Name: Uso della coltura di organi di tipo Trowell per studiare la regolazione delle cellule staminali dentali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-08T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: Scopri la coltura di organi di tipo Trowell per studiare le cellule staminali dentali nel topo. Questo metodo consente l'osservazione in vitro del comportamento cellulare e lo screening di molecole regolatorie.

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Questo studio è stato sostenuto dalla Jane and Aatos Erkko Foundation.

Questo protocollo prevede l'uso di animali e tutte le procedure sono state approvate dai comitati etici per l'uso e la cura degli animali e dalla struttura per animali dell'Università di Helsinki.
1. Preparazione del piatto di coltura dell'organo
<ol><li>Eseguire tutte le procedure in una cappa a flusso laminare. Pulire le superfici di lavoro con etanolo al 70% e utilizzare strumenti e soluzioni in vetro autoclavato. Sterilizzare le forbici e altre attrezzature metalliche in uno sterilizzatore a perline di vetro.</li>
	<li>Preparare i filtri normalmente conservati in etanolo al 70% lavandoli tre volte in 1x PBS per rimuovere l'etanolo (Figura 1). Tagliare i filtri in pezzi rettangolari (3 x 3-5 x 5 mm). NOTA: I pezzi filtranti lavati possono essere conservati per diversi giorni in 1x PBS a 4 °C.</li>
	<li>Preparare il terreno di coltura (1:1 DMEM:F12 integrato con 1% [v/v] 200 mM L-alanil-L-glutammina dipeptide in 0,85% NaCl, 10% [v/v] FBS, 150 μg/mL acido ascorbico e 0,2% [v/v] penicillina [10.000 UI/mL] e streptomicina [10.000 μg/mL]). Conservare a 4 °C.</li>
	<li>Posizionare le griglie metalliche da 30 mm (con fori di 1-2 mm di diametro che consentono l'imaging dei tessuti) in una capsula di Petri da 35 mm. Aggiungere un supporto sufficiente per raggiungere la superficie della griglia senza produrre bolle d'aria. Preriscaldare il piatto di coltura preparato a 37 °C fino a quando il tessuto non è isolato e pronto per la coltura (in un'incubatrice standard con 5% di CO2 e 90%-95% di umidità).</li>
</ol>2. Dissezione incisiva e isolamento dell'estremità prossimale
<ol><li>Sacrificare gli animali seguendo un protocollo di cura degli animali approvato.</li>
	<li>Decapitare il topo e sezionare la mandibola. Per fare ciò, prima rimuovere la pelle per esporre la mandibola e tagliare i muscoli masseteri per separarla dalla mascella e dal resto della testa.</li>
	<li>Una volta isolata la mandibola, rimuovere la lingua e quanto più tessuto molle possibile.</li>
	<li>Raccogliere tutte le mandibole e tenerle in una capsula di Petri contenente PBS sul ghiaccio, in quanto ciò migliora la vitalità dei tessuti.</li>
	<li>Trasferire una mandibola su una capsula di Petri di vetro e utilizzare aghi ipodermici monouso da 20/26 G per sezionare l'incisivo sotto uno stereomicroscopio. Dividere la mandibola sulla linea mediana, tagliando la sinfisi. Pulire il tessuto molle e muscolare lontano dalla superficie ossea per una migliore visualizzazione. NOTA: Una capsula di Petri di vetro è essenziale, in quanto ciò non smusserà gli aghi.</li>
	<li>Le mandibole ottenute da animali di età inferiore ai 10 giorni sono più morbide e fragili, quindi utilizzare aghi ipodermici monouso da 20/26 G per aprire longitudinalmente ogni metà della mandibola per esporre il dente incisivo. Per i topi di età superiore a 10 giorni, utilizzare una pinzetta per afferrare la mandibola e rompere l'osso per esporre il dente.</li>
	<li>Staccare delicatamente l'incisivo dall'osso circostante e tagliare l'estremità prossimale, che contiene l'ansa cervicale.</li>
	<li>Tagliare l'estremità prossimale e rimuovere lo smalto mineralizzato e la matrice dentinica.</li>
	<li>Tenere le estremità prossimali raccolte nel PBS di Dulbecco sul ghiaccio fino a quando non sono pronte per la cultura.</li>
</ol>3. Cultura
<ol><li>Posizionare con attenzione un rettangolo di filtro sulla parte superiore di una griglia in un piatto di coltura preriscaldato.</li>
	<li>Utilizzare uno stereomicroscopio per orientare correttamente i pezzi di tessuto.</li>
	<li>Collocare in un'incubatrice standard a 37 °C con 5% di CO2 e 90%-95% di umidità.</li>
	<li>Cambiare il terreno a giorni alterni e sostituirlo con un terreno fresco, evitando accuratamente la formazione di bolle d'aria. Monitorare la crescita dei tessuti e fotografare quotidianamente utilizzando una fotocamera collegata allo stereomicroscopio.</li>
</ol>4. Aggiunta di fattori solubili alla coltura
<ol><li>Integrare il terreno di coltura con fattori solubili e molecole di interesse per studiare il loro effetto sulla regolazione delle SC. NOTA: Il protocollo di somministrazione di qualsiasi molecola (fattori di crescita, molecole di segnalazione, anticorpi bloccanti, composti farmacologici come inibitori o attivatori, vettori, ecc.) dipende dalla sua emivita e solubilità. Questi parametri determinano anche il controllo appropriato da utilizzare.</li>
</ol>5. Analisi molecolari e istologiche
<ol><li>Rimuovere il terreno di coltura.</li>
	<li>Aggiungere con attenzione metanolo ghiacciato ai tessuti per evitare il distacco dai filtri.</li>
	<li>Lasciare metanolo per 5 min.</li>
	<li>Trasferire i filtri che trasportano gli espianti di tessuto alle provette di campionamento.</li>
	<li>Fissare gli espianti in paraformaldeide al 4% in PBS per 10-24 h a 4 °C.</li>
	<li>Procedere con protocolli stabiliti per l'elaborazione istologica (paraffina, congelati, ecc.) o immunocolorazioni.</li>
</ol>6. Coltura di fette di tessuto
NOTA: Esistono diverse varianti a questo protocollo, che hanno tutte lo stesso successo e sono una questione di scelta personale, a seconda della velocità e dell'abilità dell'utente. Questi si riferiscono al tampone utilizzato per raccogliere e mantenere la vitalità dei tessuti. A tale scopo è possibile utilizzare il tampone di Krebs, PBS integrato con glucosio al 2% e antibiotici o PBS. Se si utilizza il tampone Krebs, deve essere preparato con 1 giorno di anticipo e mantenuto a 4 °C.
<ol><li>Prima dell'esperimento, preparare l'agarosio a basso punto di fusione al 4%-5% sciogliendo 2-2,5 g di agarosio a basso punto di fusione in 50 ml di glucosio/PBS bollente al 2%, dopodiché la soluzione deve essere posta a bagnomaria a 45 °C.</li>
	<li>Impostare il vibratomo, lavare con etanolo al 70% e riempire con glucosio ghiacciato al 2% / PBS integrato con antibiotici (100 U / mL di penicillina, 100 mg / mL di streptomicina).</li>
	<li>Sezionare le estremità prossimali dell'incisivo e raccoglierle nel glucosio ghiacciato al 2% / PBS integrato con antibiotici.</li>
	<li>Posizionare un'estremità prossimale dell'incisivo nello stampo contenente il 4% -5% di agarosio a basso punto di fusione. Sotto uno stereomicroscopio, orientare il pezzo nella direzione desiderata e lasciare sul ghiaccio per l'agarosio per indurirsi.</li>
	<li>Rifilate il blocco di agarosio indurito e posizionatelo nel vibratomo. Tagliare fette spesse (150-300 μm).</li>
	<li>Raccogliere le fette in una capsula di Petri contenente glucosio ghiacciato al 2% / PBS integrato con antibiotici.</li>
	<li>Utilizzare una spatola per trasferire le fette spesse su un rettangolo di filtro posto sulla griglia preriscaldata preparata come al punto 1.3.</li>
	<li>Incubare le fette spesse nell'incubatore e procedere con l'imaging (Figura 2).</li>
</ol>

<ol><li>Balic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+explaining+tooth+repair+and+regeneration%3A+A+mini-review%5BTitle%5D)+AND+%22Gerontology%22%5BJournal%5D)">Biology explaining tooth repair and regeneration: A mini-review.</a> Gerontology. 64 (4), 382-388 (2018).</li>
<li>Harada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+putative+stem+cells+in+dental+epithelium+and+their+association+with+Notch+and+FGF+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling.</a> The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).</li>
<li>Smith, C. E., Warshawsky, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+renewal+in+the+enamel+organ+and+the+odontoblast+layer+of+the+rat+incisor+as+followed+by+radioautography+using+3H-thymidine%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine.</a> The Anatomical Record. 183 (4), 523-561 (1975).</li>
<li>Balic, A., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+interactions+regulating+tooth+development+and+renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Tissue interactions regulating tooth development and renewal.</a> Current Topics in Developmental Biology. 115, 157-186 (2015).</li>
<li>Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stem-cell+niche+as+an+entity+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The stem-cell niche as an entity of action.</a> Nature. 441 (7097), 1075-1079 (2006).</li>
<li>Juuri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2+marks+epithelial+competence+to+generate+teeth+in+mammals+and+reptiles%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Sox2 marks epithelial competence to generate teeth in mammals and reptiles.</a> Development. 140 (7), 1424-1432 (2013).</li>
<li>Juuri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2%2B+stem+cells+contribute+to+all+epithelial+lineages+of+the+tooth+via+Sfrp5%2B+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors.</a> Developmental Cell. 23 (2), 317-328 (2012).</li>
<li>Feng, J., Mantesso, A., De Bari, C., Nishiyama, A., Sharpe, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+origin+of+mesenchymal+stem+cells+contributing+to+organ+growth+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dual origin of mesenchymal stem cells contributing to organ growth and repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (16), 6503-6508 (2011).</li>
<li>Kaukua, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+origin+of+mesenchymal+stem+cells+in+a+tooth+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glial origin of mesenchymal stem cells in a tooth model system.</a> Nature. 513 (7519), 551-554 (2014).</li>
<li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretion+of+shh+by+a+neurovascular+bundle+niche+supports+mesenchymal+stem+cell+homeostasis+in+the+adult+mouse+incisor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor.</a> Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).</li>
<li>Vidovic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alphaSMA-expressing+perivascular+cells+represent+dental+pulp+progenitors+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">alphaSMA-expressing perivascular cells represent dental pulp progenitors in vivo.</a> Journal of Dental Research. 96 (3), 323-330 (2017).</li>
<li>Trowell, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+technique+for+organ+culture+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">A modified technique for organ culture in vitro.</a> Experimental Cell Research. 6 (1), 246-248 (1954).</li>
<li>Saxen, L., Vainio, T., Toivonen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+polyoma+virus+on+mouse+kidney+rudiment+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Effect of polyoma virus on mouse kidney rudiment in vitro.</a> Journal of the National Cancer Institute. 29, 597-631 (1962).</li>
<li>Thesleff, I., Sahlberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+culture+in+the+analysis+of+tissue+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Organ culture in the analysis of tissue interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 461, 23-30 (2008).</li>
<li>Jarvinen, E., Shimomura-Kuroki, J., Balic, A., Jussila, M., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+limits+tooth+number%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal Wnt/beta-catenin signaling limits tooth number.</a> Development. 145 (4), (2018).</li>
<li>Ahtiainen, L., Uski, I., Thesleff, I., Mikkola, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+epithelial+signaling+center+governs+tooth+budding+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Early epithelial signaling center governs tooth budding morphogenesis.</a> The Journal of Cell Biology. 214 (6), 753-767 (2016).</li>
<li>Narhi, K., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Explant+culture+of+embryonic+craniofacial+tissues%3A+analyzing+effects+of+signaling+molecules+on+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Explant culture of embryonic craniofacial tissues: analyzing effects of signaling molecules on gene expression.</a> Methods in Molecular Biology. 666, 253-267 (2010).</li>
<li>Yang, Z., Balic, A., Michon, F., Juuri, E., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+Wnt%2Fbeta-Catenin+signaling+controls+epithelial+stem+cell+homeostasis+in+teeth+by+inhibiting+the+antiapoptotic+effect+of+Fgf10%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal Wnt/beta-Catenin signaling controls epithelial stem cell homeostasis in teeth by inhibiting the antiapoptotic effect of Fgf10.</a> Stem Cells. 33 (5), 1670-1681 (2015).</li>
<li>Binder, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+distinctive+Ptch+receptors+establish+multimodal+hedgehog+signaling+in+the+tooth+epithelial+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Functionally distinctive Ptch receptors establish multimodal hedgehog signaling in the tooth epithelial stem cell niche.</a> Stem Cells. 37 (9), 1238-1248 (2019).</li>
<li>Harada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+putative+stem+cells+in+dental+epithelium+and+their+association+with+Notch+and+FGF+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling.</a> The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).</li>
<li>Seidel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+regulates+the+generation+of+ameloblast+progenitors+in+the+continuously+growing+mouse+incisor%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor.</a> Development. 137 (22), 3753-3761 (2010).</li>
<li>Hadjantonakis, A. K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS+for+the+isolation+of+individual+cells+from+transgenic+mice+harboring+a+fluorescent+protein+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">FACS for the isolation of individual cells from transgenic mice harboring a fluorescent protein reporter.</a> Genesis. 27 (3), 95-98 (2000).</li>
<li>Yu, Y. A., Szalay, A. A., Wang, G., Oberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+molecular+and+cellular+events+with+green+fluorescent+proteins+in+developing+embryos%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Luminescence%22%5BJournal%5D)">Visualization of molecular and cellular events with green fluorescent proteins in developing embryos: a review.</a> Luminescence. 18 (1), 1-18 (2003).</li>
<li>D'Amour, K. A., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+functional+differences+between+multipotent+neural+and+pluripotent+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genetic and functional differences between multipotent neural and pluripotent embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, Suppl 1 11866-11872 (2003).</li>
<li>Chavez, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+dental+epithelial+stem+cells+from+the+adult+mouse+incisor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of dental epithelial stem cells from the adult mouse incisor.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).</li>
<li>Binder, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+strategies+for+expansion+of+tooth+epithelial+stem+cells+and+ameloblast+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Novel strategies for expansion of tooth epithelial stem cells and ameloblast generation.</a> Science Reports. 10 (1), 4963(2020).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

La coltura d'organo in vitro è stata ampiamente utilizzata per studiare il potenziale induttivo e le interazioni epiteliali-mesenchimali che governano la crescita e la morfogenesi degli organi. Il laboratorio Thesleff ha dimostrato come adattare la modifica di Saxén della coltura di organi di tipo Trowell e usarla per studiare lo sviluppo dei denti14. Le condizioni riproducibili e i progressi nei reporter fluorescenti hanno reso questo un metodo utile per monitorare la morfogenesi dei den...

Gli incisivi di topo crescono continuamente grazie alla conservazione permanente delle cellule staminali (SC) che supportano la produzione incessante di componenti dentali. Questi includono SC epiteliali, che generano ameloblasti che producono smalto, e cellule staminali mesenchimali (MSC), che generano odontoblasti che producono dentina, tra le altre cellule1. Le SC epiteliali negli incisivi a crescita continua sono state inizialmente identificatecome cellule 2,3 che mantengono l'etichetta e da allora hanno dimostrato di esprimere un certo numero di geni staminali ben noti, tra cui Sox24. Queste cellule condividono caratteristiche comuni con SC epiteliali in altri organi e risiedono all'interno della nicchia SC chiamata ansa cervicale situata sul lato labiale dell'incisivo. La nicchia è un'entità dinamica composta da cellule e matrice extracellulare che controllano l'attività SC5. Studi di lineage tracing hanno dimostrato che le SC epiteliali Sox2+ possono rigenerare l'intero compartimento epiteliale del dente e che sono cruciali per la formazione dei denti di successione 6,7. Le MSC con potenziale riparativo o rigenerativo della dentina sono in gran parte reclutate dall'esterno dell'organo attraverso i vasi sanguigni e i nervi 8,9,10,11, fornendo quindi un modello adatto per studiare il reclutamento, la migrazione e l'alloggiamento della popolazione MSC.
Studiare le SC in vivo non è sempre fattibile, poiché molte delle manipolazioni genetiche e/o farmacologiche possono influenzare l'omeostasi degli organi e/o avere conseguenze letali. Pertanto, la coltura di organi fornisce uno strumento eccellente per studiare la regolazione delle SC e delle loro nicchie in vitro. Il sistema di coltura degli organi che utilizza una griglia metallica è stato inizialmente sviluppato da Trowell12 per studiare lo sviluppo degli organi ed è stato ulteriormente modificato da Saxen13 per studiare i segnali induttivi nello sviluppo renale. Da allora, questo metodo in vitro di coltura dell'intero organo o parte di esso è stato applicato con successo in diversi campi. Nel campo dello sviluppo dei denti, questo metodo è stato ampiamente utilizzato per studiare le interazioni epiteliali-mesenchimali che governano lo sviluppo dei denti14 e la formazione dei denti di successione15. Il lavoro del laboratorio Thesleff ha dimostrato l'utilità di questo sistema per l'analisi temporale della crescita e della morfogenesi dei denti, per l'analisi dell'effetto di varie molecole e fattori di crescita sulla crescita dei denti e per l'imaging live time-lapse dello sviluppo dei denti16,17. Più recentemente, questo metodo è stato utilizzato per studiare la regolazione degli incisivi SC e la loro nicchia18,19, che è descritta in dettaglio qui.

<table><tbody><tr><td>Siringhe in plastica da</td><td></td><td></td><td></td>1 mL</tr><tr><td>Aghi ipodermici monouso calibro 20/26</td><td>Terumo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>61965-026</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco</td><td>Gibco</td><td>14287</td><td></td></tr><tr><td>Forbici Bonn extra fini</td><td>F.S.T.</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>F-12</td><td>Gibco</td><td>31765-027</td><td></td></tr><tr><td>FBS Sudamericano (CE)</td><td>LifeTechn.</td><td>10270106</td><td>dividere in aliquote, memorizzare a -20&deg; C</td></tr><tr><td>Sterilizzatore a microsfere di vetro, Steri 250 Seconds-Sterilizer</td><td>Simon Keller Ltd</td><td>4AJ-6285884</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX-1 (200 mM L-alanil-L-glutammina dipeptide)</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>Isopore Polycarb.Filters, 0,1 um 25-mm di diametro</td><td>MerckMillipore</td><td>VCTP02500</td><td>Conservare in etanolo al 70% a temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Acido L-Ascobico</td><td>Sigma</td><td>A4544-25g</td><td>diluito 100 mg/ml in MilliQ, filtro strerilizzato e diviso in 20&mu; l aliquotes, negozio al buio, -20&deg; C</td></tr><tr><td>Griglie</td><td></td><td></td> metalliche a basso punto di fusione TopVision R0801 <td></td></tr><tr><td></td> Disponibili in commercio o autocostruite con rete in acciaio inossidabile (resistente alla corrosione, dimensione della maglia 0,7 mm).<td></td><td></td><td> Tagliare un disco di circa 30 mm di diametro e piegare i bordi fino a ottenere un'altezza di 3 mm. Usa i chiodi per fare dei buchi.</td></tr><tr><td>Micro pinza</td><td>Medicon</td><td>07.60.03</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina (10.000U/ml) sol.</td><td>Gibco</td><td>15140-148</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri, Vetro soda-calcico</td><td>DWK Life Sciences</td><td>9170442</td><td></td></tr><tr><td>Petridish 35 mm, con sfiato</td><td>Duran</td><td>237554008</td><td></td></tr><tr><td>Petridish 90 mm, senza sfiato classico</td><td>Thermo Fisher</td><td>101RT/C</td><td></td></tr><tr><td>Forbici</td><td></td><td></td><td></td> piccole</tr></tbody></table>

uso della coltura di organi di tipo trowell per studiare la regolazione delle cellule staminali dentali

Use of Trowell-Type Organ Culture to Study Regulation of Dental Stem Cells

Lo sviluppo, la funzione e la rigenerazione degli organi dipendono dalle cellule staminali, che risiedono all'interno di spazi anatomici discreti chiamati nicchie di cellule staminali. L'incisivo di topo in continua crescita fornisce un modello eccellente per studiare le cellule staminali tessuto-specifiche. Le cellule staminali epiteliali tessuto-specifiche dell'incisivo si trovano all'estremità prossimale del dente in una nicchia chiamata ansa cervicale. Forniscono un afflusso continuo di cellule per controbilanciare la costante abrasione della punta autoaffilante del dente. Presentato qui è un protocollo dettagliato per l'isolamento e la coltura dell'estremità prossimale dell'incisivo del topo che ospita le cellule staminali e la loro nicchia. Si tratta di un protocollo di coltura di organi di tipo Trowell modificato che consente la coltura in vitro di pezzi di tessuto (espianti), nonché le fette di tessuto spesso all'interfaccia liquido / aria su un filtro supportato da una griglia metallica. Il protocollo di coltura degli organi qui descritto consente manipolazioni tissutali non fattibili in vivo e, se combinato con l'uso di uno o più reporter fluorescenti, fornisce una piattaforma per l'identificazione e il monitoraggio di popolazioni cellulari discrete nei tessuti vivi nel tempo, comprese le cellule staminali. Varie molecole regolatorie e composti farmacologici possono essere testati in questo sistema per il loro effetto sulle cellule staminali e le loro nicchie. Questo in definitiva fornisce uno strumento prezioso per studiare la regolazione e il mantenimento delle cellule staminali.

Le SC epiteliali risiedono in una nicchia chiamata ansa cervicale, che si trova all'estremità prossimale dell'incisivo (Figura 3A). Le anse cervicali sono strutture morfologicamente distinte composte da epitelio smaltato interno ed esterno che racchiudono il reticolo stellato, un nucleo di cellule epiteliali disposte liberamente (Figura 3B,C). Ci sono due anse cervicali in ogni incisivo (Figura 3A), ma solo l'ansa c...

Il metodo di coltura degli organi di tipo Trowell è stato utilizzato per svelare complesse reti di segnalazione che governano lo sviluppo dei denti e, più recentemente, per studiare la regolazione coinvolta nelle cellule staminali dell'incisivo di topo in continua crescita. I modelli animali fluorescenti e i metodi di imaging dal vivo facilitano analisi approfondite delle cellule staminali dentali e del loro specifico microambiente di nicchia.

Uso della coltura di organi di tipo Trowell per studiare la regolazione delle cellule staminali dentali

Organ development, function, and regeneration depend on stem cells, which reside within discrete anatomical spaces called stem cell niches. The ...

La coltura di organi di tipo Trowell viene utilizzata per la coltura di espianti di tessuti. Qui, mostriamo come utilizzare questo metodo per studiare le cellule staminali nei denti a crescita continua. Con questa tecnica, possiamo studiare le cellule staminali e il loro comportamento nella nicchia e schermare l'effetto di varie molecole sulla sopravvivenza e il mantenimento delle cellule staminali.Questo metodo può essere applicato per studiare le cellule staminali di altri organi, come la pelle o la ghiandola mammaria. Inizia posizionando griglie metalliche da 30 millimetri con fori da uno a due millimetri di diametro in una capsula di Petri da 35 millimetri. Riempite il contenuto con il supporto fino a quando il supporto non raggiunge la superficie della griglia.Quindi, incubare la piastra a 37 gradi Celsius fino a quando il tessuto è isolato e pronto per la coltura. Dopo aver decapitato il topo, rimuovere la pelle per esporre la mandibola e tagliare i muscoli masseteri per separare la mandibola dalla mascella e dal resto della testa. Una volta isolata la mandibola, rimuovere la lingua e il massimo dei tessuti molli.Dividere la mandibola sulla linea mediana tagliando la sinfisi.

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Biologia dello sviluppo

Il metodo descritto l'isolamento e la caratterizzazione di cellule staminali dentali umane Pulp (hDPSCs)...

Differenziazione Isolamento, caratterizzazione e comparata delle cellule umane Dental Pulp staminali derivate da denti permanenti mediante due diversi metodi

Il mouse in continua crescita incisivo fornisce un modello per lo studio rinnovamento dei tessuti dentali da cellule staminali epiteliali dentali (desc). Un sistema robusto per modo coerente e affidabile l'ottenimento di tali cellule dal incisivo e in espansione in vitro è riportato qui.

Isolamento e Cultura della Dental epiteliali cellule staminali del topo adulto Incisor

Le co-colture rappresentano un metodo prezioso per studiare le interazioni tra nervi e tessuti e organi bersaglio. I sistemi microfluidici consentono la co-coltura di gangli e interi organi o tessuti in via di sviluppo in diversi terreni di coltura, rappresentando così un valido strumento per lo studio in vitro del crosstalk tra neuroni e i loro bersagli.

Analisi di sviluppo di denti Germ innervazione Uso di dispositivi Microfluidic Co-cultura

Questo protocollo descrive l'ingegneria genetica transitoria delle cellule staminali dentali estratti dal follicolo dentale umano. La strategia applicata modifica non virali può diventare una base per il miglioramento dei prodotti terapeutico delle cellule staminali.

Isolamento, caratterizzazione e MicroRNA-basato di modificazione genetica di cellule staminali del follicolo dentale umano

Forniamo i protocolli per la valutazione delle cellule staminali mesenchimali isolate da polpa dentale e interazioni delle cellule di carcinoma della prostata basati su metodi diretti e indiretti di co-coltura. Mezzo di condizione e trans-pozzo membrane sono adatte per analizzare attività paracrina indiretta. Seeding differenzialmente macchiato le cellule insieme è un modello appropriato per interazione diretto cellula-cellula.

Isolamento di cellule staminali mesenchimali da tessuto della polpa e co-coltura con cellule tumorali per studiare le loro interazioni

Descriviamo l'isolamento, la dispersione e la placcatura delle cellule primarie della polpa dentale (DP) con neuroni trigeminali (TG) coltivati in cima ai filtri transwell sovrastanti. Le risposte cellulari delle cellule DP possono essere analizzate con l'immunofluorescenza o l'analisi RNA/proteina. L'immunofluorescenza dei marcatori neuronali con microscopia confocale consente l'analisi delle risposte di escrescenza neurite.

Un metodo di co-cultura per studiare l'escrescenza neurite in risposta ai segnali paracrini dentali

Questo protocollo presenta un metodo per la coltura e la crescita 3D di cellule simili agli ameloblasti in microgravità per mantenere la loro forma allungata e polarizzata e l'espressione proteica specifica dello smalto. Sono inoltre descritte le condizioni di coltura per la coltura dei costrutti di ingegneria parodontale e degli organi polmonari in microgravità.

Propagazione di cellule e organi dentali e respiratori in microgravità

Presentiamo un protocollo per sviluppare colture organoidi epiteliali a partire dal dente umano. Gli organoidi sono robustamente espandibili e ricapitolano le cellule staminali epiteliali del dente, compresa la loro capacità di differenziazione degli ameloblasti. L'esclusivo modello organoide fornisce uno strumento promettente per studiare la biologia dentale umana (cellule staminali) con prospettive per approcci rigenerativi dei denti.

Stabilire gli organoidi dal dente umano come un potente strumento verso la ricerca meccanicistica e la terapia rigenerativa

Questo articolo fornisce una guida passo passo per stabilire una coltura primaria di cellule staminali di polpa dentale utilizzando il metodo della coltura di espiantazione e la caratterizzazione di queste cellule in base alle linee guida ICSCRT. Le cellule isolate da questo protocollo possono essere considerate come cellule staminali mesenchimali per ulteriori applicazioni.

Coltura primaria di cellule staminali della polpa dentale

Questo protocollo enfatizza l'estrazione, la coltura e la conservazione di cellule staminali multipotenti dalla polpa dentale attraverso la digestione enzimatica. Inoltre, dimostra il loro potenziale di differenziarsi in osteoblasti, adipociti e condrociti, evidenziando l'importanza della precisione e della coerenza nel processo.

Isolamento, coltura e caratterizzazione di cellule staminali della polpa dentale da denti decidui e permanenti umani

L'imaging dal vivo ex vivo è una potente tecnica per studiare i processi dinamici dei movimenti e delle interazioni cellulari nei tessuti viventi. Qui, presentiamo un protocollo che implementa la microscopia a due fotoni per tracciare in tempo reale le cellule epiteliali dentali in incisivi di topo adulti interi in coltura.

Utilizzo dell'imaging dal vivo ex vivo per studiare le divisioni e i movimenti cellulari durante il rinnovamento dentale del topo

Scopri la coltura di organi di tipo Trowell per studiare le cellule staminali dentali nel topo. Questo metodo consente l'osservazione in vitro del comportamento cellulare e lo screening di molecole regolatorie.

Uso della coltura di organi di tipo Trowell per studiare la regolazione delle cellule staminali dentali

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