Profilazione della modifica H3K4me3 negli impianti utilizzando la scissione sotto target e tagmentazione
22 aprile 2022
La scissione sotto bersagli e tagmentazione (CUT&Tag) è un'efficiente strategia di profilazione epigenomica della cromatina. Questo protocollo presenta una raffinata strategia CUT&Tag per la profilazione delle modificazioni istoniche negli impianti.
L'obiettivo generale dell'esperimento era quello di identificare frammenti di DNA affiliati alle proteine in tutto il genoma, che riflettevano lo stato della cromatina. Per raggiungere questo obiettivo, sono state eseguite tre operazioni speciali. Prima di tutto, i nuclei intatti delle cellule vegetali sono stati isolati.
In secondo luogo, le modifiche alla cromatina sono state riconosciute da un anticorpo specifico in situ. In terzo luogo, l'anticorpo che lega una proteina di fusione A-transposasi, la trasposasi Tn5, scinde la cromatina in situ sotto l'attivazione degli ioni magnesio. I frammenti di DNA e i siti di legame per la modifica della cromatina sono stati quindi integrati con adattatori e preparati per la preparazione del DNA.
Arricchimento della reazione a catena della polimerasi potenziato sequenziamento della generazione. La regolazione dell'epigenomica a livello cromatico, comprese le modificazioni del DNA e degli istoni, i comportamenti dei fattori di trascrizione e gli RNA non codificanti con le loro proteine reclutate, portano al controllo temporale e spaziale dell'espressione genica. La tecnologia CUT&Tag sviluppata da Henikoff Lab è un metodo di tethering enzimatico per la profilazione dell'epigenomica della cromatina ad alta efficienza.
Qui impieghiamo le foglie di cotone come materiali sperimentali e per eseguire il profilo della cromatina utilizzando l'anticorpo dell'istone H3 Lisina-4 Trimetilazione come esempio. Forniamo un protocollo raffinato con video per le prestazioni CUT&Tag negli impianti. Per ogni preparazione del campione utilizzando CUT&Tag, è stato raccolto un grammo di tessuto fogliare di cotone.
La foglia è stata macinata in una polvere fine con azoto liquido e trasferita in un tubo di falco da 50 ml contenente 25 ml di tampone di isolamento nucleare refrigerato A.La soluzione tampone è stata miscelata delicatamente e il tubo è stato incubato sul ghiaccio per cinque minuti con un leggero scuotimento per disperdere il materiale in modo uniforme. È stato quindi filato a 500 forza centrifuga relativa o rcf, a 4 gradi Celsius, per cinque minuti, per formare il pellet cellulare. Il surnatante è stato travasato e il pellet è stato risospeso con 20 ml di tampone di isolamento nucleare refrigerato B, integrato con lo 0,5% di tritone.
Il tubo è stato invertito delicatamente per risospese completamente il pellet. Il lisato cellulare risultante è stato quindi filtrato con una combinazione di due setacci, un setaccio a 500 maglie è stato utilizzato sulla parte superiore per rimuovere i detriti di tessuto più grandi. E un setaccio a 1000 maglie è stato utilizzato sul fondo per raccogliere i nuclei.
La scelta della dimensione delle maglie appropriata dei setacci dipende dalla dimensione dei nuclei delle piante. La carta da filtro sterile è stata utilizzata sul retro del setaccio per assorbire parte del lisato e dei detriti delle piccole cellule. Il lisato contenente i nuclei è stato trasferito in un tubo di centrifuga fresco da 1,5 millilitri e filato a 300 rcf per quattro minuti, a 4 gradi Celsius celsius celsius per raccogliere i nuclei.
Dopo la centrifugazione, è stata utilizzata una punta di pipetta per rimuovere il più possibile il surnatante. Una quantità di 800 microlitri, è stato aggiunto un tampone di lavaggio nucleare. E il tubo è stato invertito delicatamente per risospese i nuclei.
Il tubo è stato girato di nuovo a 300 rcf, per quattro minuti a 4 gradi Celsius. Dopo un totale di tre lavaggi, i nuclei risultanti sono stati combinati in un tubo di centrifuga fresco da 1,5 millilitri e filati a 300 rcf, per quattro minuti a 4 gradi Celsius. Una punta della pipetta è stata utilizzata per rimuovere il più possibile il buffer rimanente.
Il passo successivo è stata l'incubazione dell'anticorpo. Un'aliquota di 50 microlitri di nuclei è stata risospesa in 1 millilitro di tampone anticorpale integrato con EDTA, BSA, cocktail inibitore della proteasi nella digitonina. Un'aliquota di 150 microlitri della sospensione dei nuclei è stata posta in un tubo fresco da 1,5 millilitri per una reazione, due microlitri di anticorpi sono stati aggiunti a ciascun tubo.
In questo test, due repliche biologiche per l'anticorpo anti-istone-H3-Lisina-4-Trimetilazione e i gruppi di controllo immunoglobuline G negativi sono stati istituiti dopo l'aggiunta dell'anticorpo. La soluzione è stata miscelata delicatamente e i tubi sono stati lasciati su uno shaker orizzontale per l'ibridazione durante la notte a quattro gradi Celsius a 12 giri / min. La mattina dopo, i tubi sono stati estratti e i nuclei sono stati lavati usando 800 microlitri di tampone di lavaggio immunopercitante.
Il tubo è stato invertito delicatamente per la miscelazione ed è stato lasciato sullo shaker orizzontale per cinque minuti a temperatura ambiente a 12 giri / min. Dopo il lavaggio, il tubo è stato filato a 300 rcf per quattro minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, il surnatante è stato rimosso utilizzando una punta di pipetta.
Questo è stato ripetuto per un totale di tre lavaggi. Dopo il terzo lavaggio, il tubo è stato filato di un 300 rcf per due minuti a quattro gradi Celsius e una punta della pipetta è stata utilizzata per rimuovere il buffer rimanente il più possibile. Preparare la miscela di trasposasi Tn5 per l'incubazione.
Un microlitro di transposasi è stato aggiunto a ciascuno dei 150 microlitri del tampone di incubazione della transposasi. Si consiglia di preparare prima la miscela di soluzione di transposasi in base al numero di reazioni. E poi aggiungendo un'aliquota di 150 microlitri a ciascun tubo.
La soluzione è stata miscelata delicatamente e lasciata su uno shaker orizzontale a temperatura ambiente a 12 giri / min per due ore. I tubi sono stati miscelati delicatamente ogni 10-15 minuti. Dopo l'incubazione, i nuclei sono stati lavati tre volte utilizzando 800 microlitri di tampone di lavaggio immunopercitante a temperatura ambiente per rimuovere la trasposasi Tn5 non legata.
Dopo il terzo lavaggio, il tubo è stato filato a 300 rcf per due minuti a quattro gradi Celsius e una punta della pipetta è stata utilizzata per rimuovere il buffer rimanente. Per la fase di tagmentazione, 300 microlitri di tampone di tagmentazione sono stati aggiunti al tubo di reazione. La soluzione è stata miscelata bene e incubata a 37 gradi Celsius per un'ora.
Dopo l'incubazione sono stati aggiunti 10 microlitri di 0,5 moli per litro di EDTA a 30 microlitri del 10% di SDS per determinare la reazione. Successivamente sono stati aggiunti 300 microlitri di tampone di estrazione del DNA. È stata eseguita un'estrazione irregolare del DNA.
I frammenti di DNA sono stati disciolti in 25 microlitri di acqua sterile. 24 microlitri sono stati utilizzati per l'amplificazione PCR nella costruzione di librerie NGS. Questa figura mostra la colorazione dei nuclei intatti con DAPI in immagine, al microscopio ottenere una quantità adeguata di nuclei intatti e relativamente puliti è il passo critico per CUT&Tag.
Dopo la PCR, sono stati trasferiti due microlitri e la dimensione del DNA è stata controllata su gel di agarosio all'1,5%. Questa figura mostra che si confrontano con il controllo negativo del gene delle immunoglobuline. La maggior parte dei frammenti di DNA dal campione di trimetilazione di istone H3 lisina 4 dovrebbe variare da 280 a 500 coppie di basi.
I frammenti di DNA possono essere purificati e quindi profilati mediante sequenziamento ad alto rendimento. Questa figura mostra il sequenziamento della generazione dei risultati per l'anticorpo anti-istone H3 Lisina 4 Trimetilazione rispetto ai gruppi di controllo immunoglobuline G negativi. Questa tecnologia genera le librerie di DNA ad alta risoluzione e sfondo eccezionalmente basso utilizzando un piccolo numero di cellule con una procedura semplificata rispetto a ChIP-seq.
CUT&Tag è un metodo nuovo e ancora in corso.
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Panoramica
Questo studio esamina l'applicazione perfezionata del metodo CUT&Tag per il profilo epigenomico nelle piante, concentrandosi sulle modifiche istoniche. L'obiettivo principale è isolare ed analizzare in modo efficace frammenti di DNA associati a proteine all'interno dei genomi vegetali.
Componenti Chiave dello Studio
Area di Ricerca
- Epigenomica della cromatina
- Biologia vegetale
- Modifiche istoniche
Sfondo
- Identificazione di frammenti di DNA associati a proteine per valutare lo stato della cromatina
- Importanza delle modifiche istoniche nella regolazione dell'espressione genica
- Sviluppo della tecnologia CUT&Tag per un efficiente profiling epigenomico
Metodi Utilizzati
- Isolamento di nuclei integri da cellule vegetali (foglie di cotone)
- Utilizzo di anticorpi specifici per le modifiche della cromatina
- Tn5 transposasi per la frammentazione della cromatina in situ
Risultati principali
- Isolamento riuscito di nuclei integri e analisi del profilo della trimetilazione della lisina-4 dell'istone H3
- Miglioramento della preparazione del DNA e del sequenziamento mediante arricchimento PCR
- Confermata efficienza del protocollo CUT&Tag ottimizzato
Conclusioni
- Lo studio dimostra con successo un protocollo CUT&Tag migliorato per il profiling epigenomico nelle piante.
- I risultati forniscono informazioni preziose sui meccanismi molecolari che regolano l'espressione genica.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il profiling delle modifiche istoniche nei sistemi vegetali consente una riduzione del rischio meccanicistica dei bersagli epigenetici nella biotecnologia agricola. Il metodo CUT&Tag fornisce un profiling della cromatina ad alta risoluzione e con basso rumore di fondo a partire da quantità limitate di materiale iniziale, supportando la validazione dei bersagli nei programmi di miglioramento delle colture. Questo approccio aumenta la fiducia predittiva nell'associazione tra stati della cromatina e risultati fenotipici nelle linee di scoperta basate sulle piante.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi dei modelli di modificazione degli istoni associati alla regolazione dell'espressione genica nei sistemi vegetali.
- Valore operativo: Richiede una quantità minima di materiale iniziale (tessuto su scala di grammi) generando contemporaneamente dati sui siti di legame a livello genomique.
- Valore predittivo: Permette la verifica di ipotesi riguardo i meccanismi epigenetici alla base della variabilità fenotipica e delle risposte allo stress.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Produce profili quantitativi di frammenti di DNA (280-500 bp) che consentono l'analisi comparativa degli stati di modificazione.
- Valore operativo: Si integra con i normali flussi di lavoro di costruzione di librerie NGS e di amplificazione PCR.
- Prontezza del saggio: Genera librerie pronte per il sequenziamento con un background eccezionalmente basso rispetto al ChIP-seq.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Facilita la scoperta traslazionale di biomarcatori mappando i segni di cromatina attiva su elementi genomici funzionali.
- Valore operativo: Utilizza l'isolamento di nuclei integri compatibile con diversi tipi di tessuti vegetali.
- Valore predittivo: Permette l'avanzamento mirato al rischio di bersagli epigenetici nei programmi di sviluppo delle colture.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta in cui l'identificazione di bersagli epigenetici precede la validazione funzionale e l'ottimizzazione del composto leader nella bioricerca vegetale.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi riguardo le relazioni tra stati della cromatina e programmi trascrizionali.
- Screening: Fornisce profili epigenomici quantitativi e riproducibili per l'analisi di perturbazioni indotte da composti chimici o modifiche genetiche.
- Analisi dati: Genera mappe ad alta risoluzione dei frammenti di DNA che permettono il confronto statistico dell'arricchimento delle modifiche.
- Ricerca traslazionale: Collega i modelli di modificazione degli istoni agli esiti dell'espressione genica in modelli vegetali rilevanti per le malattie.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma standardizzata di profilazione della cromatina applicabile a diverse specie di colture e caratteri fenotipici.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduzione del rischio meccanicistico dei bersagli epigenetici attraverso la mappatura diretta dei siti di modificazione istonica.
- Valore operativo: Il protocollo standardizzato di isolamento dei nuclei e di ancoraggio degli anticorpi garantisce riproducibilità tra diversi laboratori.
- Valore strategico: Riduce l'incertezza biologica nella selezione dei bersagli per iniziative di miglioramento delle colture.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione basata sui dati dei bersagli epigenetici in funzione dell'intensità della modificazione e della distribuzione genomica.
Considerazioni sull'implementazione
- È richiesta esperienza in biologia cellulare vegetale e tecniche di isolamento dei nuclei.
- È necessario disporre di attrezzature per la centrifugazione, di sistemi di separazione magnetica e di capacità di amplificazione PCR.
- Standardizzazione della validazione degli anticorpi e delle condizioni del buffer di lavaggio tra i diversi gruppi di lavoro.
- Considerazioni sull'adattamento alle diverse dimensioni dei nuclei e alla accessibilità della cromatina in specie vegetali differenti.
- Limitazione pratica: potrebbe essere necessaria un'ottimizzazione del protocollo per piante con elevato contenuto di polisaccaridi o polifenoli.
