Metodo di microiniezione per embrioni di Anopheles gambiae

Questo protocollo è significativo perché fornisce un metodo di microiniezione specifico per un Anopheles gambiae, che è stato storicamente difficile da trasformare utilizzando tecniche di ingegneria genetica comuni. Il vantaggio principale di questa tecnica è che crea in modo affidabile Anopheles gambiae transgenico. Le applicazioni di questa tecnica si estendono verso nuove strategie per l'eliminazione della malaria facilitando la creazione di zanzare adatte alla soppressione della popolazione o alla modifica delle popolazioni di Anopheles gambiae selvatiche.

Questa metodologia può essere adattata facilmente a diverse specie di zanzare. La nostra tecnologia di microiniezione richiede pazienza e pratica. C'è una curva di apprendimento.

Per iniziare, utilizzare un aspiratore per posizionare da 20 a 30 femmine in un tubo conico trasparente da 50 millilitri. Assicurarsi che il tubo sia tagliato aperto ad entrambe le estremità e sia coperto con pellicola dentale in lattice a un'estremità e rete di nylon e carta da filtro all'altra, dove le zanzare deporranno le uova. Posizionare il tubo pieno di zanzare in una piccola capsula di Petri piena di acqua a doppio distillato, quindi posizionare il tubo e il piatto in un'incubatrice a 28 gradi Celsius per 45 minuti.

Rimuovere il tubo dall'incubatore e inserire il tubo in una gabbia vuota. Picchiettare delicatamente il tubo per consentire alle zanzare di volare fuori. Rimuovere il tubo dalla gabbia una volta che tutte le zanzare sono volate fuori.

Quando il tubo è privo di zanzare, svitare l'anello inferiore, rimuovere il nylon e utilizzare una pinza per rimuovere con cura la carta da filtro con le uova dal tubo. Mettere la carta da filtro carica di uova in una capsula di Petri di plastica contenente uno strato di carta da filtro inumidita con acqua. Mettere una membrana su un vetrino pulito e utilizzare una pinza pulita per coprire la membrana con un pezzo di carta da filtro, lasciando scoperto circa un millimetro del filtro a membrana.

Bagnare la carta da filtro con acqua deionizzata, quindi utilizzare il pennello per trasferire delicatamente da 30 a 50 embrioni sul bordo della membrana e allineare le uova verticalmente lungo la membrana. Orientare le uova nella stessa direzione in modo che quando le uova vengono osservate al microscopio a microiniezione, l'estremità posteriore sia in posizione verso il basso e formi un angolo di 15 gradi con l'ago. Rivestire l'intero bordo della membrana con le uova.

Utilizzare una punta del microloader per riempire gli aghi con due microlitri di miscela di DNA. Inserire l'ago nel supporto dell'ago e collegare il tubo automatico della pompa a pressione. Allineare l'ago in modo che faccia un angolo di 15 gradi con il piano della diapositiva.

Aprire la punta dell'ago toccando con attenzione il primo uovo, quindi inserire la punta dell'ago a circa 10 micrometri nel polo posteriore. Un'iniezione di successo porterà a un piccolo movimento del citoplasma all'interno dell'uovo. Utilizzare i controlli dello stadio coassiale del microscopio per passare all'uovo successivo per continuare l'iniezione.

Per assicurarsi che la punta dell'ago rimanga aperta e non sia stata intasata, premere il pulsante Inietta prima di inserire un altro embrione e visualizzare la piccola goccia all'apertura dell'ago. Se l'ago si intasa, premere il pulsante Cancella per liberare l'ago e ripetere il test di visualizzazione delle goccioline. Regolare la pressione secondo necessità se l'apertura della punta dell'ago diventa leggermente più grande per garantire che la dimensione della goccia rimanga piccola.

Iniettare circa 40-50 uova con un ago. Al termine delle iniezioni, sciacquare le uova in un contenitore di vetro rivestito con carta da filtro e riempito con 50 millilitri di acqua deionizzata. Utilizzando questo protocollo, un sistema autonomo guidato da geni è stato inserito nella linea germinale di un ceppo di laboratorio G3 di Anopheles gambiae.

Il sistema è stato progettato per colpire l'ortologo cardinale, o Agcd, sul terzo cromosoma in questa specie. Viene mostrato il plasmide pCO37. Contiene endonucleasi Streptococcus pyogenes Cas9 sotto controllo degli elementi regolatori dell'ortologo del gene nanos.

Inoltre, ha un RNA guida sotto il controllo di un promotore del gene U6 e la cassetta marcatore dominante 3XP3 CFP che esprime la proteina fluorescente ciano. Gli approcci molecolari hanno verificato l'inserimento accurato di circa 10 chili di coppie di basi di DNA, che è stato designato come AgNosCd-1. Ampie analisi di follow-up hanno mostrato che AgNosCd-1 era altamente efficiente durante l'azionamento, creava pochi alleli resistenti e non aveva un carico genetico importante a causa dell'integrazione e dell'espressione del sistema di guida genica.

Il gene drive omozigote contenente zanzare erano mutanti con perdita di funzione, con larve, pupe e adulti appena emersi con un fenotipo degli occhi rossi. Quando si tenta questo protocollo, mantenere a 88 è fondamentale per una buona schiusa per le uova grigio chiaro ed evitare le uova bianche.