Name: Valutazione delle risposte immunitarie respiratorie allHaemophilus influenzae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Scopri i protocolli per valutare le risposte immunitarie all'Haemophilus influenzae nei campi respiratori. Utilizza citometria a flusso e microscopia confocale per analizzare fagocitosi, citochine e attività proteasica nei tessuti polmonari.

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Gli autori desiderano ringraziare lo staff di Immunologia Clinica presso Monash Health per la loro assistenza in questo lavoro.

Questo lavoro è stato approvato dal comitato etico di ricerca umana di Monash Health. Il protocollo segue le linee guida del comitato etico per la ricerca umana.
1. Preparazione antigenica
NOTA: Tre diversi preparati antigenici possono essere utilizzati per valutare la risposta immunitaria a Hi. Questi sono 1) un componente subcellulare (tipicamente dalla parete cellulare batterica); 2) batteri uccisi e inattivati; e 3) batteri vivi. Determinare l'uso di ciascuna preparazione antigenica prima dell'inizio di qualsiasi esperimento.
<ol><li>Componenti subcellulari<ol><li>Ottenere componenti subcellulari da fonti, inclusi preparati commerciali, componenti sviluppati internamente e / o da altri ricercatori. NOTA: Possono essere utilizzati componenti subcellulari di solito dalla parete cellulare batterica e includono proteine della membrana esterna come P6 e lipooligosaccaride (LOS)11,12. Questi componenti subcellulari sono solitamente derivati in centri specializzati. La descrizione di come sono fatti va oltre lo scopo di questo articolo. Si raccomanda il contatto diretto con esperti in questo campo per ottenere questi componenti.</li>
	</ol></li>
	<li>Batteri uccisi/inattivati<ol><li>Ottenere i batteri dal campione appropriato (ad esempio, espettorato o broncoscopia). Confermare il ceppo come H. influenzae utilizzando un laboratorio di microbiologia appropriato. Eseguire la tipizzazione dei campioni di H. influenzae per confermare che non sono tipizzabili (da un laboratorio di microbiologia specializzato).</li>
		<li>Per ottenere un antigene rappresentativo, utilizzare più ceppi NTHi (almeno 5, ciascuno approssimativamente della stessa quantità) per creare un antigene aggregato. Conservare i ceppi a -70 °C in brodo di glicerolo in provette da microcentrifuga. NOTA: In questo esperimento sono stati utilizzati dieci ceppi distinti.</li>
		<li>Scongelare i ceppi (un tubo di microcentrifuga alla volta) su piastre di agar di cioccolato e crescere durante la notte in un'incubatrice a 37 °C con il 5% di CO2. Aggiungere i batteri a 500 μL di soluzione salina tamponata fosfato (PBS) e lavarli due volte (centrifugare a 300 x g per 5 minuti). Utilizzare uno standard MacFarland 10 o uno spettrofotometro13 per aliquote NTHi ad una concentrazione di10 8 mL (utilizzando un contenitore da 5 mL o equivalente).</li>
		<li>Riscaldare inattivare i batteri mettendoli a bagnomaria ad una temperatura di 56 °C per 10 min.</li>
		<li>Sonicare i batteri utilizzando un'impostazione di sonicazione continua a una velocità medio-bassa per 30 s.</li>
		<li>Aliquota del volume appropriato di campioni in provette da microcentrifuga. Per un campione di 108 ml, utilizzare aliquote da 50 μL (cioè 20 campioni per ml), congelarli a -70 °C fino a quando nonè necessario 14.</li>
	</ol></li>
	<li>Batteri vivi<ol><li>In primo luogo, caratterizzare i batteri vivi come menzionato nel passaggio 1.2.1. Utilizzare una varietà ben caratterizzata. Assicurarsi che il ceppo sia conservato anche nel brodo di glicerolo a -70 °C come riserva.</li>
		<li>Coltiva i batteri su supporti arricchiti come piatti di agar al cioccolato o in brodo.<ol><li>Per utilizzare piastre di agar al cioccolato, distribuire i batteri per un minimo di ogni 3-4 giorni con spargitori sterili.</li>
			<li>In alternativa, utilizzare il brodo Brain Heart Infusion (BHI) arricchito con fattori X (esina) e V (β-nicotinammide adenina dinucleotide) per far crescere i batteri. Inoculare NTHi da piastre notturne in 5-10 ml di brodo BHI integrato con emina e β-nicotinammide adenina dinucleotide (entrambi 10 μg/ml) e coltura per una notte a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 . NOTA: Questo ha il vantaggio della riproducibilità, di un numero più elevato di unità formanti colonie (CFU) e di tutti i batteri che si trovano in una fase simile di crescita del tronco (sulle piastre, la vitalità batterica può essere maggiore a seconda della posizione nella coltura)13,15.</li>
		</ol></li>
		<li>Utilizzare una molteplicità di infezioni (MOI) di 100 batteri in una cellula per suscitare una forte risposta immunitaria mantenendo la vitalità cellulare. Utilizzare MacFarland Standard10 o spettrofotometro13 per valutare il numero di batteri.</li>
		<li>Assicurarsi che i supporti utilizzati per i test NTHi dal vivo siano privi di siero umano, poiché ciò ucciderebbe i batteri16. I campioni di siero animale (ad es. siero fetale per vitello) generalmente non causano alcun problema. NOTA: Utilizzare i metodi descritti di seguito per analizzare campioni di tessuto standard come sangue periferico, campioni di broncoscopia (in particolare lavaggio broncoalveolare (BAL)) e tessuto polmonare resecato. Incubare i campioni con l'antigene Hi da 10 minuti a 24 ore o più.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Valutazione della funzione fagocitaria mediante citometria a flusso
NOTA: Questo test richiede cellule in soluzione e viene tipicamente eseguito nel sangue intero o utilizzando il liquido BAL. Questo test è modificato da un protocollo precedentemente pubblicato basato sull'uso di preparato inattivato di Staphylococcus aureus e Pansorbin17. Il sangue intero inattivato e l'H. influenzae fisso sono sostituiti dal Pansorbin17.
<ol><li>Mescolare NTHi ucciso, inattivato (1.2) con ioduro di propidio (PI) a 100 μg/ml in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) in rapporto 1:1 per 30 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare a 450 x g per 5 minuti, quindi lavare in 500 μL di PBS. Girare verso il basso a 450 x g per 5 minuti e risospendere il pellet in 500 μL di PBS.</li>
	<li>Incubare 450 μL di sangue periferico (dalla venepuntura di un soggetto umano) con 50 μL di PI inattivato marcato con H. influenzae per 20 minuti a bagnomaria a 37 °C in un tubo da 5 ml.</li>
	<li>Rimuovere i campioni dal bagnomaria e aggiungere 5 μL di diidrorodamina-1,2,3 (DHR). Vortice per 10 s, quindi rimetterlo a bagnomaria per altri 10 minuti.</li>
	<li>Rimuovere i campioni dal bagnomaria e lisare gli eritrociti (500 μL di volume come elencato sopra al punto 2.2) con una soluzione 10:1 (cioè 5 ml) di cloruro di ammonio allo 0,8% (150 mM NH4Cl, 1 mM NaHCO3 e 0,1 mM EDTA). NOTA: in alternativa, è possibile utilizzare un sistema automatizzato come Q-prep.</li>
	<li>Analizzare i campioni su un citometro a flusso entro un'ora. Analizzare un minimo di 3.000-5.000 celle (da ogni sottoinsieme di interesse) da ciascun campione per ottenere risultati rappresentativi (Figura 1).<ol><li>Per analizzare i campioni per la fagocitosi, determinare la proporzione di cellule che hanno ingerito batteri marcati (misurare la proporzione di cellule con la colorazione fluorescente).</li>
		<li>Quantificare il ROS mediante l'ossidazione del DHR, che si traduce in un segnale fluorescente (lo spostamento della fluorescenza mediana viene confrontato tra campioni basali e stimolati). NOTA: I neutrofili sono più granulari e hanno più dispersione laterale, mentre i macrofagi sono più grandi e hanno più dispersione in avanti.</li>
		<li>Distinguere i neutrofili e i macrofagi morfologicamente l'uno dall'altro per le loro dimensioni (i macrofagi sono più grandi) e granularità (i neutrofili sono più granulari). NOTA: I marcatori specifici per neutrofili e macrofagi non sono generalmente utilizzati, sebbene CD14 possa essere utilizzato per etichettare i monociti del sangue. La citometria a flusso può potenzialmente essere utilizzata per distinguere tra diverse forme funzionali di monociti e macrofagi (ad esempio, sottogruppi M1 e M2)18.</li>
	</ol></li>
	<li>Modificare il test come appropriato (ad esempio, utilizzare NTHi vivo non etichettato per stimolare i fagociti e misurare l'espressione di ROS mediante scissione DHR).<ol><li>Isolare le cellule mononucleate del sangue periferico mediante centrifugazione a gradiente di densità. Sovrapporre il sangue sul polimero designato per la centrifugazione del gradiente di densità e centrifugare a 2300 x g per 30 minuti. Rimuovere lo strato mononucleare usando una pipetta, lavarlo due volte con PBS e risospendere le cellule in PBS a 106 cellule per ml.</li>
		<li>In alternativa, utilizzare i macrofagi BAL.</li>
		<li>Sospendere i monociti/macrofagi ad una concentrazione di 106 cellule /ml nel terreno di coltura (RPMI). Infettarli con NTHi vivo a un MOI di 100:1 per 1 ora come descritto nel passaggio 1.3.</li>
		<li>Aggiungere DHR alla sospensione come descritto al punto 2.3 per 10 minuti. Eseguire l'analisi per ROS utilizzando la citometria a flusso.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Valutazione della funzione dei linfociti nel sangue periferico
<ol><li>Utilizzare preparazioni di sangue intero o cellule mononucleate per saggi di citometria a flusso14.</li>
	<li>Acquisire campioni da ciascun soggetto mediante venepuntura. Raccogliere 4 ml di sangue da una vena periferica in un tubo di eparina di litio e dividere i campioni in aliquote per il controllo e la stimolazione dell'antigene.</li>
	<li>Aggiungere anticorpi costimolatori (anti-CD28 e CD49d, 1 μL/ml) a entrambi i campioni. Aggiungere NTHi al campione di antigene e incubare a 37 °C e 5% di CO2 per 1 ora. Per la preparazione NTHi uccisa, aggiungere 200 μL dell'antigene a 2 mL di sangue. Per NTHi vivo, aggiungere cellule NTHi vive con un MOI di 100:1 ai globuli bianchi (misurato dall'emocitometro).</li>
	<li>Aggiungere l'agente bloccante del Golgi Brefeldin A (10 μL/ml) ai campioni e incubarli per altre 5 ore. NOTA: Il blocco dell'apparato di Golgi impedisce che le citochine vengano esportate al di fuori della cellula.</li>
	<li>Se si utilizza sangue intero, lisare gli eritrociti con cloruro di ammonio allo 0,8% (fase 2.4) per lasciare solo i leucociti in soluzione. Fissare i leucociti usando 500 μL di paraformaldeide all'1%-2% per 1 ora.</li>
	<li>Contare le cellule mediante emocitometro, permeabilizzare 106 cellule con 100 μL di saponina allo 0,1% per 15 minuti e incubare le cellule con anticorpi marcati con fluorescenza. Lavare le cellule e analizzarle utilizzando un citometro a flusso. NOTA: La quantità di anticorpi marcati con fluorescenza sarà specifica per ciascuna citochina. Seguire le istruzioni del produttore. Tipicamente, 106 cellule in 100 μL di soluzione saranno colorate per 1 ora. La maggior parte degli anticorpi ottenuti commercialmente sarà sufficiente per eseguire 25-100 test.</li>
	<li>Determinare la proporzione di cellule che rispondono all'antigene effettuando il gating della popolazione linfocitaria rilevante (le cellule sono attivate da CD45, poi da CD3 e successivamente dall'espressione di CD4 o CD8) come mostrato in Figura 2. Eseguire la colorazione di fondo su cellule non stimolate per tutte le citochine da analizzare. Screening di 100.000 cellule per analizzare ogni citochina sia per le cellule stimolate che per il controllo.</li>
</ol>4. Valutazione della funzione linfocitaria/mediatori infiammatori nel tessuto polmonare
<ol><li>Di solito non è possibile ottenere abbastanza linfociti dalla broncoscopia; Pertanto, utilizzare il tessuto polmonare da campioni di lobectomia. L'ottimizzazione dei campioni di tessuto polmonare richiede uno stretto collegamento con il servizio di anatomia patologica. Assicurarsi che il tessuto abbia un margine di almeno 3 cm dal tumore e sia il tessuto cellulare senza enfisema significativo (come determinato dal patologo).</li>
	<li>Rompere il tessuto polmonare in una sospensione cellulare prima che possa essere utilizzato per i saggi di citometria a flusso. Digerire il tessuto polmonare chimicamente (ad esempio, con collagenasi) o disaggregarlo meccanicamente. NOTA: La disaggregazione meccanica del tessuto può essere preferita in quanto è associata a una migliore colorazione superficiale delle cellule (ad esempio, etichettatura CD3/4)19.<ol><li>Ottenere campioni di lobectomia da un patologo (di solito ottenuti da pazienti sottoposti a trattamento del cancro del polmone). Tagliare circa 20-40 g del campione in 3-5 mm3 sezioni. Posizionarli all'interno di una camera sterile da 50 μL prima di essere frammentati meccanicamente utilizzando un apposito disaggregatore.</li>
		<li>Dopo la disaggregazione tissutale, lisare i globuli rossi con lo 0,8% di NH 4 Cl come indicato nella fase2.4.</li>
		<li>Risospendere le cellule in RPMI sterile (il volume dipenderà dal numero di celle e generalmente è di 10-20 ml), quindi filtrarle attraverso una rete sterile di nylon da 100 μm. Contare il numero di cellule vitali usando il metodo di esclusione del blu tripano.</li>
	</ol></li>
	<li>Saggio dell'infezione NTHi<ol><li>Risospendere le cellule polmonari ad una concentrazione cellulare finale di 4 x 106 cellule/ml per provetta (campioni di controllo e stimolati).</li>
		<li>Utilizzare una sospensione di 4 x 10 6-6 x 106 celle in 1 mL di RPMI per il tubo di controllo (negativo). Utilizzare la stessa quantità per la provetta NTHi (qualsiasi campione aggiuntivo può essere utilizzato come controllo positivo con SEB). Infettare le cellule nel tubo NTHi con un MOI di 100 batteri per cellula. Allentare il tappo di mezza rotazione per consentire il trasferimento del gas nei tubi.</li>
		<li>Posizionare le celle in un rotatore a tubo e incubarle a 37 °C ruotando a 12 giri/min.</li>
		<li>Per prevenire l'esportazione extracellulare di citochine, aggiungere un bloccante del Golgi (Brefeldin A) alle sospensioni cellulari 1 ora dopo la stimolazione ad una concentrazione finale di 10 μg/ml. Riportare le sospensioni cellulari per un'ulteriore incubazione di 16-22 ore a rotazione (fase 4.3.3).</li>
		<li>Lavare la sospensione cellulare con 500 μL di PBS contenente l'1% di albumina sierica bovina (BSA) e lo 0,01% di NaN3. Fissare e permeabilizzare le cellule come descritto rispettivamente al punto 3.5 e al punto 3.6.</li>
		<li>Aggiungere gli anticorpi per la colorazione intracellulare delle citochine (la scelta degli anticorpi deve essere determinata dallo sperimentatore, come elencato nella NOTA al punto 3.6). Colorare la sospensione cellulare per specifici marcatori della superficie cellulare dei linfociti umani (ad esempio, CD45, CD3, ecc.) per 1 ora. Lavare le cellule con PBS, fissarle e permeabilizzarle come descritto nei passaggi 3.5-3.6.</li>
		<li>Incubare le cellule con anticorpi intracellulari anti-colorazione delle citochine (ad esempio, IFN-γ e TNF-α o IL-13 e IL-17A) per 1 ora. NOTA: Si raccomanda di colorare prima i marcatori superficiali, poi intracellulare poiché la fissazione può causare cambiamenti conformazionali nelle proteine di superficie a cui si legano gli anticorpi.</li>
		<li>Lavare le cellule con 500 μL di PBS e risospendere in 100 μL di PBS prima dell'acquisizione dei dati su un citometro a flusso.</li>
	</ol></li>
	<li>Un test bead array può essere utilizzato in combinazione per analizzare il surnatante descritto al punto 3.2 (Eseguire questa operazione senza Brefeldin A). Ciò consente l'analisi di un'ampia varietà di diversi mediatori infiammatori (potenzialmente fino a 40-50 mediatori). Raccogliere il surnatante in aliquote da 100 μL e conservarlo a -70 °C fino al momento dell'analisi. In alternativa, si possono utilizzare saggi chemiluminescenti multiplex20.<ol><li>Utilizzare matrici di perline multiplex per analizzare i campioni scongelati. Utilizzare il surnatante immagazzinato per analizzare la produzione di citochine seguendo le istruzioni del produttore.</li>
		<li>Eseguire l'acquisizione del multiplex bead array su un citometro a flusso. Utilizzare il software pertinente per eseguire l'analisi dei dati a valle. NOTA: Questo test bead array può essere eseguito anche su supernatante da campioni di sangue periferico e/o BAL.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Valutazione della proteolisi polmonare mediante microscopia confocale
NOTA: La microscopia confocale fluorescente è complementare alla citometria a flusso e può essere utilizzata per valutare le risposte infiammatorie della proteasi e dei ROS. Le trappole extracellulari come NET e MET sono composte da cromatina extracellulare (DNA) con altri mediatori infiammatori, in particolare proteasi come l'elastasi neutrofila (NE) e le metalloproteinasi della matrice (MMP). Possono essere valutati nel BAL e nel tessuto polmonare utilizzando la microscopia confocale, e questo è stato descritto in precedenza da Sharma, R. et al.21.
<ol><li>Valutare l'espressione diretta della proteasi nel tessuto polmonare (come descritto al punto 4.2.1) utilizzando la microscopia confocale e la zimografia in situ 15,17.<ol><li>Utilizzare tessuto polmonare non fisso fresco o congelato. Montare le sezioni tagliate ad uno spessore di 4 μm su vetrini superfrost/adesione. Preriscaldare le sezioni in 1x tampone di reazione per 5 minuti.</li>
		<li>Aggiungere substrato di gelatina marcato con fluoresceina (30 μg/mL per sezione) direttamente sui singoli vetrini per misurare la proteolisi tramite l'azione delle metalloproteinasi.</li>
		<li>Posizionare i vetrini in posizione orizzontale e incubare in una camera umidificata al riparo dalla luce a 37 °C per 1 ora.</li>
		<li>Risciacquare le sezioni in 1x buffer di reazione prima di essere montate.</li>
		<li>Come controllo negativo, aggiungere solo il tampone di reazione senza gelatina fluorescente alle sezioni.</li>
		<li>Utilizzare un microscopio confocale per analizzare la lisi del substrato mediante esame. Utilizzare ImageJ per determinare l'area del polmone con evidenza di proteolisi. Per questo, misurare l'area polmonare che ha una colorazione sopra lo sfondo del campione spento. Come altro controllo, utilizzare il tessuto polmonare senza gelatina fluorescente aggiunta15. NOTA: eseguire questa operazione su un minimo di 10 campi visivi ad alta potenza (FOV) per ogni campione.</li>
	</ol></li>
	<li>Misurare l'espressione extracellulare di ROS nel tessuto polmonare mediante immunoreattività per la 3-nitrotirosina (un prodotto tossico dello stress ossidativo)13.</li>
</ol>

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<li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+the+comprehensive+flow+cytometric+analysis+of+immune+cells+in+normal+and+inflamed+murine+non-lymphoid+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues.</a> PLoS One. 11, 0150606(2016).</li>
<li>Duan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+macrophage+subpopulations+characterize+acute+infection+and+chronic+inflammatory+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Distinct macrophage subpopulations characterize acute infection and chronic inflammatory lung disease.</a> Journal of Immunology. 189, 946-955 (2012).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I metodi elencati qui utilizzano tecniche di citometria a flusso basate sulla fluorescenza e microscopia confocale che possono essere utilizzate in combinazione per ottenere informazioni dettagliate sulla risposta polmonare infiammatoria all'Hi.
Stabilire la formulazione antigenica appropriata di Hi da utilizzare è fondamentale ed è consigliabile avere un input specifico da un microbiologo a questo proposito. Live Hi induce una risposta più forte, mentre i preparati Hi uccisi e i componenti Hi...

Haemophilus influenzae (Hi) è un normale batterio commensale presente nella faringe della maggior parte degli adulti sani. Hi può avere una capsula polisaccaridica (tipi A-F, ad esempio, tipo B o HiB) o mancare di una capsula ed essere non tipizzabile (NTHi)1. La colonizzazione della mucosa con questo batterio inizia nella prima infanzia e c'è un turnover di diversi ceppi colonizzatori2. Questo batterio è anche in grado di invadere sia il tratto respiratorio superiore che inferiore; In questo contesto, può indurre l'attivazione della risposta immunitaria e l'infiammazione 3,4. Questa risposta infiammatoria può causare malattie cliniche e contribuire a una varietà di importanti condizioni respiratorie, tra cui sinusite, otite media, bronchite, fibrosi cistica, polmonite e broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO). La maggior parte di queste condizioni sono dovute ai ceppi NTHi2. Questo articolo descriverà i metodi per valutare le risposte immunitarie respiratorie all'Hi utilizzando la citometria a flusso e la microscopia confocale.
I metodi descritti di seguito sono stati adattati da tecniche consolidate che sono state modificate per valutare la risposta infiammatoria all'Hi. La selezione di una forma antigenica appropriata di Hi è una parte fondamentale di questa valutazione. I preparati antigenici vanno dai componenti della parete cellulare ai batteri vivi. Per stabilire e standardizzare i saggi, l'uso di campioni di sangue periferico può essere molto utile inizialmente.
La citometria a flusso consente la misurazione di una varietà di parametri e saggi funzionali da un campione a livello cellulare. Questa tecnica ha il vantaggio che specifiche risposte cellulari (ad esempio, produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) o produzione di citochine intracellulari) possono essere valutate rispetto ad altri metodi più generali come il saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) o ELISspot.
Le trappole extracellulari sono espresse dai neutrofili (NET)5,6,7 e da altre cellule come i macrofagi (MET)8. Sono sempre più riconosciuti come una risposta infiammatoria chiave, in particolare nell'infezione polmonare9. Possono essere valutati mediante microscopia a fluorescenza confocale. Questa tecnica consente l'identificazione definitiva dei NET/MET e distingue la loro espressione da altre forme di morte cellulare6.
Sia la citometria a flusso che la microscopia confocale sono saggi basati sulla fluorescenza. Il loro successo dipende da protocolli di filtraggio ottimali di campioni biologici. Questi metodi richiedono del tempo per essere appresi e richiedono un'adeguata esperienza di supervisione. Gli strumenti coinvolti sono anche costosi sia da acquistare che da gestire. L'impostazione ottimale per il loro utilizzo include le principali università e gli ospedali di riferimento terziari.
I metodi utilizzati in questo protocollo sono trasferibili per lo studio di altri organismi simili coinvolti nelle malattie respiratorie (ad esempio, Moxarella catarrhalis e Streptococcus pneumoniae). NTHi interagisce anche con altri comuni batteri respiratori10.

<table><tbody><tr><td>Cloruro di ammonio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>213330</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6542</td><td></td></tr><tr><td>CD28</td><td>Thermofisher</td><td>16-0289-81</td><td></td></tr><tr><td>CD49d</td><td>Thermofisher</td><td>534048</td><td></td></tr><tr><td>DAPI prolungare l'oro</td><td>Thermofisher</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>DHR123</td><td>Sigma Aldrich</td><td>109244-58-8</td><td></td></tr><tr><td>Rete di nylon sterile</td><td>Filcon Becton Dickinson</td><td>340606</td><td></td></tr><tr><td>Substrato di gelatina, Enzchek</td><td>Sonde molecolari</td><td>E12055</td><td></td></tr><tr><td>Rotatore di provette di miscelazione MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-753</td><td></td></tr><tr><td>Medimachine</td><td>Becton Dickinson Numero di</td><td></td><td>catalogo non disponibile</td></tr><tr><td>Medicons 50 &; m</td><td>Becton Dickinson</td><td>340592</td><td></td></tr><tr><td>Pansorbin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>507858</td><td></td></tr><tr><td>Ioduro di propidio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>8047152</td><td></td></tr><tr><td>diapositive Superfrost</td><td>Thermofisher</td><td>11562203</td><td></td></tr></tbody></table>

valutazione delle risposte immunitarie respiratorie all'haemophilus influenzae

Assessing Respiratory Immune Responses to Haemophilus Influenzae

Haemophilus influenzae (Hi) è un batterio prevalente trovato in una serie di condizioni respiratorie. Una varietà di diversi saggi / tecniche possono essere utilizzati per valutare la risposta immunitaria / infiammatoria respiratoria a questo batterio. La citometria a flusso e la microscopia confocale sono tecnologie basate sulla fluorescenza che consentono la caratterizzazione dettagliata delle risposte biologiche. Possono essere utilizzate diverse forme di antigene Hi, inclusi componenti della parete cellulare, preparati uccisi / inattivati e batteri vivi. Hi è un batterio fastidioso che richiede mezzi arricchiti, ma è generalmente facile da coltivare in ambienti di laboratorio standard. I campioni di tessuto per la stimolazione con Hi possono essere ottenuti da sangue periferico, broncoscopia o polmone resecato, ad esempio, in pazienti sottoposti a intervento chirurgico per il trattamento del cancro del polmone). La funzione dei macrofagi e dei neutrofili può essere valutata in modo completo utilizzando la citometria a flusso con una varietà di parametri misurati, tra cui la fagocitosi, le specie reattive dell'ossigeno e la produzione di citochine intracellulari. La funzione dei linfociti (ad esempio, la funzione delle cellule T e delle cellule NK) può essere valutata specificamente utilizzando la citometria a flusso, principalmente per la produzione di citochine intracellulari. L'infezione da Hi è un potente induttore della produzione di trappole extracellulari, sia da parte dei neutrofili (NET) che dei macrofagi (MET). La microscopia confocale è probabilmente il modo più ottimale per valutare l'espressione di NET e MET, che può anche essere utilizzata per valutare l'attività della proteasi. L'immunità polmonare all'Haemophilus influenzae può essere valutata mediante citometria a flusso e microscopia confocale.

I risultati rappresentativi mostrano come le risposte immunitarie infiammatorie a NTHi possano essere valutate/quantificate mediante citometria a flusso e microscopia confocale. Una parte fondamentale dell'interpretazione dei risultati è il confronto in fluorescenza tra campioni di controllo e stimolati. Di solito sono necessari numerosi esperimenti preliminari per ottimizzare la colorazione dei campioni. Quanti colori diversi possono essere esaminati contemporaneamente dipenderà dal numero di canali disponibili sul cito...

Haemophilus influenzae induce infiammazione delle vie respiratorie. Questo articolo si concentrerà sull'uso della citometria a flusso e della microscopia confocale per definire le risposte immunitarie dei fagociti e dei linfociti in risposta a questo batterio.

Valutazione delle risposte immunitarie respiratorie all'Haemophilus influenzae

Haemophilus influenzae (Hi) is a prevalent bacterium found in a range of respiratory conditions. A variety of different assays/techniques may be used to ...

L'influenza Haemophilus è una delle principali cause di infiammazione in varie malattie polmonari croniche tra cui BPCO e polmonite. Questo protocollo descrive i metodi per valutare l'effetto dell'emofilo sull'infiammazione polmonare. Il vantaggio di questa tecnica è che consente una valutazione completa delle risposte immunitarie innate e adattative.Incubare 450 microlitri di sangue periferico con 50 microlitri di uno ioduro di propidio attivato marcato H influenzae in un tubo da cinque millilitri per 20 minuti a bagnomaria a 37 gradi Celsius. Rimuovere il campione dal bagnomaria, aggiungere cinque microlitri di DHR e vortice per 10 secondi. Quindi rimetterlo a bagnomaria per altri 10 minuti.Dopo aver rimosso il campione dal bagnomaria, lisare gli eritrociti con cinque millilitri di soluzione di cloruro di ammonio allo 0,8% e analizzare i campioni su un citometro a flusso come descritto nel testo. Dividere il campione di sangue periferico in aliquote per il controllo e la stimolazione dell'antigene. Aggiungere anticorpi costimolatori a entrambi i campioni.Quindi aggiungere l'influenza H non tipizzabile al campione di antigene e incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per un'ora. Quindi, aggiungere l'agente bloccante del Golgi brefeldin A ai campioni e incubarli per altre cinque ore. Dopo aver lizzato gli eritrociti come dimostrato in precedenza, fissare i leucociti usando 500 microlitri di para-formaldeide da uno al 2% per un'ora.Contare le cellule utilizzando un emocitometro, quindi permeabilizzare 1 milione di cellule con 100 microlitri di saponina allo 0,1% per 15 minuti. Quindi, incubare le cellule con anticorpi fluorescenti appropriati marcati. Lavare le cellule, quindi analizzarle utilizzando un citometro a flusso.Determinare la proporzione di cellule che rispondono all'antigene ottenendo le popolazioni di linfociti pertinenti. Eseguire la colorazione di fondo su cellule non stimolate per tutte le citochine da analizzare. Tagliare circa 20-40 grammi del campione di lobectomia in sezioni da tre a cinque millimetri cubi.Posizionarli all'interno di una camera sterile da 50 microlitri e frammentare meccanicamente il tessuto utilizzando un apposito disaggregatore. Dopo la disaggregazione tissutale, lisare i globuli rossi come dimostrato e risospendere le cellule in RPMI sterile. Quindi filtrare le cellule attraverso una rete sterile di nylon di 100 micrometri e contare le cellule vitali utilizzando il metodo di esclusione del blu tripano.Per il test dell'infezione, risospendere le cellule polmonari in RPMI a una concentrazione finale di 4 milioni di cellule per millilitro per provetta. Quindi infettare le cellule con un MOI di 100 batteri per cellula. Allentare il tappo di mezza rotazione per consentire il trasferimento del gas nei tubi.Posizionare le celle nel rotatore del tubo e incubarle a 37 gradi Celsius mentre ruotano a 12 RPM. Un'ora dopo la stimolazione, aggiungere grefeldina A per prevenire l'esportazione extracellulare di citochine e incubare le sospensioni cellulari per ulteriori 16-22 ore con rotazione. Il giorno seguente, lavare la sospensione cellulare con 500 microlitri di PBS contenente l'1% di albumina sierica bovina e lo 0,01% di azoturo di sodio.Quindi, colorare la sospensione cellulare per specifici marcatori di superficie cellulare dei linfociti umani per un'ora. Quindi lavare le cellule con PBS e fissarle e permeabilizzarle come dimostrato in precedenza. Quindi, incubare le cellule con anticorpi intracellulari per la colorazione delle citochine per un'ora.Quindi lavare le cellule e risospenderle in 100 microlitri di PBS prima dell'acquisizione dei dati su un citometro a flusso. Misurare la proteolisi tramite l'azione delle metalloproteinasi, aggiungere substrato di gelatina marcato con fluoresceina direttamente sui vetrini della sezione del tessuto polmonare. Posizionare i vetrini orizzontalmente e incubarli in una camera umidificata protetta dalla luce a 37 gradi Celsius per un'ora.Per preparare i controlli negativi, aggiungere un tampone di reazione x senza gelatina fluorescente alle sezioni per ulteriori analisi. Le cellule mononucleate del sangue periferico sono state recintate usando sparsi in avanti e lateralmente per definire la popolazione di fagociti. La popolazione di fagociti è stata ulteriormente definita dall'espressione di CD14 per marcare i monociti.La misurazione dei ROS è stata eseguita tramite ossidazione di DHR 123 per produrre fluorescenza. La fluorescenza mediana del campione stimolato è stata confrontata con il controllo. La produzione di citochine intracellulari da parte dei linfociti è stata misurata utilizzando la citometria a flusso.Le cellule sono state analizzate prima per la loro espressione del marcatore leucocitario CD45 e poi per CD tre e CD quattro, CD otto. Le cellule CD tre, CD quattro positive sono state valutate per la produzione di citochine intracellulari nei campioni di controllo e stimolati. L'attività della proteasi è stata misurata mediante NC due zimografia in sezioni di tessuto polmonare non fissate.La colorazione fluorescente ha indicato la presenza di attività MMP, che è stata anche co-localizzata con l'espressione della cromatina. L'aggiunta di anticorpi ai campioni di tessuto polmonare richiede concentrazione e la colorazione delle cellule richiederà l'ottimizzazione negli esperimenti preliminari. Il surnatante dei campioni di tessuto polmonare può essere ulteriormente analizzato per altri mediatori infiammatori utilizzando tecniche come ELISA e Queste tecniche possono essere utilizzate per valutare l'effetto di potenziali terapie sull'infiammazione polmonare.

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Immunologia e Infezioni

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