Analisi di tracciamento delle nanoparticelle per la quantificazione e la determinazione delle dimensioni delle vescicole extracellulari

I risultati NTA sono molto inclini alla distorsione dell'operatore. Questo protocollo dimostra gli effetti dei parametri NTA alterati sui risultati ottenuti. Un metodo standardizzato contribuirà ad aumentare il rigore e la riproducibilità nell'analisi NTA.

L'analisi del campione in una cuvetta consente di acquisire un campione statisticamente casuale in ogni video. Ciò si traduce in dati più riproducibili e nella visualizzazione di particelle su un'ampia gamma di dimensioni. Poiché ottenere un campione nell'intervallo di concentrazione delle particelle raccomandato può essere difficile, assicurarsi di eseguire una diluizione seriale per identificare il fattore di diluizione ideale.

A dimostrare la procedura sarà Kungheng Cai, dottorando del laboratorio di Anthony Ferrante. Per preparare la cuvetta per l'analisi del tracciamento delle nanoparticelle, coprire lo spazio di lavoro con un materiale privo di lanugine per evitare che le fibre entrino nelle cuvette. Indossando i guanti, posizionare una cuvetta contenente una barra di agitazione sulla maschera magnetica a cuvette.

Utilizzare uno strumento gancio per posizionare l'inserto nella cuvetta con la tacca dell'inserto visibile nella parte anteriore della cuvetta. Utilizzare una pipetta per aggiungere lentamente da 400 a 500 microlitri di vescicole extracellulari purificate sulla cuvetta attraverso il foro nell'inserto e mescolare il campione pipettando delicatamente senza introdurre bolle d'aria, quindi tappare la cuvetta, picchiettando le bolle se necessario e utilizzare un panno privo di lanugine per pulire la superficie esterna della cuvetta. Per analizzare la concentrazione di particelle del diluente o di un campione, accendere la postazione di lavoro e lo strumento del computer e avviare il programma di analisi del tracciamento delle particelle.

Quando richiesto, fare clic su NTA e aprire la scheda di registrazione. Seguire le istruzioni visualizzate per compilare tutte le informazioni di esempio necessarie. Per l'analisi del tracciamento EV, impostare il diluente su PBS.

La salinità si auto-popolerà al 9% Per ottenere la concentrazione di particelle di diluente o campione, aprire il coperchio dello strumento e rimuovere il cappuccio protettivo che copre dove verrà posizionata la cuvetta. Caricare la cuvetta nello strumento nel corretto orientamento con la tacca dell'inserto rivolto verso la fotocamera e sostituire il cappuccio e il coperchio dello strumento. Fare clic sulla freccia di streaming per accendere la fotocamera e fare clic sulla freccia chevron per espandere le impostazioni di registrazione.

Regolare la messa a fuoco fino a quando le particelle relativamente piccole sono chiaramente visibili. Per impostare l'analisi per una piccola quantificazione EV, impostare la frequenza fotogrammi su 30 fotogrammi al secondo, l'esposizione a 15 millisecondi, il tempo di agitazione a cinque secondi, il tempo di attesa a tre secondi, le potenze laser blu, verde e rosso rispettivamente a 210, 12 e 8 milliwatt, i fotogrammi per video a 300 e il guadagno a 30 decibel. Regolare la messa a fuoco fino a quando le particelle relativamente piccole sono chiaramente visibili.

Aumentare lo zoom e / o il guadagno può aiutare con la messa a fuoco delle particelle. Ma se aumenti il guadagno, ricorda di impostarlo su 30 decibel prima della registrazione. Una volta che le particelle sono a fuoco, impostare l'impostazione dello zoom su 0,5X per risparmiare larghezza di banda e per evitare la perdita di fotogrammi e fare clic su Registra per iniziare a registrare il video.

Quando viene visualizzato un messaggio che indica che i video sono stati registrati, fare clic su OK per completare la registrazione e selezionare la scheda processo. Se particelle molto grandi erano visibili in qualsiasi video durante la registrazione, passare alla directory dei video registrati e rimuovere qualsiasi video problematico prima dell'elaborazione. Selezionare la casella disattiva override rilevamento audio e impostare il diametro della feature su 30.

Fare clic su Processo per avviare l'elaborazione video e visualizzare un grafico di distribuzione in tempo reale. Al termine dell'elaborazione, fare clic su OK e selezionare la scheda Di stampa. Per i veicoli elettrici, visualizzare il grafico principale come silice del cestino del registro.

Altre caratteristiche del grafico, come la modifica dell'asse x per impostare l'area per l'integrazione della figura prodotta, possono essere personalizzate. Per creare un report PDF dei risultati, fare clic sul pulsante report. Verranno visualizzati la media, la mediana, la dimensione del modo e la concentrazione regolate per il fattore di diluizione e la larghezza di distribuzione.

L'NTA del diluente deve essere eseguito prima di qualsiasi campione in modo che la concentrazione di questo bianco possa essere sottratta dalla concentrazione di particelle del campione EV. Per pulire le cuvette dopo l'analisi, svuotare la cuvetta e riempire completamente le cuvette da 10 a 15 volte con acqua deionizzata e le tre volte con etanolo al 70-100% per rimuovere eventuali campioni residui. Asciugare l'esterno delle cuvette con un panno in microfibra privo di lanugine e asciugare l'interno con uno spolverino ad aria compressa.

Per pulire gli inserti e mescolare le barre, mettere i materiali in un flaconcino di vetro a scintillazione contenente dal 70 al 100% di etanolo e agitare vigorosamente il flaconcino. Quindi sciacquare gli inserti e mescolare le barre in acqua deionizzata con agitazione come dimostrato e asciugarle con panni privi di lanugine. Dopo l'essiccazione, mettere immediatamente tutti i componenti puliti in magazzino fino alla successiva analisi.

Prima di eseguire un'analisi, la calibrazione dello strumento è stata testata utilizzando perline di polistirene per garantire la validità dei dati acquisiti. Come osservato, lo strumento di tracciamento delle particelle ha riportato con precisione le dimensioni delle perle manodisperse a 100 nanometri, ma ha riportato solo da vicino la dimensione delle perle da 400 nanometri. Pertanto, le impostazioni dello strumento per questo protocollo erano più accurate per le particelle più piccole, più vicine a 100 nanometri di dimensione.

Utilizzando queste impostazioni, la concentrazione di particelle riportata scala di conseguenza con il fattore di diluizione dimostrando che lo strumento è in grado di rilevare con precisione la concentrazione di particelle in varie diluizioni con poca variabilità tra replicanti tecnici. La diluizione ottimale per un campione EV derivato da 4,41 volte 10 a 10 per millilitro di tessuto di topo derivato da tessuto di topo è stata determinata tra 1.000 e 3.000. In questa analisi, l'aumento del guadagno ha aumentato la sensibilità della fotocamera, consentendo un aumento della visualizzazione di un numero maggiore di particelle più piccole.

L'aumento della potenza del laser blu da 70 a 210 milliwatt mantenendo costanti le potenze laser verdi e rosse ha spostato la dimensione media delle particelle riportata da 122 a 105 nanometri e ha aumentato la concentrazione totale di particelle riportata da 1,1 volte 10 all'ottavo a 1,7 volte 10 all'ottavo. L'aumento della potenza del laser rosso ha aumentato la dimensione media delle particelle riportata da 175 a 246 nanometri e ha diminuito la concentrazione totale di particelle riportata. L'aumento della potenza del laser verde ha comportato una diminuzione della dimensione media delle particelle riportata e un aumento della concentrazione totale di particelle riportata.

Trovare la giusta diluizione per posizionare un campione all'interno del campo di rilevamento ottimale può richiedere alcuni tentativi per ciascun campione. La pulizia delle cuvette richiede anche una manipolazione molto attenta. Si consiglia di applicare più di un metodo ortogonale per le misurazioni delle dimensioni delle particelle EV e della concentrazione.

Per caratterizzare i veicoli elettrici è inoltre possibile eseguire la diffusione dinamica della luce, il rilevamento di impulsi resistivi, la microscopia elettronica a trasmissione elettronica e il rilevamento della riflettanza interferometrica a singola particella.