Name: Coltura di megacariociti in idrogel 3D a base di metilcellulosa per migliorare la maturazione cellulare e studiare limpatto della rigidità e del confinamento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Scopri la coltura di megacariociti in idrogel 3D a base di metilcellulosa per studiare l'impatto di rigidità e confinamento sulla maturazione cellulare. Questo metodo migliora la formazione di proplatelet rispetto alla coltura liquida.

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Gli autori desiderano ringraziare Fabien Pertuy e Alicia Aguilar che inizialmente hanno sviluppato questa tecnica in laboratorio, così come Dominique Collin (Institut Charles Sadron - Strasburgo) che ha caratterizzato le proprietà viscoelastiche dell'idrogel di metilcellulosa. Questo lavoro è stato sostenuto da ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) e da una sovvenzione ARN (ANR-18-CE14-0037 PlatForMechanics). Julie Boscher è una destinataria della Fondation pour la Recherche Médicale (numero di sovvenzione FRM FDT202012010422).

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<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+Stiffness+Modulates+Patient-Derived+Glioblastoma+Cell+Fates+in+Three-Dimensional+Hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Matrix Stiffness Modulates Patient-Derived Glioblastoma Cell Fates in Three-Dimensional Hydrogels.</a> Tissue Engineering Part A. , (2020).</li>
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<li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+megakaryocyte+morphology+and+proplatelet+formation+in+mice+with+megakaryocyte-restricted+MYH9+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Abnormal megakaryocyte morphology and proplatelet formation in mice with megakaryocyte-restricted MYH9 inactivation.</a> Blood. 113 (14), 3182-3189 (2009).</li>
<li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proplatelet+formation+deficit+and+megakaryocyte+death+contribute+to+thrombocytopenia+in+Myh9+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Nel decennio precedente, la meccanobiologia ha suscitato sempre più interesse in molte aree della biologia. Ora è comunemente riconosciuto che l'ambiente meccanico che circonda le cellule svolge un ruolo nel loro comportamento, sottolineando l'importanza di studiare come i megacariociti percepiscono e rispondono ai segnali meccanici extracellulari. È difficile misurare con precisione la rigidità del tessuto del midollo osseo in situ11, soprattutto se consideriamo il midollo rosso ematopoi...

Le cellule del corpo sperimentano un complesso microambiente 3D e sono soggette all'interazione tra segnali chimici e meccanofisici tra cui rigidità dal tessuto e confinamento dovuto alle cellule vicine e alla matrice circostante 1,2,3. L'importanza della rigidità e del confinamento per il comportamento cellulare è stata riconosciuta solo negli ultimi decenni. Nel 2006, il lavoro seminale di Engler et al. 4 ha evidenziato l'importanza dell'ambiente meccanico per la differenziazione cellulare. Gli autori hanno dimostrato che la variazione della rigidità del substrato cellulare ha portato all'orientamento delle cellule staminali verso vari lignaggi di differenziazione. Da allora, l'impatto dei segnali meccanici sul destino e sul comportamento cellulare è diventato sempre più riconosciuto e studiato. Nonostante sia uno dei tessuti più molli dell'organismo, il midollo osseo ha un'organizzazione strutturale 3D che è confinata all'interno dell'osso. La rigidità del midollo, sebbene tecnicamente difficile da misurare con precisione, si stima che si trovi tra 15 e 300 Pa 5,6. All'interno dello stroma, le cellule sono strettamente confinate l'una all'altra. Inoltre, la maggior parte di loro sta migrando verso i vasi sinusoidi per entrare nella circolazione sanguigna. Queste condizioni creano ulteriori vincoli meccanici sulle celle adiacenti, che devono adattarsi a queste forze. I segnali meccanici rappresentano un parametro importante le cui conseguenze sulla differenziazione dei megacariociti e sulla formazione di proplatelet sono state recentemente esplorate. Sebbene i megacariociti possano differenziarsi in vitro in coltura liquida tradizionale, non raggiungono il grado di maturazione osservato in vivo, in parte a causa dell'assenza di segnali meccanici dall'ambiente 3D 7. I progenitori in crescita incorporati nell'idrogel portano segnali meccanici 3D che mancano nell'ambiente liquido.
Gli idrogel sono stati ampiamente utilizzati per diversi decenni in campo ematologico, in particolare per far crescere le cellule in saggi di formazione di colonie per quantificare i progenitori ematopoietici. Tuttavia, tali idrogel sono stati raramente utilizzati per esplorare l'impatto biologico dell'ambiente meccanico 3D sulla maturazione e la differenziazione delle cellule ematopoietiche. Negli ultimi anni il nostro laboratorio ha sviluppato un modello di coltura 3D utilizzando un idrogel 8a base di metilcellulosa. Questo gel fisico non reattivo è uno strumento utile per imitare i vincoli fisici dell'ambiente nativo dei megacariociti. È derivato dalla cellulosa mediante sostituzione dei residui di idrossile (-OH) con gruppi metossido (-OCH3). Sia il grado di sostituzione metilica che la concentrazione di metilcellulosa determinano la rigidità dell'idrogel una volta che si è gelificato. Durante la fase di sviluppo di questa tecnica, è stato dimostrato che un modulo di Young nell'intervallo da 30 a 60 Pa è la rigidità ottimale del gel per la crescita dei megacariociti 9.
Il seguente protocollo descrive un metodo per far crescere i progenitori megacariocitici del topo in un idrogel 3D di metilcellulosa. È stato precedentemente dimostrato che rispetto alla coltura liquida standard, questa coltura di idrogel aumenta il grado di poliploidizzazione dei megacariociti, migliora la maturazione e l'organizzazione intracellulare e aumenta la capacità dei megacariociti di estendere i proplati una volta risusciati in un mezzo liquido 9. Questo manoscritto descrive in dettaglio il protocollo per l'isolamento delle cellule lin− del midollo osseo di topo e il loro incorporamento in un idrogel di metilcellulosa per la coltura 3D, nonché la quantificazione della loro capacità di produrre proplatelet e il recupero delle cellule per ulteriori analisi.

<table><tbody><tr><td>Aghi calibro 18</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1001735825</td><td></td></tr><tr><td>aghi calibro 21</td><td>BD Microlance</td><td>301155</td><td></td></tr><tr><td>aghi calibro 23</td><td>Terumo</td><td>AN*2332R1</td><td></td></tr><tr><td>Neeldes calibro 25</td><td>BD Microlance</td><td>300400</td><td></td></tr><tr><td>piastre di coltura a 4 pozzetti</td><td>Thermo Scientific</td><td>144444</td><td></td></tr><tr><td>siringhe da 5 ml</td><td>Terumo</td><td>SS+05S1</td><td></td></tr><tr><td>Cytoclips</td><td>Microm Microtech</td><td>F/CLIPSH</td><td></td></tr><tr><td>Cytofunnels dotati di schede filtranti</td><td>Microm Microtech</td><td>F/JC304</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin centrifuga</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Cytospin 4</td></tr><tr><td>Dakopen</td><td>Dako</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM 1x</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>41 966-029</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-094</td><td>Dulbecco' sterile s soluzione salina tamponata con fosfato</td></tr><tr><td>Magneti EasySep</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Topo Progenitore ematopoietico Kit di isolamento delle cellule</td><td>staminali Stem Cell Technologies</td><td>19856A</td><td>anticorpi biotinilati (CD5,CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119,7... 4) e perline magnetiche rivestite di streptavidina</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Fetale Siero Bovino Healthcare</td><td>Life Science</td><td>SH30071.01</td><td></td></tr><tr><td>Siringhe Luer lock 1 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z551546-100EA</td><td>o 309628 siringhe da BD MEDICAL</td></tr><tr><td>Luer lock siringhe</td><td>connettori Fisher Scientific</td><td>11891120</td><td></td></tr><tr><td>MC 3%</td><td>R& Amp; D systems</td><td>HSC001</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini rivestiti in polilisina</td><td>Thermo Scientific</td><td>J2800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>PSG 100x</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>1037-016</td><td>10.000 unità/mL di penicillina, 10.000 &; g/mL di streptomicina e 29,2 mg/mL di glutammina</td></tr><tr><td>Siero di ratto</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>13551</td><td></td></tr><tr><td>Irudina ricombinante</td><td>Transgögrave; ne</td><td>rHV2-Lys47</td><td></td></tr><tr><td>Trombopoietina umana ricombinante (rhTPO)</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>2822</td><td>10.000 unità/mL</td></tr><tr><td>Provette plastique da 10 mL a fondo tondo</td><td>Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr>Provette <td></td><td></td><td></td>in<td>polistirene da 5 mL a fondo tondo</td></tr></tbody></table>

coltura di megacariociti in idrogel 3d a base di metilcellulosa per migliorare la maturazione cellulare e studiare l'impatto della rigidità e del confinamento

Megakaryocyte Culture in 3D Methylcellulose-Based Hydrogel to Improve Cell Maturation and Study the Impact of Stiffness and Confinement

L'ambiente 3D che porta sia al confinamento che ai vincoli meccanici è sempre più riconosciuto come un importante determinante del comportamento cellulare. La cultura 3D è stata così sviluppata per affrontare meglio la situazione in vivo. I megacariociti si differenziano dalle cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC) nel midollo osseo (BM). Il BM è uno dei tessuti più molli del corpo, confinato all'interno dell'osso. Essendo l'osso scarsamente estensibile alla scala cellulare, i megacariociti sono contemporaneamente sottoposti a una debole rigidità e ad un elevato confinamento. Questo protocollo presenta un metodo per il recupero degli HSPC negativi al lignaggio di topo (Lin-) mediante selezione immunomagnetica e la loro differenziazione in megacariociti maturi in un mezzo 3D composto da metilcellulosa. La metilcellulosa non è reattiva nei confronti dei megacariociti e la sua rigidità può essere regolata a quella del midollo osseo normale o aumentata per imitare un midollo fibrotico patologico. Il processo di recupero dei megacariociti per ulteriori analisi cellulari è anche dettagliato nel protocollo. Sebbene l'estensione del proplatelet sia impedita all'interno dell'ambiente 3D, è descritto di seguito come risospendare i megacariociti in mezzo liquido e quantificare la loro capacità di estendere i proplatelet. I megacariociti cresciuti in idrogel 3D hanno una maggiore capacità di formare proplatelet rispetto a quelli coltivati in un ambiente liquido. Questa coltura 3D permette i) di differenziare i progenitori verso i megacariociti che raggiungono uno stato di maturazione più elevato, ii) di ricapitolare fenotipi che possono essere osservati in vivo ma passano inosservati nelle colture liquide classiche, e iii) di studiare le vie di trasduzione indotte dai segnali meccanici forniti da un ambiente 3D.

I dati ottenuti utilizzando questo protocollo sono stati originariamente pubblicati su Blood nel 20169.
Secondo il protocollo, le cellule sono state seminate in mezzo idrogel liquido o metilcellulosa. Le cellule in mezzo liquido sono tutte sedimentate sul fondo del pozzo, a contatto con la superficie plastica rigida e talvolta con altre cellule. Al contrario, le cellule incorporate nell'idrogel di metilcellulosa sono distribuite in modo omogeneo nel gel e sono isolate d...

È ormai riconosciuto che l'ambiente tridimensionale delle cellule può svolgere un ruolo importante nel loro comportamento, maturazione e/o differenziazione. Questo protocollo descrive un modello di coltura cellulare tridimensionale progettato per studiare l'impatto del contenimento fisico e dei vincoli meccanici sui megacariociti.

Coltura di megacariociti in idrogel 3D a base di metilcellulosa per migliorare la maturazione cellulare e studiare l'impatto della rigidità e del confinamento

The 3D environment leading to both confinement and mechanical constraints is increasingly recognized as an important determinant of cell behavior. 3D ...

Questo protocollo consente la valutazione in vitro dell'impatto del confinamento e della rigidità media a cui i megacariociti nativi sono esposti nel midollo osseo sul loro comportamento e maturazione. Il vantaggio principale di questa tecnica è un modello semplificato che elimina le interazioni cellula-cellula e matrice cellulare e si concentra sugli aspetti meccanici. Le buone pratiche di laboratorio e le condizioni di lavoro sterili devono essere rigorosamente osservate.In effetti, anche una leggera contaminazione dell'idrogel può avere un impatto drammatico sulla differenziazione dei megacariociti. Per ottenere un singolo pozzo di coltura cellulare di idrogel, iniziare scongelando due aliquote di un millilitro del 3% di metilcellulosa a temperatura ambiente, quindi rivestire una siringa di blocco Luer da un millilitro con la metilcellulosa prima estraendo prima un millilitro e poi espellendolo tutto. Successivamente, utilizzando la stessa siringa e ago, prelevare 333 microlitri di metilcellulosa da un'aliquota fresca.Dopo aver rimosso con cura l'ago, utilizzare una pinzaccia sterilizzata per avvitare un connettore Luer lock all'estremità della siringa, quindi collegare una seconda siringa Luer lock da un millilitro non rivestita al connettore. Distribuire equamente la metilcellulosa tra le due siringhe e metterle da parte. Successivamente, sospendare le cellule staminali e progenitrici ematopoietiche negative del lignaggio di topo precedentemente isolate nel terreno di coltura concentrato ad una densità di una volta 10 alle sei cellule per 167 microlitri.Scollegare una delle siringhe dal connettore e pipettare 167 microlitri della sospensione cellulare direttamente nel connettore mentre contemporaneamente si disegna lentamente lo stantuffo della siringa per fare spazio alla sospensione della cella. Dopo aver aggiunto tutta la sospensione della cella nel connettore, tirare ulteriormente lo stantuffo per prelevare la sospensione dal connettore e ricollegare con cura la seconda siringa, facendo attenzione a non perdere alcuna sospensione nella filettatura della vite. Per omogeneizzare il mezzo metilcellulosa con la sospensione cellulare, spostare lentamente gli stantuffi avanti e indietro tra le due siringhe 10 volte, quindi aspirare il volume totale in una siringa e scollegare le due siringhe, lasciando il connettore su quello vuoto.Svuotare il contenuto della siringa in un pozzetti di una piastra a quattro pozzetti e incubare la piastra a 37 gradi sotto il 5% di anidride carbonica. Per analizzare i proplatelet, il terzo giorno di coltura, trasferire con cura tutte le cellule da un pozzo in un tubo da 15 millilitri contenente 10 millilitri di DMEM con l'1% di PSG. Risuscilare le cellule mediante pipettaggio delicato per diluire completamente la metilcellulosa, quindi centrifugare il tubo per cinque minuti a 300 volte G a temperatura ambiente.Dopo aver scartato il surnatante, risusegnare il pellet cellulare in un millilitro di terreno di coltura completo e riseminare le cellule a 500 microlitri per pozzetto di una piastra a quattro pozzetti. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica. Il giorno seguente, utilizzando un microscopio Brightfield con un obiettivo 20X, acquisire casualmente 10 immagini per pozzetto, assicurandosi di non avere troppe cellule nel campo visivo e catturando almeno cinque megacariociti per campo.Usando ImageJ, conta il numero totale di megacariociti e quelli che estendono i proplatelet in ogni immagine per calcolare la proporzione di megacariociti che estendono i proplatelet. Per fissare le cellule per analisi future, aggiungere la soluzione fissativa sopra la metilcellulosa senza interrompere il gel. Dopo aver atteso un tempo adeguato a seconda del fissativo utilizzato, utilizzare una pipetta P1000 per pipettare delicatamente il fissativo e gel fino a quando la metilcellulosa non è stata diluita in modo omogeneo.E usando la stessa punta della pipetta, trasferire tutto il contenuto del pozzo in un tubo da 15 millilitri contenente 10 millilitri di DPBS e omogeneizzare mescolando. Centrifugare la miscela. Scartare il surnatante e risospendare il pellet di megacariociti in un mezzo appropriato per l'analisi desiderata.Entro il terzo giorno di coltura, i megacariociti nel mezzo liquido si sono sedimentati sul fondo del pozzo e sono in contatto con la superficie plastica rigida, così come con altre cellule. Al contrario, le cellule incorporate nell'idrogel di metilcellulosa sono distribuite in modo omogeneo e isolate dalle cellule vicine. Un'analisi del diametro medio dei megacariociti in diverse condizioni di coltura mostra che il 2% di metilcellulosa aumenta leggermente il diametro medio dei megacariociti rispetto alla coltura liquida.Tuttavia, l'aumento della concentrazione di metilcellulosa dello 0,5% compromette la differenziazione dei megacariociti come indicato da un diametro medio più piccolo. Nelle immagini rappresentative di microscopia elettronica a trasmissione, le membrane intracitoplasmatiche nei megacariociti differenziati in vivo all'interno del midollo osseo sembrano essere strettamente opposte ai territori citoplasmatici delineati. In coltura liquida, le membrane hanno per lo più un piccolo aspetto ovale rotondo o vescicole allungate senza delimitazione dei territori citoplasmatici.Al contrario, la coltura del 2% di metilcellulosa si è opposta strettamente alle membrane con territori citoplasmatici delimitanti simili alla struttura in situ. Entro il quarto giorno di coltura, i megacariociti precedentemente coltivati in idrogel mostrano una maggiore formazione di proplatelet rispetto a quelli coltivati in mezzo liquido. La proporzione media di proplati che estendono i megacariociti è di solito intorno al 15-20% con una pre-coltura liquida rispetto al 35-40% con una pre-coltura di idrogel di metilcellulosa.Quando si tenta questa procedura, è importante pipettare i volumi appropriati in modo molto preciso poiché una piccola variazione della concentrazione finale di metilcellulosa può modificare significativamente la rigidità del mezzo. Dopo la maturazione cellulare nell'idrogel, i megacariociti possono essere recuperati per l'analisi della ploidia e dei marcatori cellulari mediante citometria a flusso o fissati per microscopia elettronica o immunocolorazione di proteine di interesse.

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Coltura di megacariociti in idrogel 3D a base di metilcellulosa per migliorare la maturazione cellulare e studiare l'impatto della rigidità e del confinamento

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