Generazione di organoidi polmonari interi 3D da cellule staminali pluripotenti indotte per la modellazione della biologia e della malattia dello sviluppo polmonare

Questo protocollo utilizza cellule staminali pluripotenti indotte per differenziarle in cellule polmonari al fine di modellare la malattia polmonare umana e lo sviluppo in un piatto. Questo protocollo è significativo perché è difficile ottenere e coltivare tessuto polmonare umano primario. I principali vantaggi di differenziare le cellule polmonari dalle cellule staminali pluripotenti è quello di avere un apporto costante di cellule polmonari specifiche per studiare lo sviluppo e la malattia polmonare umana.

Queste cellule possono essere mantenute in coltura cellulare per lunghi periodi di tempo, possono essere crioconservate per applicazioni future e possono essere geneticamente manipolate per studiare le mutazioni geniche. A dimostrare la procedura sarà Rachel McVicar, dottoranda del mio laboratorio. Prima di iniziare l'esperimento, scongelare lentamente un fattore di crescita ridotto, o GFR, mezzo della matrice della membrana basale sul ghiaccio e diluirlo in un volume uguale di DMEM F12 freddo.

Posizionare le punte P1000 nel congelatore per raffreddare prima dell'uso. Quindi, rivestire ogni pozzetto di una piastra a 12 pozzetti con 500 microlitri del mezzo a matrice di membrana basale 50% GFR e rimuovere qualsiasi miscela di mezzo in eccesso e bolle dai pozzetti. Posizionare le piastre del pozzo sopra il ghiaccio bagnato o un frigorifero a quattro gradi Celsius per impostare per 20 minuti, quindi spostare la piastra sull'incubatore a 37 gradi Celsius durante la notte.

Quando i PSE elevati raggiungono il 70% di confluenza, aggiungere 10 inibitori ROCK micromolari Y27632 alle cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo e attendere un'ora prima della dissociazione. Aspirare il fluido e lavare le celle una volta con PVS. Dissociare le IPSC aggiungendo 500 microlitri di mezzo di distacco cellulare per pozzetto e incubare per 20 minuti a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica al 5%.

Dopo l'incubazione, aggiungere 500 microlitri di mezzo di passaggio delle cellule staminali per pozzetto. Pipettare delicatamente le celle utilizzando una punta P1000 per ottenere una sospensione a cella singola. Quindi trasferire le cellule dissociate in un tubo da 15 millilitri e centrifuga per cinque minuti a 300 volte G.Dopo la centrifugazione, aspirare il mezzo e risospesciare il pellet cellulare con un millilitro di mTeSR Plus media integrato con 10 inibitori ROCK micromolari.

Dopo aver contato le cellule, aggiungere due volte 10 alla quinta IPSC a ciascun pozzetto di una piastra a rivestimento medio GFR a 12 pozzetti e incubare durante la notte a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo, aspirare mTeSR Plus prima di aggiungere un supporto di induzione definitivo dell'endoderma o DE. Nei giorni due e tre, cambiare il supporto di induzione DE.

Il quarto giorno, iniziare l'induzione AFE sostituendo il mezzo di induzione DE con mezzo basale privo di siero. Cambiare il mezzo AFE ogni giorno per tre giorni prima di analizzare l'efficienza AFE alla fine del sesto giorno. Il settimo giorno, scongelare il mezzo della matrice della membrana basale GFR sul ghiaccio per un uso successivo.

Contemporaneamente, procedere con la differenziazione delle cellule progenitrici polmonari aspirando i mezzi AFE e lavando i pozzetti con PVS. Aggiungere un millilitro di soluzione di distacco cellulare al pozzo e incubare per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, aggiungere un millilitro di mezzi di tempra alla soluzione di distacco cellulare contenente Wells.

Mantenere le cellule come aggregati pipettando delicatamente su e giù. Assicurarsi che tutte le cellule siano spostate, ma per trasferirle in un tubo conico da 15 millilitri per la centrifugazione a 300 volte G per cinque minuti. Rimuovere il surnatante e risospese il pellet cellulare nel mezzo di induzione LPC.

Contare le cellule e aggiungere 2,5 volte 10 alla quinta cella a 100 microlitri di mezzo a matrice di membrana basale GFR fredda e mescolare bene. Posizionare una goccia in un pozzetto di una piastra a 12 pozzetti e incubare a 37 gradi Celsius per 30-60 minuti. Quindi, aggiungere un millilitro di fluidi LPC per pozzetto, assicurandosi che la goccia media sia completamente sommersa e incubare durante la notte a 37 gradi Celsius.

L'ottavo giorno, cambiare il mezzo LPC per rimuovere l'inibitore ROCK Y27632. Continua a cambiare i media a giorni alterni e analizza l'efficienza LPC alla fine del giorno 16. Il giorno 17, lavare i pozzetti e aggiungere 500 microlitri di due microgrammi per millilitro dispase.

Pipettare la miscela dispase con una pipetta P1000 e incubare per 15 minuti, quindi pipettare la miscela e incubare per altri 15 minuti. Dopo l'incubazione, aggiungere un millilitro del mezzo di tempra ai pozzetti contenenti dispase e trasferire le cellule in tubi conici. Centrifugare e risospese il pellet in un millilitro di PVS refrigerato, quindi ripetere la centrifugazione.

Quindi risospesare il pellet in un millilitro di mezzo di distacco cellulare. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 12 minuti, quindi aggiungere un volume uguale di mezzi di tempra e centrifugare di nuovo. Risospesciare il pellet in un millilitro di mezzi di tempra e 10 micromolari inibitore ROCK Y27632.

Eseguire un conteggio delle celle per calcolare il volume necessario per ottenere otto volte 10 alle quarte celle per pozzetto. Quindi aliquota richiesta volume di aggregati di celle LPC in tubi micro centrifuga da 1,5 millilitri e centrifuga per cinque minuti a 300 volte G.Rimuovere il surnatante in eccesso senza agitare il pellet cellulare, lasciando 10 microlitri di mezzo residuo. Risospesso il pellet cellulare in 200 microlitri di mezzo a membrana basale GFR fredda e trasferire le cellule agli inserti della membrana di coltura cellulare.

Incubare a 37 gradi Celsius per 30-60 minuti. Dopo l'incubazione, aggiungere un millilitro di mezzo di induzione organoide 3D alla camera basolaterale dell'inserto e sostituirlo con un mezzo fresco a giorni alterni per sei giorni. Il giorno 23, passa il mezzo al mezzo di ramificazione 3D, quindi cambia il mezzo a giorni alterni per sei giorni.

Il giorno 29, passa al mezzo di maturazione 3D e continua a sostituire il mezzo a giorni alterni per i prossimi sei giorni. Il quarto giorno di induzione DE, le cellule attaccate mostrano una morfologia compatta di ciottoli. I marcatori endodermici definitivi CXCR4 e SOX17 sovrapposti ai nuclei sono stati espressi, confermando la differenziazione endodermica.

L'induzione del foregut anteriore è stata confermata il settimo giorno con la morfologia che mostra cellule più strettamente compattate e i marcatori FOXA2 e SOX2 sovrapposti ai nuclei. La generazione di cellule progenitrici polmonari 3D è stata confermata con sferoidi 3D e l'espressione endogena di NKX2-1 GFP in una linea cellulare reporter. Dopo una differenziazione di tre settimane in organoidi polmonari interi, i marcatori polmonari sono stati analizzati mediante immunocitochimica.

Negli organoidi sono stati osservati marcatori per la morfogenesi ramificata SOX2 e SOX9 sovrapposti da nuclei. I marcatori polmonari prossimali P63 e KRT5, entrambi marcatori di cellule basali, sono stati rilevati con successo insieme a SCGB3A2, che è un marcatore per le cellule club. I marcatori polmonari distali hanno indotto marcatori Pro SPC e SPB per cellule alveolari di tipo II.

E marcatori HOPX di cellule alveolari di tipo I. Inoltre, NKX2-1 e ZO1 sono stati espressi sovrapposti a nuclei. I marcatori delle cellule polmonari mesenchima PGFR Alpha, un marcatore per i fibroblasti, co-espresso con SOX9, rappresentavano il mesenchima distale.

Anche la vimentina è stata espressa ed è stata dispersa in tutto il polmone. Seguendo questa procedura, gli organoidi polmonari possono essere investiti con cellule staminali pluripotenti indotte derivate da cellule staminali endoteliali e immuni. Lo sviluppo e la malattia polmonare si verificano mediante una segnalazione tra le popolazioni di cellule epiteliali e mesenchimali, ma anche da cellule endoteliali e macrofagi.

Un sistema di modelli di tessuto polmonare 3D è clinicamente rilevante per studiare malattie e terapie umane.