Name: Generazione di organoidi polmonari interi 3D da cellule staminali pluripotenti indotte per la modellazione della biologia e della malattia dello sviluppo polmonare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Scopri come generare organoidi polmonari 3D da cellule staminali pluripotenti indotte umane per modellare lo sviluppo e le malattie polmonari in vitro. Questo protocollo fornisce un modello rinnovabile e manipolabile.

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Questa ricerca è stata supportata dal California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) (DISC2-COVID19-12022).

Questo protocollo di studio è stato approvato dall'Institutional Review Board del programma di protezione della ricerca umana dell'UCSD (181180).
1. Induzione definitiva dell'endoderma da cellule staminali pluripotenti indotte (Giorno 1 - 3)
<ol><li>Scongelare lentamente il fattore di crescita ridotto (GFR) -membrana basale (BM) mezzo di matrice su ghiaccio 30 minuti prima dell'uso. In miscela DMEM/F12 a freddo, diluire il mezzo della matrice GFR BM 1:1 in modo tale che costituisca il 50% di questo mezzo. Posizionare le punte della pipetta P1000 nel congelatore per raffreddare prima dell'uso.</li>
	<li>Rivestire ogni pozzetto di una piastra a 12 pozzetti con 500 μL di mezzo matrice a membrana basale GFR al 50% preparato in DMEM/F12 ghiacciato. Una volta rivestito il numero desiderato di pozzetti, rimuovere qualsiasi miscela media in eccesso e/o bolle dai pozzetti e posizionare la piastra su ghiaccio o frigorifero a 4 °C per 20 minuti per fissare. Quindi, spostare la piastra nell'incubatore a 37 °C durante la notte per gelificare e asciugare.</li>
	<li>Una volta che le hiPSC raggiungono il 70-90% di confluenza, aggiungere 10 μM di inibitore della chinasi associata a Rho (ROCK) Y-27632 un'ora prima della dissociazione. Aspirare il fluido e lavare una volta con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Dissociare gli hiPSC aggiungendo un mezzo di distacco cellulare (0,5 ml / pozzetto di una piastra a 12 pozzetti) e incubare per 20 minuti a 37 °C in un incubatore a CO2 al 5%.</li>
	<li>Rimuovere le piastre dall'incubatore e aggiungere 0,5 ml/12 pozzetti di mezzo di passaggio delle cellule staminali (Tabella 1) ai pozzetti; triturare delicatamente le cellule utilizzando una punta P1000 per ottenere una sospensione a singola cellula. Trasferire cellule dissociate in un tubo centrifugo conico da 15 ml; centrifuga per 5 min a 300 x g.</li>
	<li>Aspirare il mezzo e risospesciare il pellet cellulare con 1 mL di mTeSR Plus media integrato con 10 μM di inibitore ROCK (Y-27632). Eseguire un conteggio delle celle. Aggiungere 2,0 x 105 hiPSC in 1 mL di mTeSR integrato con l'inibitore ROCK Y-27632 per pozzetto di una piastra a membrana basale GFR a 12 pozzetti. Incubare a 37 °C durante la notte. NOTA: il numero di seeding delle celle deve essere ottimizzato per ogni riga di cella. 24 ore dopo la placcatura, i pozzetti dovrebbero essere confluenti al 50% -70%.</li>
	<li>Il giorno 1, aspirare il mTeSR Plus e aggiungere il mezzo di induzione Definitive Endoderm (DE) (Tabella 1) integrato con 100 ng/mL di activina A umana e 5 μM di inibitore GSK3β/attivatore Wnt CHIR99021. NOTA: I media DE con inibitore GSK3β/attivatore Wnt CHIR99021 devono essere rimossi entro 20-24 ore dall'induzione de del giorno 1 per una differenziazione di successo.</li>
	<li>Il giorno 2 e il giorno 3, il passaggio al supporto di induzione DE integrato con 100 ng / mL di activina A solo. NOTA: la differenziazione de non deve superare un totale di 72 ore, o l'efficacia diminuirà. Il giorno 4, se si osserva una moria di grandi cellule, ridurre il tempo totale di esposizione ai media DE di 6-12 ore.</li>
	<li>Per analizzare l'efficienza de, confermare un'espressione superiore al 90% di CXCR4 e/o cKit tramite citometria a flusso o analisi di immunofluorescenza di FOXA2 e/o SOX17 (Figura 2a).</li>
</ol>2. Induzione dell'endoderma anteriore dell'intestino anteriore (AFE) (Giorno 4 - 6)
<ol><li>Il giorno 4, cambiare il mezzo in mezzo basale privo di siero (SFBM) (Tabella 1) integrato con 10 μM SB431542 e 2 μM dorsomorfina per l'induzione afE. Cambia i supporti AFE ogni giorno per 3 giorni (giorno 4, giorno 5 e giorno 6).</li>
	<li>Per analizzare l'efficienza AFE, confermare la robusta espressione di SOX2, TBX1 e FOXA2 tramite colorazione a immunofluorescenza (Figura 2b).</li>
</ol>3. Differenziazione delle cellule progenitrici polmonari (LPC) (Giorno 7 - 16)
<ol><li>Il giorno 7, scongelare il mezzo della matrice della membrana GFR-basale sul ghiaccio. Aspirare il supporto AFE e lavare bene con 1x PBS. Aggiungere 1 mL di soluzione di distacco cellulare e incubare per 10 minuti a 37 °C.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di mezzo di tempra (2% FBS in DMEM/F12) ai pozzetti contenenti la soluzione di distacco cellulare. Mantenere le cellule come aggregati pipettando su e giù delicatamente. Assicurarsi che tutte le cellule siano spostate e trasferite in un tubo centrifugo conico da 15 ml. Centrifuga per 5 min a 300 x g.</li>
	<li>Rimuovere il surnatante e risospese il pellet cellulare in mezzo di tempra integrato con 10 ng/mL di proteina morfogenica ossea ricombinante umana-4 (BMP4), 0,1 μM di acido retinoico all-trans (RA), 3 μM di inibitore GSK3β/attivatore Wnt CHIR99021 e 10 μM di rock inibitore Y-27632.</li>
	<li>Eseguire un conteggio delle celle. Aggiungere 2,5 x 105 celle a 100 μL di mezzo a matrice di membrana fredda GFR-basement, mescolare bene e posizionare la goccia in un pozzetto di una piastra a 12 pozzetti. Incubare la piastra a 37 °C per 30-60 min per permettere al mezzo di polimerizzare. Aggiungere 1 mL di supporto LPC integrato con 10 μM di inibitore ROCK Y-27632 per pozzetto assicurando che la goccia media sia completamente sommersa e incubata a 37 °C durante la notte.</li>
	<li>Il giorno 8, 24 ore dopo l'induzione di LPC, cambiare il mezzo LPC per rimuovere l'inibitore ROCK Y-27632. Cambia il mezzo LPC a giorni alterni per un totale di 9-11 giorni. NOTA: Se il mezzo diventa giallo entro 24 ore, cambiare mezzo ogni giorno.</li>
	<li>Per analizzare l'efficienza LPC, confermare una robusta espressione del fattore di trascrizione intracellulare NKX2-1 o eseguire la citometria a flusso per i marcatori di superficie CD47hi/CD26low15 o CPM18 (Figura 2c). Grossolanamente, gli sferoidi LPC dovrebbero essere rotondi e trasparenti (Figura 2c). NOTA: Non procedere con la differenziazione degli organoidi polmonari se l'efficienza di NKX2-1 è inferiore al 30%.</li>
</ol>4.3D induzione di organoidi polmonari (Giorno 16 - 22)
<ol><li>Il giorno 17, scongelare il mezzo della matrice della membrana GFR-basale sul ghiaccio. Aspirare il mezzo di induzione LPC. Aggiungere quindi 2 μg/mL di dispasi (1 mL) al pozzo e risospescere la miscela media/dispase con una pipetta P1000. Incubare a 37 °C per 15 min. Triturare nuovamente la miscela e incubare a 37 °C per altri 15 minuti.</li>
	<li>Trasferire la dispacciatura e le celle in un tubo centrifugo conico da 15 ml. Utilizzare PBS refrigerato (2-3 ml) per lavare il pozzetto e risospesso la miscela dispase/cell. Centrifuga per 5 min a 400 x g. Rimuovere manualmente il surnatante, facendo attenzione a non distubare lo strato di pellet medio/cellulare. Ripetere il lavaggio PBS refrigerato e centrifugare il tubo della centrifuga conica per altri 5 minuti a 400 x g.</li>
	<li>Rimuovere manualmente il surnatante e quindi aggiungere 2 ml di soluzione di dissociazione a base di tripsina al tubo conico della centrifuga. Incubare a 37 °C per 12 min.</li>
	<li>Dopo l'incubazione, risospese le cellule con una punta della pipetta P1000. Quindi aggiungere un volume uguale di mezzi di tempra al tubo conico della centrifuga e girare verso il basso a 400 x g per 5 minuti. Aspirare le cellule surnatante e risospese in mezzo di tempra + 10 μM di inibitore ROCK Y-27632. NOTA: l'induzione di organoidi polmonari di successo si verifica quando le cellule sono incorporate come aggregati, non singole cellule, regolare il pipettaggio di conseguenza.</li>
	<li>Eseguire un conteggio delle celle. Calcola il volume necessario per ottenere 5,0-8,0 x 104 celle per pozzetto. Aliquotare gli aggregati di cellule LPC in tubi microcentrifuga da 1,5 mL e centrifugare per 5 minuti a 400 x g. Rimuovere il surnatante in eccesso, facendo attenzione a non agitare il pellet cellulare. Lasciare solo 10 μL di mezzo residuo.</li>
	<li>Sospendere nuovamente il pellet cellulare in 200 μL di mezzo a matrice di membrana fredda GFR-basamento e aggiungere agli inserti della membrana di coltura cellulare (diametro 6,5 mm, poro 0,4 μm, membrana in poliestere). Incubare la piastra a 37 °C per 30-60 minuti per consentire la polimerizzazione del mezzo a matrice di membrana GFR-basement.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di mezzo di induzione organoide 3D (Tabella 1) integrato con fattore di crescita dei fibroblasti-7 (FGF7) (10 ng/mL), FGF10 (10 ng/mL), inibitore GSK3β/attivatore Wnt CHIR (3 μM), fattore di crescita epidermico (EGF) (10 ng/mL) e 10 μM di inibitore ROCK Y-27632 alla camera basolaterale dell'inserto di membrana. Cambia il mezzo a giorni alterni per 6 giorni.</li>
</ol>5.3D Ramificazione organoide polmonare (Giorno 23 - 28)
<ol><li>Il giorno 23 passa al mezzo ramificato 3D (Tabella 1) integrato con FGF7 (10 ng / mL), FGF10 (10 ng / mL), inibitore GSK3β / attivatore Wnt CHIR99021 (3 μM), RA (0,1 μM), EGF (10 ng / mL) e fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) / fattore di crescita placentare (PlGF) (10 ng / mL). Cambia il mezzo a giorni alterni per 6 giorni. NOTA: Al giorno 6 della differenziazione ramificata 3D, dovrebbero esserci più organoidi ramificati (Figura 2).</li>
</ol>6.3D maturazione organoide polmonare (Giorno 29 - 34)
<ol><li>Il giorno 29, passare al mezzo di maturazione 3D (Tabella 1), che è lo stesso del mezzo di ramificazione 3D ma con l'aggiunta di desametasone (50 nM), cAMP (100 μM) e 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX), un inibitore della fosfodiesterasi chiamato anche isobutilxantina (100 μM). Cambia il mezzo a giorni alterni per 6 giorni. NOTA: Entro 24 ore dalla maturazione 3D, gli organoidi ramificati dovrebbero espandersi e trasformarsi in sfere trasparenti.</li>
</ol>7.3D Immunocitochimica organoide polmonare
<ol><li>Per l'analisi organoide polmonare intera 3D, fissare il mezzo della matrice della membrana basale GFR negli inserti di membrana con paraformaldeide (PFA) al 4% per 1 ora a 4 °C. Incorporare la cera di paraffina e montarla su diapositive secondo i protocolli standard pubblicati.</li>
	<li>Eseguire il recupero dell'antigene prima della colorazione. I marcatori delle vie aeree includono KRT5, MUC5AC e SCGB3A2. I marcatori alveolari includono SP-C, SP-B, HTII-280, HTI-56 e HOPX (Figura 3).</li>
</ol>8. Rimozione di organoidi polmonari interi dal mezzo della matrice della membrana GFR-basale per il passaggio, FACS o crioconservazione
<ol><li>Per dissociare gli organoidi dal mezzo della matrice della membrana basale GFR, rimuovere i mezzi dalla camera basale e aggiungere 2 μg/mL di dispasi (1 mL) nella camera apicale.</li>
	<li>Triturare delicatamente la miscela media/dispasa con una pipetta P1000 e metterla nell'incubatrice per 15 min. Triturare delicatamente la miscela di nuovo e incubare per altri 15 minuti.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di PBS refrigerato (4 °C) e trasferire gli organoidi con il mezzo della matrice in un tubo centrifugo conico da 15 mL. Girare a 400 x g per 5 min. Rimuovere il surnatante con attenzione, per non disturbare il pellet cellulare.</li>
	<li>Lavare ancora una volta con 1 mL di PBS refrigerato e girare a 400 x g per 5 minuti. Rimuovere il surnatante con attenzione, per non disturbare la miscela medio/cellulare.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di soluzione di distacco cellulare al tubo conico della centrifuga, triturare delicatamente la miscela media/cellulare della matrice di membrana GFR-Basement. Mettere nell'incubatrice per 12 minuti per il passaggio di cellule come aggregati o per la crioconservazione) o 20 minuti per la sospensione a singola cellula.</li>
	<li>Aggiungere lo stesso volume di mezzi di tempra e girare verso il basso a 400 x g per 5 minuti. Risospeso in mezzo di tempra + 10 μM di ROCK Inibitore Y-27632. NOTA: In questa fase, nel tubo non si deve vedere alcun mezzo residuo della membrana basale. Se il mezzo residuo rimane, ripetere i passaggi 8.5 e 8.6.</li>
	<li>Eseguire un conteggio delle celle. Calcolare il volume necessario per le applicazioni a valle.</li>
</ol>

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<li>Leibel, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+surfactant+protein+B+deficiency+in+patient+specific+human+induced+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids+by+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Reversal of surfactant protein B deficiency in patient specific human induced pluripotent stem cell derived lung organoids by gene therapy.</a> Scientific Reports. 9 (1), 13450(2019).</li>
<li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+cells+as+stem+cells+of+the+mouse+trachea+and+human+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).</li>
<li>Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HTII-280%2C+a+biomarker+specific+to+the+apical+plasma+membrane+of+human+lung+alveolar+type+II+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%3A+Official+Journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">HTII-280, a biomarker specific to the apical plasma membrane of human lung alveolar type II cells.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 891-901 (2010).</li>
<li>McCauley, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomic+profiling+of+pluripotent+stem+cell-derived+SCGB3A2%2B+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomic profiling of pluripotent stem cell-derived SCGB3A2+ airway epithelium.</a> Stem Cell Reports. 10 (5), 1579-1595 (2018).</li>
<li>Sekine, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+detection+of+undifferentiated+iPSC+among+differentiated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Robust detection of undifferentiated iPSC among differentiated cells.</a> Scientific Reports. 10 (1), 10293(2020).</li>
<li>Jacquet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategy+for+the+creation+of+clinical+grade+hESC+line+banks+that+HLA-match+a+target+population%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Strategy for the creation of clinical grade hESC line banks that HLA-match a target population.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (1), 10-17 (2013).</li>
<li>Mattapally, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+leukocyte+antigen+class+I+and+II+knockout+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cells%3A+universal+donor+for+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">Human leukocyte antigen class I and II knockout human induced pluripotent stem cell-derived cells: universal donor for cell therapy.</a> Journal of the American Heart Association. 7 (23), 010239(2018).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il successo della differenziazione degli organoidi polmonari interi 3D (WLO) si basa su un protocollo multi-step di 6 settimane con attenzione ai dettagli, incluso il tempo di esposizione a fattori di crescita e piccole molecole, la densità cellulare dopo il passaggio e la qualità delle hiPSC. Per la risoluzione dei problemi, vedere la Tabella 2. Le hiPSC dovrebbero essere confluenti per circa il 70%-80%, con meno del 5% di differenziazione spontanea prima della dissociazione. Questo protocollo richiede ...

Il polmone è un organo complicato, eterogeneo e dinamico che si sviluppa in sei fasi distinte: maturazione embrionale, pseudoghiandolare, canalicolare, sacculare, alveolare e microvascolare1,2. Le ultime due fasi si verificano prima e dopo la nascita nello sviluppo umano, mentre le prime quattro fasi si verificano esclusivamente durante lo sviluppo fetale, a meno che non si verifichi la nascita pretermine3. La fase embrionale inizia nello strato germinale endodermico e si conclude con il germogliamento della trachea e delle gemme polmonari. Lo sviluppo polmonare avviene in parte attraverso la segnalazione tra le cellule epiteliali e mesenchimali4. Queste interazioni provocano la ramificazione polmonare, la proliferazione, la determinazione del destino cellulare e la differenziazione cellulare del polmone in via di sviluppo. Il polmone è diviso in zone conduttrici (trachea ai bronchioli terminali) e zone respiratorie (bronchioli respiratori agli alveoli). Ogni zona contiene tipi di cellule epiteliali uniche; comprese le cellule basali, secretorie, ciliate, a pennello, neuroendocrine e ionocitarie nelle vie aeree conduttrici5, seguite da cellule alveolari di tipo I e II nell'epitelio respiratorio6. Molto è ancora sconosciuto sullo sviluppo e la risposta alle lesioni dei vari tipi di cellule. I modelli di organoidi polmonari derivati da iPSC consentono lo studio dei meccanismi che guidano lo sviluppo del polmone umano, gli effetti delle mutazioni genetiche sulla funzione polmonare e la risposta sia dell'epitelio che del mesenchima agli agenti infettivi senza la necessità di tessuto polmonare umano primario.
I marcatori corrispondenti ai vari stadi della differenziazione embrionale includono CXCR4, cKit, FOXA2 e SOX17 per l'endoderma definitivo (DE)7, FOXA2, TBX1 e SOX2 per l'endoderma anteriore dell'intestino anteriore (AFE)8 e NKX2-1 per le prime cellule progenitrici polmonari9. Nello sviluppo polmonare embrionale, l'intestino anteriore si divide nell'esofago dorsale e nella trachea ventrale. Le gemme dei polmoni destro e sinistro appaiono come due outpouching indipendenti attorno al germoglio tracheale10. Durante la morfogenesi ramificata, il mesenchima che circonda l'epitelio produce tessuto elastico, muscolatura liscia, cartilagine e vascolarizzazione11. L'interazione tra l'epitelio e il mesenchima è essenziale per il normale sviluppo polmonare. Ciò include la secrezione di FGF1012 da parte del mesenchima e SHH13 prodotto dall'epitelio.
Qui, descriviamo un protocollo per la differenziazione diretta delle hiPSC in organoidi polmonari interi tridimensionali (3D) (WLO). Mentre ci sono approcci simili che incorporano l'isolamento delle cellule progenitrici polmonari tramite smistamento allo stadio LPC per produrre organoidi alveolari14,15 (distali) o organoidi delle vie aeree16 (prossimali), o generare sferoidi ventrali-anteriori del foregut per produrre organoidi polmonari umani che esprimono marcatori alveolari e mesenchimali e organoidi progenitori della punta delle gemme17 , il punto di forza di questo metodo è l'inclusione di entrambi i tipi di cellule epiteliali e mesenchimali polmonari per modellare e orchestrare la morfogenesi, la maturazione e l'espansione della ramificazione polmonare in vitro.
Questo protocollo utilizza piccole molecole e fattori di crescita per dirigere la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti attraverso l'endoderma definitivo, l'endoderma dell'intestino anteriore e le cellule progenitrici polmonari. Queste cellule vengono quindi indotte in organoidi polmonari interi 3D attraverso importanti fasi di sviluppo, tra cui la ramificazione e la maturazione. Il riassunto del protocollo di differenziazione è mostrato nella Figura 1a con immagini rappresentative in campo luminoso della differenziazione endodermica e organoide mostrata nella Figura 1b. La Figura 1c,d mostra i dettagli dell'espressione genica della differenziazione endodermica e l'espressione genica di entrambe le popolazioni prossimali e distali delle cellule epiteliali polmonari dopo aver completato la differenziazione.

<table><tbody><tr><td>Cell Culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>12 pozzetti</td><td>piastre Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>inserti a 12 pozzetti, 0,4um, traslucido</td><td>VWR</td><td>10769-208</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Tech</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>acido ascorbico</td><td>Sigma</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>B27 senza acido retinoico</td><td>ThermoFisher</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA) Frazione V, soluzione al 7,5%</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>StemCellTech</td><td>7913</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>10565042</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10082139</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Tecnologie</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Ham' s F12</td><td>Invitrogen</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Iscove' s Dulbecco' modificato s Medium (IMDM) + Glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>31980030</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacement (KSR)</td><td>Life Technologies</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Monotioglicerolo</td><td>Sigma</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR plus Kit (10/cassa)</td><td>Stem Cell Tech</td><td>5825</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>ThermoFisher</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Life Technologies</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Pen/strep</td><td>Lonza</td><td>17-602F</td><td></td></tr><tr><td>ReleSR</td><td>Stem Cell Tech</td><td>5872</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 + Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>12633012</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>12605-028</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 (Inibitore della roccia)</td><td>R& D Systems</td><td>1254/1</td><td></td></tr><tr><td>Fattori di crescita/Piccole molecole</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Activina A</td><td>R& D Systems</td><td>338-AC</td><td></td></tr><tr><td>Acido retinoico all-trans (RA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>BMP4</td><td>R& D Systems</td><td>314-BP/CF</td><td></td></tr><tr><td>Br-cAMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5386</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Abcam</td><td>ab120890</td><td></td></tr><tr><td>Desametasone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>Dorsomorfina</td><td>R& D Systems</td><td>3093</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>R& D Systems</td><td>236-EG</td><td></td></tr><tr><td>FGF10</td><td>R& D Systems</td><td>345-FG/CF</td><td></td></tr><tr><td>FGF7</td><td>R& D Systems</td><td>251-KG/CF</td><td></td></tr><tr><td>IBMX (3-isobtil-1-metilxantina)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>R& D Systems</td><td>1614</td><td></td></tr><tr><td>VEGF/PIGF</td><td>R& D Systems</td><td>297-VP/CF</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Anticorpi primari</td><td></td><td></td><td>Tasso di diluizione</td></tr><tr><td>CXCR4-PE</td><td>R& D Systems</td><td>FAB170P</td><td>1:200 (F)</td></tr><tr><td>HOPX</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-398703</td><td>0.180555556</td></tr><tr><td>HTII-280</td><td>Terrace Biotech</td><td>TB-27AHT2-280</td><td>0.145833333</td></tr><tr><td>KRT5</td><td>Abcam</td><td>ab52635</td><td>0.180555556</td></tr><tr><td>NKX2-1</td><td>Abcam</td><td>ab76013</td><td>0.25</td></tr><tr><td>NKX2-1-APC</td><td>LS-BIO</td><td>LS-C264437</td><td>1:1000 (F)</td></tr><tr><td>proSPC</td><td>Abcam</td><td>ab40871</td><td>0.215277778</td></tr><tr><td>SCGB3A2</td><td>Abcam</td><td>ab181853</td><td>0.25</td></tr><tr><td>SOX2</td><td>Invitrogen</td><td>MA1-014</td><td>0.180555556</td></tr><tr><td>SOX9</td><td>R& D Systems</td><td>AF3075</td><td>0.180555556</td></tr><tr><td>SPB (maturo)</td><td>7 Hills</td><td>48604</td><td>1: 1500 (F) 1:500 (W)a</td></tr><tr><td>SPC (maturo)</td><td>LS Bio</td><td>LS-B9161</td><td>1:100 (F); 1:500 (W) a</td></tr></tbody></table>

generazione di organoidi polmonari interi 3d da cellule staminali pluripotenti indotte per la modellazione della biologia e della malattia dello sviluppo polmonare

Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease

Lo sviluppo e la malattia polmonare umana sono stati difficili da studiare a causa della mancanza di sistemi modello in vitro biologicamente rilevanti. Le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC) possono essere differenziate gradualmente in organoidi polmonari multicellulari 3D, costituiti da popolazioni di cellule epiteliali e mesenchimali. Ricapitoliamo i segnali di sviluppo embrionale introducendo temporalmente una varietà di fattori di crescita e piccole molecole per generare in modo efficiente l'endoderma definitivo, l'endoderma dell'intestino anteriore e successivamente le cellule progenitrici polmonari. Queste cellule vengono quindi incorporate nel mezzo della matrice della membrana basale a fattore di crescita ridotto (GFR), consentendo loro di svilupparsi spontaneamente in organoidi polmonari 3D in risposta a fattori di crescita esterni. Questi organoidi polmonari interi (WLO) subiscono fasi iniziali di sviluppo polmonare tra cui morfogenesi ramificata e maturazione dopo l'esposizione a desametasone, AMP ciclico e isobutilxantina. I WLO possiedono cellule epiteliali delle vie aeree che esprimono i marcatori KRT5 (basale), SCGB3A2 (club) e MUC5AC (calice) e cellule epiteliali alveolari che esprimono HOPX (tipo alveolare I) e SP-C (tipo alveolare II). Sono presenti anche cellule mesenchimali, tra cui l'actina della muscolatura liscia (SMA) e il recettore A del fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGFRα). I WLO derivati da iPSC possono essere mantenuti in condizioni di coltura 3D per molti mesi e possono essere ordinati per i marcatori di superficie per purificare una specifica popolazione cellulare. I LLO derivati da iPSC possono anche essere utilizzati per studiare lo sviluppo polmonare umano, compresa la segnalazione tra l'epitelio polmonare e il mesenchima, per modellare mutazioni genetiche sulla funzione e lo sviluppo delle cellule polmonari umane e per determinare la citotossicità degli agenti infettivi.

24 ore dopo la placcatura, giorno 1, le iPSC dovrebbero essere confluenti al 50% -90%. Il giorno 2, DE dovrebbe essere confluente al 90% -95%. Durante l'induzione de, è comune osservare una significativa morte cellulare il giorno 4, ma le cellule attaccate manterranno una morfologia compatta di ciottoli (Figura 2b). Interrompere la differenziazione se la maggior parte delle cellule aderenti si stacca e considera di abbreviare l'esposizione ai mezzi DE con activina A di 6-12 ore. Durante l'in...

L'articolo descrive la differenziazione diretta graduale delle cellule staminali pluripotenti indotte in organoidi polmonari interi tridimensionali contenenti cellule polmonari epiteliali sia prossimali che distali insieme a mesenchima.

Generazione di organoidi polmonari interi 3D da cellule staminali pluripotenti indotte per la modellazione della biologia e della malattia dello sviluppo polmonare

Human lung development and disease has been difficult to study due to the lack of biologically relevant in vitro model systems. Human induced pluripotent ...

Questo protocollo utilizza cellule staminali pluripotenti indotte per differenziarle in cellule polmonari al fine di modellare la malattia polmonare umana e lo sviluppo in un piatto. Questo protocollo è significativo perché è difficile ottenere e coltivare tessuto polmonare umano primario. I principali vantaggi di differenziare le cellule polmonari dalle cellule staminali pluripotenti è quello di avere un apporto costante di cellule polmonari specifiche per studiare lo sviluppo e la malattia polmonare umana.Queste cellule possono essere mantenute in coltura cellulare per lunghi periodi di tempo, possono essere crioconservate per applicazioni future e possono essere geneticamente manipolate per studiare le mutazioni geniche. A dimostrare la procedura sarà Rachel McVicar, dottoranda del mio laboratorio. Prima di iniziare l'esperimento, scongelare lentamente un fattore di crescita ridotto, o GFR, mezzo della matrice della membrana basale sul ghiaccio e diluirlo in un volume uguale di DMEM F12 freddo.Posizionare le punte P1000 nel congelatore per raffreddare prima dell'uso. Quindi, rivestire ogni pozzetto di una piastra a 12 pozzetti con 500 microlitri del mezzo a matrice di membrana basale 50% GFR e rimuovere qualsiasi miscela di mezzo in eccesso e bolle dai pozzetti. Posizionare le piastre del pozzo sopra il ghiaccio bagnato o un frigorifero a quattro gradi Celsius per impostare per 20 minuti, quindi spostare la piastra sull'incubatore a 37 gradi Celsius durante la notte.Quando i PSE elevati raggiungono il 70% di confluenza, aggiungere 10 inibitori ROCK micromolari Y27632 alle cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo e attendere un'ora prima della dissociazione. Aspirare il fluido e lavare le celle una volta con PVS. Dissociare le IPSC aggiungendo 500 microlitri di mezzo di distacco cellulare per pozzetto e incubare per 20 minuti a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica al 5%.Dopo l'incubazione, aggiungere 500 microlitri di mezzo di passaggio delle cellule staminali per pozzetto. Pipettare delicatamente le celle utilizzando una punta P1000 per ottenere una sospensione a cella singola. Quindi trasferire le cellule dissociate in un tubo da 15 millilitri e centrifuga per cinque minuti a 300 volte G.Dopo la centrifugazione, aspirare il mezzo e risospesciare il pellet cellulare con un millilitro di mTeSR Plus media integrato con 10 inibitori ROCK micromolari.Dopo aver contato le cellule, aggiungere due volte 10 alla quinta IPSC a ciascun pozzetto di una piastra a rivestimento medio GFR a 12 pozzetti e incubare durante la notte a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo, aspirare mTeSR Plus prima di aggiungere un supporto di induzione definitivo dell'endoderma o DE. Nei giorni due e tre, cambiare il supporto di induzione DE.Il quarto giorno, iniziare l'induzione AFE sostituendo il mezzo di induzione DE con mezzo basale privo di siero. Cambiare il mezzo AFE ogni giorno per tre giorni prima di analizzare l'efficienza AFE alla fine del sesto giorno. Il settimo giorno, scongelare il mezzo della matrice della membrana basale GFR sul ghiaccio per un uso successivo.Contemporaneamente, procedere con la differenziazione delle cellule progenitrici polmonari aspirando i mezzi AFE e lavando i pozzetti con PVS. Aggiungere un millilitro di soluzione di distacco cellulare al pozzo e incubare per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, aggiungere un millilitro di mezzi di tempra alla soluzione di distacco cellulare contenente Wells.Mantenere le cellule come aggregati pipettando delicatamente su e giù. Assicurarsi che tutte le cellule siano spostate, ma per trasferirle in un tubo conico da 15 millilitri per la centrifugazione a 300 volte G per cinque minuti. Rimuovere il surnatante e risospese il pellet cellulare nel mezzo di induzione LPC.Contare le cellule e aggiungere 2,5 volte 10 alla quinta cella a 100 microlitri di mezzo a matrice di membrana basale GFR fredda e mescolare bene. Posizionare una goccia in un pozzetto di una piastra a 12 pozzetti e incubare a 37 gradi Celsius per 30-60 minuti. Quindi, aggiungere un millilitro di fluidi LPC per pozzetto, assicurandosi che la goccia media sia completamente sommersa e incubare durante la notte a 37 gradi Celsius.L'ottavo giorno, cambiare il mezzo LPC per rimuovere l'inibitore ROCK Y27632. Continua a cambiare i media a giorni alterni e analizza l'efficienza LPC alla fine del giorno 16. Il giorno 17, lavare i pozzetti e aggiungere 500 microlitri di due microgrammi per millilitro dispase.Pipettare la miscela dispase con una pipetta P1000 e incubare per 15 minuti, quindi pipettare la miscela e incubare per altri 15 minuti. Dopo l'incubazione, aggiungere un millilitro del mezzo di tempra ai pozzetti contenenti dispase e trasferire le cellule in tubi conici. Centrifugare e risospese il pellet in un millilitro di PVS refrigerato, quindi ripetere la centrifugazione.Quindi risospesare il pellet in un millilitro di mezzo di distacco cellulare. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 12 minuti, quindi aggiungere un volume uguale di mezzi di tempra e centrifugare di nuovo. Risospesciare il pellet in un millilitro di mezzi di tempra e 10 micromolari inibitore ROCK Y27632.Eseguire un conteggio delle celle per calcolare il volume necessario per ottenere otto volte 10 alle quarte celle per pozzetto. Quindi aliquota richiesta volume di aggregati di celle LPC in tubi micro centrifuga da 1,5 millilitri e centrifuga per cinque minuti a 300 volte G.Rimuovere il surnatante in eccesso senza agitare il pellet cellulare, lasciando 10 microlitri di mezzo residuo. Risospesso il pellet cellulare in 200 microlitri di mezzo a membrana basale GFR fredda e trasferire le cellule agli inserti della membrana di coltura cellulare.Incubare a 37 gradi Celsius per 30-60 minuti. Dopo l'incubazione, aggiungere un millilitro di mezzo di induzione organoide 3D alla camera basolaterale dell'inserto e sostituirlo con un mezzo fresco a giorni alterni per sei giorni. Il giorno 23, passa il mezzo al mezzo di ramificazione 3D, quindi cambia il mezzo a giorni alterni per sei giorni.Il giorno 29, passa al mezzo di maturazione 3D e continua a sostituire il mezzo a giorni alterni per i prossimi sei giorni. Il quarto giorno di induzione DE, le cellule attaccate mostrano una morfologia compatta di ciottoli. I marcatori endodermici definitivi CXCR4 e SOX17 sovrapposti ai nuclei sono stati espressi, confermando la differenziazione endodermica.L'induzione del foregut anteriore è stata confermata il settimo giorno con la morfologia che mostra cellule più strettamente compattate e i marcatori FOXA2 e SOX2 sovrapposti ai nuclei. La generazione di cellule progenitrici polmonari 3D è stata confermata con sferoidi 3D e l'espressione endogena di NKX2-1 GFP in una linea cellulare reporter. Dopo una differenziazione di tre settimane in organoidi polmonari interi, i marcatori polmonari sono stati analizzati mediante immunocitochimica.Negli organoidi sono stati osservati marcatori per la morfogenesi ramificata SOX2 e SOX9 sovrapposti da nuclei. I marcatori polmonari prossimali P63 e KRT5, entrambi marcatori di cellule basali, sono stati rilevati con successo insieme a SCGB3A2, che è un marcatore per le cellule club. I marcatori polmonari distali hanno indotto marcatori Pro SPC e SPB per cellule alveolari di tipo II.E marcatori HOPX di cellule alveolari di tipo I. Inoltre, NKX2-1 e ZO1 sono stati espressi sovrapposti a nuclei. I marcatori delle cellule polmonari mesenchima PGFR Alpha, un marcatore per i fibroblasti, co-espresso con SOX9, rappresentavano il mesenchima distale.Anche la vimentina è stata espressa ed è stata dispersa in tutto il polmone. Seguendo questa procedura, gli organoidi polmonari possono essere investiti con cellule staminali pluripotenti indotte derivate da cellule staminali endoteliali e immuni. Lo sviluppo e la malattia polmonare si verificano mediante una segnalazione tra le popolazioni di cellule epiteliali e mesenchimali, ma anche da cellule endoteliali e macrofagi.Un sistema di modelli di tessuto polmonare 3D è clinicamente rilevante per studiare malattie e terapie umane.

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Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

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