturbare lo strato tra saccarosio e l'omogeneizzato tissutale. NOTA: se si elaborano campioni aggiuntivi, bilanciare attentamente i tubi in base al peso aggiungendo un ulteriore tampone di lisi al campione più leggero. Il bilanciamento preciso dei tubi ultracentrifuga è essenziale per prevenire danni al rotore e garantire la rotazione alla velocità corretta.</li>
</ol>3. Ultracentrifugazione
<ol><li>Ultracentrifugare il lisato a 24.400 giri/min (101.814 × g) per 1 ora a 4 °C. Aspirare accuratamente il surnatante e i detriti senza disturbare il pellet. NOTA: un pellet potrebbe non essere visibile se si inizia con meno di 200 mg di tessuto.</li>
	<li>Aggiungere 600 μL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (Ca2+, Mg2+ libero) al pellet di nuclei e incubare sul ghiaccio per 10 minuti prima di risospendere.</li>
	<li>Pipettare su e giù 50 volte per risospese il pellet di nuclei sul ghiaccio.</li>
	<li>Utilizzare un emocitometro per visualizzare i nuclei intatti al microscopio e per garantire che la concentrazione della risospensione sia superiore a 105 nuclei / mL prima di procedere alla fase successiva (combinare 10 μL dei nuclei risospesi con 10 μL di tripano blu).</li>
</ol>4. Incubazione degli anticorpi
<ol><li>Per immunotattare il campione per i FANS, aggiungere 500 μL del pellet del campione risospeso, 490 μL di 1x PBS (Ca2+, Mg2+ libero), 10 μL di BSA al 10% (0,1% finale), 1 μL di anticorpo anti-NeuN di topo coniugato ad AF555 (NeuN-AF555, concentrazione finale 1:1000) e 1 μL di anticorpo anti-PAX6 di topo coniugato all'alloficocianina (PAX6-APC, concentrazione finale 1:1000). NOTA: Possono essere aggiunti anticorpi alternativi coniugati ad altri fluorofori (vedi discussione). Qui, l'anti-OLIG2 del topo coniugato ad AF488 (concentrazione 1:1000) è stato utilizzato con risultati favorevoli.</li>
	<li>Eseguire controlli solo 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) e monocolore per impostare i parametri di gating, utilizzando una piccola quantità del campione se necessario.<ol>
<li>Per eseguire il controllo a colore singolo AF555, aggiungere 20 μL del pellet campione risospeso, 970 μL di 1x PBS (Ca2+, Mg2+ libero), 10 μL di BSA al 10% (0,1% finale) e 1 μL di anticorpo NeuN-AF555 (concentrazione 1:1000).</li>
		<li>Per eseguire il controllo APC a colore singolo, aggiungere 20 μL del pellet campione risospeso, 970 μL di 1X PBS (Ca2+, Mg2+ libero), 10 μL di 10% BSA (0,1% finale) e 1 μL di anticorpo PAX6-APC (concentrazione 1:1000).</li>
		<li>Per eseguire il controllo solo DAPI, aggiungere 20 μL del pellet campione risospeso, 970 μL di 1X PBS (Ca2+, Mg2+ libero) e 10 μL di BSA al 10% (0,1% finale) (DAPI verrà aggiunto in seguito, vedere 4.4). NOTA: se vengono utilizzati più di due anticorpi, si consiglia di eseguire il controllo della fluorescenza meno uno (FMO) oltre ai controlli monocolore.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubare i campioni e i controlli con rotazione al buio per 1 ora a 4 °C.</li>
	<li>Aggiungere DAPI a 1:1000 a tutti i campioni e controlli e procedere con l'ordinamento.</li>
</ol>5. Selezione dei nuclei attivati dalla fluorescenza (FANS)
NOTA: Si raccomanda di utilizzare una struttura istituzionale di citometria a flusso con l'assistenza di personale addestrato, a meno che non sia già esperto in tecniche di citometria / smistamento a flusso.
<ol><li>Cancello come mostrato di seguito.<ol>
<li>In primo luogo, e per ogni campione, gate by forward scatter (FSC-A) vs. side scatter (SSC-A) per includere le particelle nell'intervallo di dimensioni appropriato per i nuclei, escludendo così i globuli rossi e i detriti (Figura 1A). NOTA: una preparazione di nuclei molto pulita può distinguere tra un ammasso di detriti più piccolo e un cluster di nuclei.</li>
		<li>Successivamente, e per ogni campione, gate da FSC-A vs. FSC-W (o FSC-A vs. FSC-H) e SSC-A vs. SSC-W (o SSC-A vs. SSC-H) per includere solo nuclei singoletti (Figura 1B).</li>
		<li>Successivamente, e per ogni campione, gate da PARTE DI DAPI per includere singoletti nuclei intatti (popolazione GATED ALTA DAPI), esclusi i detriti (DAPI-basso, a sinistra della popolazione gated) e i doppietti (a destra della popolazione gated) (Figura 1C).</li>
		<li>Imposta ulteriori gating basati su controlli di fluorescenza, determinati visivamente come cluster distinti su grafici FACS.<ol>
<li>Eseguire il controllo solo DAPI per determinare la colorazione di fondo delle popolazioni, in assenza di anticorpi (Figura 1D e Figura 2A).</li>
			<li>Eseguire il controllo solo NeuN-AF555 per determinare il cutoff per la colorazione NeuN+ nel canale per AF555 (Figura 2B).</li>
			<li>Eseguire il controllo solo PAX6-APC per determinare il cutoff per la colorazione PAX6+ nel canale APC (Figura 2C).</li>
			<li>Eseguire ulteriori controlli monocolore se si utilizzano più anticorpi (Figura 2D,E). NOTA: se si utilizzano più di due anticorpi, si consiglia un controllo FMO per visualizzare eventuali cambiamenti nelle popolazioni.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Una volta eseguiti tutti i controlli, disegna i cancelli per le collezioni NeuN+ e PAX6+ al di sopra delle soglie stabilite.<ol>
<li>Gate la popolazione NeuN+ per raccogliere i neuroni (Figura 1E e Figura 2F).</li>
			<li>Gate la popolazione PAX6+ dalla popolazione NeuN- per raccogliere astrociti (Figura 1E, F e Figura 2F).</li>
			<li>Gate e raccogliere ulteriori popolazioni gliali (come le cellule progenitrici degli oligodendrociti, come mostrato qui da OLIG2+) dalla popolazione NeuN-PAX6- (Figura 1F). NOTA: Nel caso in cui determinare i cutoff di gating appropriati sia difficile con il software di citometria a flusso a causa di popolazioni indistinte, può essere utile modificare il numero di eventi visualizzati (aumentando o riducendo il numero di eventi sul grafico FANS).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Raccogliere i campioni in modo appropriato in base all'analisi a valle prevista.</li>
</ol>6. Raccolta di popolazioni di FANS per analisi molecolari a valle
<ol><li>Per il sequenziamento dell'RNA di massa, raccogliere 50.000-500.000 nuclei in PBS (vedere anche paragrafo 7.1).<ol>
<li>Aggiungere 2 mL di soluzione di saccarosio, 50 μL di 1 M CaCl2 e 30 μL di 1 M Mg(CH3COO)2 e riempire con PBS fino a 10 mL.</li>
		<li>Invertire e incubare sul ghiaccio per 15 min, quindi centrifugare a 900 × g per 10-15 min a 4 °C.</li>
		<li>Aspirare il surnatante, risospendere in 1 mL di reagente che estrae l'RNA, vortice, congelare su ghiaccio secco e conservare a -80 °C.</li>
		<li>In alternativa, raccogliere i campioni direttamente in 200 μL del reagente che estrae l'RNA. Aggiungere il reagente che estrae l'RNA fino a 1 mL dopo lo smistamento, mantenendo un rapporto 1:1 tra il reagente e il campione selezionato. Vortice, congelare su ghiaccio secco e conservare a -80 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per il test di massa per la cromatina accessibile alla trasposasi utilizzando il sequenziamento (ATAC-seq), raccogliere 50.000-75.000 nuclei in PBS in un tubo di microcentrifuga rivestito con albumina sierica bovina al 5% (BSA). Congelare i nuclei su ghiaccio secco/-80 °C o utilizzarli immediatamente per la preparazione dell'ATAC.</li>
	<li>Per sn RNA-seq o ATAC-seq, raccogliere nuclei in BSA allo 0,04% in PBS (vedere anche paragrafo 7.2).</li>
</ol>7. Suggerimenti per la preparazione pre-libreria
<ol><li>Preparazione della libreria di sequenziamento dell'RNA nucleare di massa<ol>
<li>Dopo aver raccolto il reagente di estrazione dell'RNA, eseguire l'estrazione standard di fenolo / cloroformio RNA aggiungendo fenolo / cloroformio e precipitando l'RNA dallo strato acquoso superiore con etanolo, seguita dalla digestione della DNasi su tubo (15 min).</li>
		<li>Eseguire la pulizia dell'RNA e concentrarsi in un volume finale di 15 μL di acqua. NOTA: Utilizzando questo metodo, il recupero rappresentativo da 300 mg di campione di corteccia adulta è di ~ 300.000 nuclei NeuN + (15-20 ng / μL RNA totale dopo pulizia e concentrazione) e ~ 250.000 nuclei PAX6 + (10-12 ng / μL RNA totale dopo pulizia e concentrazione). Questa resa rappresentativa può variare notevolmente in base alla qualità del campione, al rigore e al recupero dell'RNA.</li>
		<li>Eseguire una reazione a catena quantitativa della polimerasi (qPCR) prima del sequenziamento per confermare l'arricchimento degli astrociti basato sull'elevata espressione differenziale dei marcatori astrocitari canonici (GFAP, SOX9), della 10-formiltetraidrofolato deidrogenasi (ALDH1L1)) e dell'esaurimento dei marcatori neuronali e di altri marcatori di lignaggio cellulare (Figura 1G). NOTA: La raccolta della popolazione a doppio negativo (NeuN-PAX6-) consente un'analisi di controllo qualità qPCR più accurata e a più livelli per l'arricchimento relativo degli astrociti (Figura 2H).</li>
		<li>Genera librerie RNA-seq utilizzando un kit consigliato per valori numerici di integrità dell'RNA bassi, come previsto dai campioni post-mortem.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparazione della libreria di sequenziamento a nucleo singolo<ol>
<li>Eseguire il sequenziamento sn attraverso un nucleo di sequenziamento istituzionale.</li>
		<li>Per l'elaborazione e il sequenziamento basati sulla nanofluidica, utilizzare la concentrazione raccomandata di 1 × 106 cellule/mL in almeno 60 μL di 1x PBS + 0,04% BSA per il sequenziamento dell'RNA a nucleo singolo (snRNA-seq) e 3 × 106 cellule/mL in almeno 20 μL di 1x PBS + 0,04% BSA per il test a nucleo singolo per la cromatina accessibile alla trasposasi mediante sequenziamento (snATAC-seq).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Mitchell, A., Roussos, P., Peter, C., Tsankova, N., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+neuroepigenetics+in+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Molecular+Biology+and+Translational+Science%22%5BJournal%5D)">The future of neuroepigenetics in the human brain.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 128, 199-228 (2014).</li>
<li>Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+neuronal+chromatin+from+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Isolation of neuronal chromatin from brain tissue.</a> BMC Neuroscience. 9, 42(2008).</li>
<li>Akbarian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PsychENCODE+project%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The PsychENCODE project.</a> Nature Neuroscience. 18 (12), 1707-1712 (2015).</li>
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<li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX9+Is+an+astrocyte-specific+nuclear+marker+in+the+adult+brain+outside+the+neurogenic+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">SOX9 Is an astrocyte-specific nuclear marker in the adult brain outside the neurogenic regions.</a> Journal of Neuroscience. 37 (17), 4493-4507 (2017).</li>
<li>Manuel, M. N., Mi, D., Mason, J. O., Price, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cerebral+cortical+neurogenesis+by+the+Pax6+transcription+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Regulation of cerebral cortical neurogenesis by the Pax6 transcription factor.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 70(2015).</li>
<li>Sakurai, K., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurogenesis-controlling+factor%2C+Pax6%2C+inhibits+proliferation+and+promotes+maturation+in+murine+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The neurogenesis-controlling factor, Pax6, inhibits proliferation and promotes maturation in murine astrocytes.</a> Journal of Neuroscience. 28 (18), 4604-4612 (2008).</li>
<li>Zhong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+the+development+of+the+human+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Decoding the development of the human hippocampus.</a> Nature. 577 (7791), 531-536 (2020).</li>
<li>Pollen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+identity+of+human+outer+radial+glia+during+cortical+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular identity of human outer radial glia during cortical development.</a> Cell. 163 (1), 55-67 (2015).</li>
<li>Cvekl, A., Callaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAX6%3A+25th+anniversary+and+more+to+learn%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">PAX6: 25th anniversary and more to learn.</a> Experimental Eye Research. 156, 10-21 (2017).</li>
<li>Goc, J., Liu, J. Y., Sisodiya, S. M., Thom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spatiotemporal+study+of+gliosis+in+relation+to+depth+electrode+tracks+in+drug-resistant+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A spatiotemporal study of gliosis in relation to depth electrode tracks in drug-resistant epilepsy.</a> European Journal of Neuroscience. 39 (12), 2151-2162 (2014).</li>
<li>Monoranu, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH+measurement+as+quality+control+on+human+post+mortem+brain+tissue%3A+a+study+of+the+BrainNet+Europe+consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathology+and+Applied+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">pH measurement as quality control on human post mortem brain tissue: a study of the BrainNet Europe consortium.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 35 (3), 329-337 (2009).</li>
<li>Ninkovic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+Pax6+regulates+survival+of+dopaminergic+olfactory+bulb+neurons+via+crystallin+%CE%B1A%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The transcription factor Pax6 regulates survival of dopaminergic olfactory bulb neurons via crystallin αA.</a> Neuron. 68 (4), 682-694 (2010).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La progettazione sperimentale secondo il protocollo delineato dovrebbe essere finalizzata dopo aver considerato diversi fattori biologici e tecnici. I campioni di tessuto di partenza sono freschi di congelamento, senza essere stati fissati, e preferibilmente hanno un breve intervallo di raccolta post-mortem per massimizzare il recupero dei nuclei. Sulla base dell'esperienza, un PMI fino a 24 ore consente un adeguato recupero dei nuclei; tuttavia, un PMI di 12 ore o meno è preferibile per ottimizzare il recupero dei nucle...

La complessità molecolare degli astrociti umani rimane scarsamente definita nel tessuto primario, richiedendo strumenti migliori per il loro isolamento e caratterizzazione ad alta risoluzione, sia in salute che in malattia. La separazione dei neuroni umani intatti e della glia dalla loro nicchia si è dimostrata difficile a causa dell'accesso limitato di campioni di tessuto cerebrale fresco, della natura fortemente interconnessa dei processi gliali e neuronali e dell'inevitabile attivazione cellulare durante l'elaborazione, che limitano la caratterizzazione molecolare di questi tipi di cellule ex vivo1 . Lo smistamento dei nuclei attivati dalla fluorescenza (FANS) è emerso come alternativa allo smistamento delle cellule vive, consentendo la dissociazione e l'immunotagging delle popolazioni di nuclei dal tessuto congelato. Negli ultimi dieci anni, FANS è diventato ampiamente utilizzato per isolare e caratterizzare molecolarmente le popolazioni di nuclei neuronali umani (NeuN +) in una varietà di campioni cerebrali e regioni anatomiche 1,2,3,4.
Tuttavia, metodi simili per isolare specifiche sottopopolazioni di nuclei gliali dalla corteccia umana sono stati limitati, portando a una relativa mancanza di sofisticazione nella comprensione della complessità degli astrociti sia nei tessuti normali che in quelli malati. A tal fine, un protocollo precedentemente pubblicato è stato adattato per isolare le popolazioni neuronali umane utilizzando FANS4 e un metodo è stato convalidato per arricchire gli astrociti (e per i progenitori oligodendrogliali) utilizzando una combinazione di tripli anticorpi, catturando gli astrociti sia in condizioni di riposo che reattive5. Per arricchire specificamente gli astrociti nella frazione NeuN-, sono stati utilizzati anticorpi contro uno dei due fattori di trascrizione noti per essere espressi in modo differenziale tra le popolazioni di astrociti, PAX6 o SRY-box transcription factor 9 (SOX9)6,7. PAX6 è altamente espresso durante lo sviluppo fetale precoce all'interno di progenitori radiali simili a glia nelle zone germinali e contribuisce sia alla neurogenesi e alla gliogenesi 8,9,10,11, sia alla specifica neuronale retinica12. Nell'adulto, PAX6 è differenzialmente sovraespresso negli astrociti umani a riposo6 e mostra co-espressione proteica con la proteina acida fibrillare gliale (GFAP) negli astrociti del tessuto epilettico umano13.
Questo protocollo descrive l'isolamento simultaneo di popolazioni di nuclei neocorticali neuronali e arricchiti di astrociti da parte di FANS. Il tessuto post-mortem fresco (non fissato) congelato a scatto (cioè fresco-congelato) raccolto dalla corteccia adulta viene prima dissociato meccanicamente e chimicamente. Dopo la lisi e l'ultracentrifugazione in un gradiente di saccarosio, i componenti citoplasmatici ed extracellulari vengono scartati mentre i nuclei vengono trattenuti. I nuclei vengono quindi etichettati con anticorpi nucleari coniugati fluorescentemente corrispondenti ai lignaggi bersaglio desiderati e ordinati utilizzando FANS. Seguendo questo approccio, l'arricchimento degli astrociti è dimostrato nelle popolazioni PAX6+ NeuN- raccolte, convalidate sia da un pannello qPCR mirato che dal sequenziamento dell'RNA nucleare a valle.

<table><tbody><tr><td>10x PBS pH 7.2</td><td>Invitrogen</td><td>70013073</td><td></td></tr><tr><td>ANTICORPO ANTI-NEUN CLONE A60</td><td>Millipore</td><td>MAB377A5MI</td><td>anti-NeuN di topo coniugato a un composto fluorescente AF555 (eccitazione, 553 nm; emissione, 568 nm)</td></tr><tr><td>ANTICORPO ANTI-OLIG2 CLONE 211</td><td>Millipore</td><td>MABN50A4MI</td><td>anti-OLIG2 di topo coniugato a un composto fluorescente AF488 (eccitazione, 499 nm; emissione, 520 nm)</td></tr><tr><td>Bovino Albumina sierica</td><td>Fisher</td><td>BP9704-100</td><td></td></tr><tr><td>Camera di conteggio Bright-Line</td><td>Hausser Scientific</td><td>3110V</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio Anidro</td><td>Fisher</td><td>C614-3</td><td></td></tr><tr><td>Filtri cellulari, 40 &; M</td><td>SP Scienceware</td><td>136800040</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilidolo, Dicloridrato)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DL-Ditiotreitolo</td><td>Sigma</td><td>43815-1G</td><td></td></tr><tr><td>Kit libreria DNA</td><td>Illumina, Nextera</td><td>FC-121... 1030</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Worthington</td><td>LS002139</td><td></td></tr><tr><td>Dounce Tissue Grinder</td><td>WHEATON</td><td>357542</td><td></td></tr><tr><td>FACS Sorter</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>BD FACSAria III</td></tr><tr><td>Acetato di magnesio tetraidrato</td><td>Fisher</td><td>M13-500</td><td></td></tr><tr><td>PAX6 (PAX6/496) - 100 TEST</td><td>Novus</td><td>NBP234705J</td><td></td></tr><tr><td>RNA Clean & Concentratore</td><td>Zymo Research</td><td>R1013</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap Soluzione di decontaminazione RNasi</td><td>Invitrogen</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>SMARTer Kit RNA-Seq totale a filamento Pico Input Mammalian</td><td>Clontech Laboratories</td><td>635005</td><td>Tempo di frammentazione di 2,5 minuti, come raccomandato per bassi valori di RNA RIN.</td></tr><tr><td>Saccarosio, certificato cristallo, ACS, 500 mg</td><td>Fisher</td><td>S5500</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti Rotore a secchiello oscillante</td><td>Coltro Beckman</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl, soluzione 1M, pH 8.0, grado di biologia molecolare, ultrapuro</td><td>Thermo Scientific</td><td>J22638AE</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-500</td><td>tensioattivo non ionico nel tampone di lisi</td></tr><tr><td>Reagente</td> <td>TRIzol LSReagente Invitrogen</td><td>10296028</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Reagente Invitrogen</td><td>15596026</td><td>per l'isolamento di RNA</td></tr><tr><td>Soluzione blu di tripano, 0,4%</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuga</td><td>Beckman Coulter Optima XE-100</td><td>A94516</td><td></td></tr><tr><td>Provette per ultracentrifuga PP 9/16 X 3-1/2</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>Acqua distillata ultrapura ( </td><td>Invitrogen</td><td>10977023</td><td>indicato come acqua distillata</td></tr><tr><td>EDTA ultrapuro</td><td>Life Technologies</td><td>15576-028</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento di popolazioni di astrociti umani adulti dalla corteccia appena congelata mediante selezione dei nuclei attivati dalla fluorescenza

Isolation of Adult Human Astrocyte Populations from Fresh-Frozen Cortex Using Fluorescence-Activated Nuclei Sorting

La complessità degli astrociti umani rimane scarsamente definita nel tessuto umano primario, richiedendo strumenti migliori per il loro isolamento e caratterizzazione molecolare. Lo smistamento dei nuclei attivati dalla fluorescenza (FANS) può essere utilizzato per isolare e studiare con successo le popolazioni di nuclei neuronali umani (NeuN +) dal tessuto d'archivio congelato, evitando così problemi associati alla manipolazione di tessuto fresco. Tuttavia, mancano sforzi per isolare in modo simile l'astroglia dall'elemento non neuronale (NeuN-). Una strategia di immunotagging recentemente sviluppata e convalidata utilizza tre anticorpi del fattore di trascrizione per isolare simultaneamente popolazioni di nuclei neuronali arricchiti (NeuN +), astrociti (paired box protein 6 (PAX6) + NeuN-) e oligodendrociti progenitori (OLIG2 + NeuN-) da tessuto temporale temporale umano postmortem non malato, fresco (non fisso) congelato a scatto.
Questa tecnica si è dimostrata utile per la caratterizzazione delle alterazioni del trascrittoma specifiche del tipo cellulare nella neocorteccia patologica primaria dell'epilessia. Le analisi trascrittomiche hanno confermato che le popolazioni selezionate pax6 + NeuN sono robustamente arricchite per i marcatori pan-astrocitari e catturano gli astrociti sia in condizioni di riposo che reattive. Questo articolo descrive la metodologia FANS per l'isolamento di popolazioni di nuclei arricchiti di astrociti dalla corteccia umana appena congelata, compresa la dissociazione dei tessuti in sospensione a nucleo singolo (sn); immunotagging di nuclei con anticorpi coniugati fluorescenti anti-NeuN e anti-PAX6; FANS gating strategie e metriche di controllo qualità per ottimizzare la sensibilità e la specificità durante lo smistamento e per confermare l'arricchimento degli astrociti; e l'approvvigionamento raccomandato per il sequenziamento dell'accessibilità del trascrittoma e della cromatina a valle alla risoluzione bulk o sn. Questo protocollo è applicabile per campioni corticali umani non necrotici, congelati freschi, con varie patologie e raccolta di tessuto post mortem raccomandata entro 24 ore.

I nuclei sono stati raccolti da tessuto neocorteccia temporale fresco (non fissato) congelato a scatto con un tempo di raccolta post mortem di 12 ore. Dopo la dissociazione dei tessuti in sospensione nucleica, i campioni sono stati incubati con anticorpi contro NeuN, PAX6 e OLIG2 e ordinati in base al gating mostrato in Figura 1 e Figura 2. I nuclei sono stati raccolti da popolazioni ordinate NeuN+, PAX6+NeuN- e OLIG2+NeuN- (Figura 1E,F</str...

Abbiamo sviluppato un metodo che arricchisce e isola le popolazioni di astrociti umani da tessuti freschi congelati per l'uso in analisi molecolari a valle.

Isolamento di popolazioni di astrociti umani adulti dalla corteccia appena congelata mediante selezione dei nuclei attivati dalla fluorescenza

The complexity of human astrocytes remains poorly defined in primary human tissue, requiring better tools for their isolation and molecular ...

Questo protocollo può aiutare gli scienziati che sono interessati a studiare la funzione molecolare degli astrociti umani nella loro nicchia nativa. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'isolamento e l'arricchimento di un tipo di cellula specifica, astrociti adulti da campioni di tessuto cerebrale umano alla rinfusa utilizzando la selezione dei nuclei attivati dalla fluorescenza. Questa metodologia può essere applicata per isolare altri tipi di cellule dalla neocorteccia umana, come i neuroni e le cellule progenitrici degli oligodendrociti utilizzando altri anticorpi coniugati fluorescenti appropriati.Iniziare a sezionare circa 200-400 milligrammi di tessuto da un campione di tessuto della corteccia umana adulta fresco congelato. Posizionare il tessuto in un douncer di tessuto di vetro da sette millilitri contenente quattro millilitri di tampone di lisi ghiacciato sul ghiaccio e macinare il tessuto circa 50 volte. Trasferire l'omogeneizzato in un tubo di polipropilene ultracentrifuga da 12 millilitri.Utilizzare una pipetta da cinque millilitri per aggiungere 6,5 millilitri di tampone di saccarosio ghiacciato sul fondo del tubo ultracentrifugato senza disturbare

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In questo video, descriviamo il metodo per ottenere una preparazione pura di astrociti da topi appena nati.

Isolamento degli astrociti: un metodo per ottenere una preparazione pura di astrociti corticali di topo

Il video dimostra un metodo semplice per coltivare astrociti murini isolandoli da altre cellule cerebrali. Durante la coltura, utilizzando terreni specifici per gli astrociti e inibendo l'adesione di cellule non astrocitiche, il metodo coltiva selettivamente gli astrociti. Questi astrociti coltivati mostrano una morfologia stellata con processi fini.

Una tecnica semplice per isolare e coltivare gli astrociti murini

Questo video mostra la procedura per isolare e smistare i nuclei da tessuto cerebrale umano appena congelato utilizzando la selezione dei nuclei attivati dalla fluorescenza (FANS), che consente lo studio di diverse popolazioni cellulari per varie applicazioni neurologiche.

Isolamento di popolazioni cellulari dal tessuto cerebrale mediante smistamento dei nuclei attivati dalla fluorescenza

Gli astrociti sono stati riconosciuti per essere versatili cellule che partecipano a processi biologici fondamentali che sono essenziali per il normale sviluppo del cervello e la funzione, e la riparazione del sistema nervoso centrale. Qui vi presentiamo una procedura rapida per ottenere colture pure astrociti topo per studiare la biologia di questa classe importante di cellule del sistema nervoso centrale.

Isolamento e la coltura di astrociti corticali mouse

Qui, vi presentiamo un protocollo per isolare microglia da cuccioli di topo postnatale (giorno 1) per la sperimentazione in vitro. Questo metodo improvvisato di isolamento genera sia elevata resa e purezza, un vantaggio significativo rispetto ai metodi alternativi che consente un'ampia gamma sperimentazione ai fini di chiarire biologia microglia.

Rapid e raffinato CD11b isolamento magnetico di primaria microglia con purezza migliorata e versatilità

Il protocollo AWESAM descritto qui è ottimo per la coltura di astrociti murini in isolamento da altre cellule del cervello in modo veloce, semplice ed economica. Gli astrociti AWESAM esibiscono spontanea Ca2 + segnalazione, morfologia e gene expression profili simili a astrociti in vivo.

Coltura In Vivo-piace murini astrociti utilizzando il protocollo AWESAM veloce, semplice e poco costoso

Qui descriviamo un metodo in vitro di imaging dal vivo per visualizzare il trasporto intracellulare di organelli e il traffico di proteine della membrana plasmatica negli astrociti murini. Questo protocollo presenta anche una metodologia di analisi delle immagini per determinare gli itinerari e la cinetica nel trasporto merci.

Visualizzazione e analisi del trasporto intracellulare di organelli e di altri carichi in Astrociti

Forniamo un protocollo per l'isolamento della microglia da diverse regioni sezionate di un emisfero cerebrale adulto, seguito dalla preparazione della libreria semiautomatica per il sequenziamento profondo dell'RNA unicellulare di trascrittomi a lunghezza intera. Questo metodo aiuterà a chiarire l'eterogeneità funzionale della microglia in salute e malattia.

Isolamento di Microglia specifico della regione da un emisfero cerebrale di topi adulto per il sequenziamento profondo dell'RNA a singola cellula

Qui descriviamo un protocollo dettagliato per generare colture altamente arricchite di astrociti derivati da diverse regioni del sistema nervoso centrale dei topi postnatali e la loro conversione diretta in neuroni funzionali mediante l'espressione forzata di fattori di trascrizione.

Isolamento e riprogrammazione neuronale diretta degli astrociti di topo

Ad oggi, i protocolli per l'isolamento simultaneo di tutti i principali tipi di cellule residenti nel sistema nervoso centrale dallo stesso topo sono una richiesta insoddisfatta. Il protocollo mostra una procedura applicabile nei topi con encefalomielite autoimmune naïve e sperimentale per studiare reti cellulari complesse durante la neuroinfiammazione e contemporaneamente ridurre il numero di topi richiesti.

Isolamento simultaneo dei principali tipi di cellule residenti nel sistema nervoso centrale da topi adulti con encefalomielite autoimmune

Questo protocollo delinea l'isolamento di astrociti e microglia purificati dal midollo spinale del topo adulto, facilitando le successive applicazioni come l'analisi dell'RNA e la coltura cellulare. Include metodi e procedure dettagliati di dissociazione cellulare progettati per migliorare sia la qualità che la resa delle cellule isolate.

Isolamento di astrociti puri e microglia dal midollo spinale di topo adulto per saggi in vitro e studi trascrittomici

Scopri l'isolamento di nuclei di astrociti umani adulti dalla corteccia congelata mediante FANS. Questo metodo consente analisi molecolari specifiche per studiare la biologia degli astrociti in tessuto cerebrale sano e patologico.

Isolamento di popolazioni di astrociti umani adulti dalla corteccia appena congelata mediante selezione dei nuclei attivati dalla fluorescenza (Video) | JoVE Journal

Isolamento di popolazioni di astrociti umani adulti dalla corteccia appena congelata mediante selezione dei nuclei attivati dalla fluorescenza

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