Metodo di microiniezione per embrioni di Anopheles gambiae
7 luglio 2021
Le tecniche di microiniezione sono essenziali per introdurre geni esogeni nei genomi delle zanzare. Questo protocollo spiega un metodo utilizzato dal laboratorio James per microiniettare costrutti di DNA in embrioni di Anopheles gambiae per generare zanzare trasformate.
Questo protocollo è significativo perché fornisce un metodo di microiniezione specifico per un Anopheles gambiae, che è stato storicamente difficile da trasformare utilizzando tecniche di ingegneria genetica comuni. Il vantaggio principale di questa tecnica è che crea in modo affidabile Anopheles gambiae transgenico. Le applicazioni di questa tecnica si estendono verso nuove strategie per l'eliminazione della malaria facilitando la creazione di zanzare adatte alla soppressione della popolazione o alla modifica delle popolazioni di Anopheles gambiae selvatiche.
Questa metodologia può essere adattata facilmente a diverse specie di zanzare. La nostra tecnologia di microiniezione richiede pazienza e pratica. C'è una curva di apprendimento.
Per iniziare, utilizzare un aspiratore per posizionare da 20 a 30 femmine in un tubo conico trasparente da 50 millilitri. Assicurarsi che il tubo sia tagliato aperto ad entrambe le estremità e sia coperto con pellicola dentale in lattice a un'estremità e rete di nylon e carta da filtro all'altra, dove le zanzare deporranno le uova. Posizionare il tubo pieno di zanzare in una piccola capsula di Petri piena di acqua a doppio distillato, quindi posizionare il tubo e il piatto in un'incubatrice a 28 gradi Celsius per 45 minuti.
Rimuovere il tubo dall'incubatore e inserire il tubo in una gabbia vuota. Picchiettare delicatamente il tubo per consentire alle zanzare di volare fuori. Rimuovere il tubo dalla gabbia una volta che tutte le zanzare sono volate fuori.
Quando il tubo è privo di zanzare, svitare l'anello inferiore, rimuovere il nylon e utilizzare una pinza per rimuovere con cura la carta da filtro con le uova dal tubo. Mettere la carta da filtro carica di uova in una capsula di Petri di plastica contenente uno strato di carta da filtro inumidita con acqua. Mettere una membrana su un vetrino pulito e utilizzare una pinza pulita per coprire la membrana con un pezzo di carta da filtro, lasciando scoperto circa un millimetro del filtro a membrana.
Bagnare la carta da filtro con acqua deionizzata, quindi utilizzare il pennello per trasferire delicatamente da 30 a 50 embrioni sul bordo della membrana e allineare le uova verticalmente lungo la membrana. Orientare le uova nella stessa direzione in modo che quando le uova vengono osservate al microscopio a microiniezione, l'estremità posteriore sia in posizione verso il basso e formi un angolo di 15 gradi con l'ago. Rivestire l'intero bordo della membrana con le uova.
Utilizzare una punta del microloader per riempire gli aghi con due microlitri di miscela di DNA. Inserire l'ago nel supporto dell'ago e collegare il tubo automatico della pompa a pressione. Allineare l'ago in modo che faccia un angolo di 15 gradi con il piano della diapositiva.
Aprire la punta dell'ago toccando con attenzione il primo uovo, quindi inserire la punta dell'ago a circa 10 micrometri nel polo posteriore. Un'iniezione di successo porterà a un piccolo movimento del citoplasma all'interno dell'uovo. Utilizzare i controlli dello stadio coassiale del microscopio per passare all'uovo successivo per continuare l'iniezione.
Per assicurarsi che la punta dell'ago rimanga aperta e non sia stata intasata, premere il pulsante Inietta prima di inserire un altro embrione e visualizzare la piccola goccia all'apertura dell'ago. Se l'ago si intasa, premere il pulsante Cancella per liberare l'ago e ripetere il test di visualizzazione delle goccioline. Regolare la pressione secondo necessità se l'apertura della punta dell'ago diventa leggermente più grande per garantire che la dimensione della goccia rimanga piccola.
Iniettare circa 40-50 uova con un ago. Al termine delle iniezioni, sciacquare le uova in un contenitore di vetro rivestito con carta da filtro e riempito con 50 millilitri di acqua deionizzata. Utilizzando questo protocollo, un sistema autonomo guidato da geni è stato inserito nella linea germinale di un ceppo di laboratorio G3 di Anopheles gambiae.
Il sistema è stato progettato per colpire l'ortologo cardinale, o Agcd, sul terzo cromosoma in questa specie. Viene mostrato il plasmide pCO37. Contiene endonucleasi Streptococcus pyogenes Cas9 sotto controllo degli elementi regolatori dell'ortologo del gene nanos.
Inoltre, ha un RNA guida sotto il controllo di un promotore del gene U6 e la cassetta marcatore dominante 3XP3 CFP che esprime la proteina fluorescente ciano. Gli approcci molecolari hanno verificato l'inserimento accurato di circa 10 chili di coppie di basi di DNA, che è stato designato come AgNosCd-1. Ampie analisi di follow-up hanno mostrato che AgNosCd-1 era altamente efficiente durante l'azionamento, creava pochi alleli resistenti e non aveva un carico genetico importante a causa dell'integrazione e dell'espressione del sistema di guida genica.
Il gene drive omozigote contenente zanzare erano mutanti con perdita di funzione, con larve, pupe e adulti appena emersi con un fenotipo degli occhi rossi. Quando si tenta questo protocollo, mantenere a 88 è fondamentale per una buona schiusa per le uova grigio chiaro ed evitare le uova bianche.
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Panoramica
Questo protocollo descrive una tecnica di microiniezione per l'introduzione di geni esogeni in embrioni di Anopheles gambiae, facilitando la generazione di zanzare trasformate. Questo metodo affronta le sfide storiche legate alla trasformazione di questa specie mediante approcci convenzionali di ingegneria genetica.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Ingegneria genetica
- Entomologia
- Controllo dei vettori
Sfondo
- Anopheles gambiae è un vettore chiave della malaria.
- La trasformazione di questa specie è stata difficoltosa con le tecniche standard.
- La microiniezione offre un metodo affidabile per creare zanzare transgeniche.
- Questa tecnica può essere adattata ad altre specie di zanzare.
Scopo dello studio
- Sviluppare un protocollo specifico di microiniezione per Anopheles gambiae.
- Permettere la creazione di zanzare geneticamente modificate per il controllo della malaria.
- Fornire un metodo affidabile ai ricercatori del settore.
Metodi Utilizzati
- Microiniezione di costrutti di DNA negli embrioni.
- Utilizzo di tecniche specifiche sviluppate dal laboratorio di James.
- Adattamento del metodo a diverse specie di zanzare.
- Formazione ed esercitazione per padroneggiare la tecnica.
Risultati principali
- Generazione con successo di Anopheles gambiae transgenici.
- Dimostrata affidabilità del metodo di microiniezione.
- Potenziali applicazioni nelle strategie di eliminazione della malaria.
- Modificazione facilitata delle popolazioni di zanzare selvatiche.
Conclusioni
- La tecnica di microiniezione è efficace per l'introduzione di geni.
- Questo metodo può contribuire in modo significativo alla ricerca sul controllo dei vettori.
- Studi futuri possono esplorarne l'applicazione in altre specie.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'iniezione microscopica di embrioni di Anopheles gambiae consente una trasformazione germinale stabile, affrontando un collo di bottiglia di lunga data nella ricerca sul controllo dei vettori. Questa tecnica supporta lo sviluppo di sistemi di gene drive per l'eliminazione della malaria facilitando modifiche genetiche ereditabili in un vettore principale della malattia. Un'iniezione affidabile degli embrioni migliora la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi e nella modellizzazione preclinica di strategie interrompenti la trasmissione.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi funzionale di geni coinvolti nell'alimentazione ematofaga, nell'immunità e nell'olfatto mediante espressione stabile di transgeni.
- Valore operativo: Fornisce un metodo riproducibile per generare linee transgeniche finalizzate alla riduzione del rischio associato a bersagli nei programmi contro le malattie trasmesse da vettori.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Crea ceppi standardizzati di zanzare transgeniche per lo screening fenotipico di composti antiparassitari o in grado di bloccare la trasmissione.
- Valore operativo: Favorisce la prontezza del saggio fornendo contesti genetici costanti per la valutazione ad alto rendimento dell'efficacia del gene drive.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Consente la valutazione delle prestazioni del gene drive, della formazione di alleli di resistenza e del carico genetico in condizioni di laboratorio controllate prima di passare ai test sul campo.
- Valore operativo: Facilita la validazione preclinica di tratti che riducono la trasmissione in ceppi di Anopheles gambiae in condizioni standardizzate di insettaio.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo di microiniezione si inserisce nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica, consentendo la validazione del bersaglio, la generazione di ceppi e la valutazione funzionale di interventi genetici per il controllo della malaria.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sulla funzione genica nella trasmissione del patogeno e nei comportamenti di ricerca dell'ospite mediante trasformazione germinale.
- Screening: Genera linee transgeniche isogeniche per la valutazione riproducibile di componenti del gene drive e geni effettori.
- Analisi: Permette la misurazione quantitativa dell'espressione del transgene, dell'efficienza del gene drive e degli esiti fenotipici come il colore degli occhi o la fertilità.
- Ricerca traslazionale: Collega costrutti molecolari a fenotipi organizzativi in un sistema rilevante per la malattia, al fine di prendere decisioni di avanzamento proporzionate al rischio.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una tecnologia di piattaforma adattabile tra diverse specie di zanzare, per sostenere in modo continuativo il percorso di controllo dei vettori.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi grazie a letture ereditabili dell'espressione genica e dei fenotipi.
- Valore operativo: Protocolli standardizzati per la manipolazione e l'iniezione degli embrioni migliorano la riproducibilità tra laboratori.
- Valore strategico: Riduce il rischio biologico nei programmi avanzati di controllo dei vettori consentendo una valutazione precoce delle proprietà del gene drive.
- Impatto sul portafoglio: Orienta le decisioni di proseguimento o interruzione in base all'efficienza del drive, ai profili di resistenza e ai costi di adattamento nelle linee transgeniche.
Considerazioni sull'implementazione
- È richiesta competenza in embriologia dei zanzare e nell'uso di strumentazione per microiniezione per una manipolazione efficace degli embrioni.
- È essenziale avere accesso a sistemi di microiniezione, pompe a pressione e configurazioni microscopiche con controlli dello stadio coassiali.
- La standardizzazione dell'allineamento degli embrioni, dell'angolo dell'ago e del volume di iniezione tra i diversi gruppi di lavoro garantisce risultati trasgenici costanti.
- L'adattamento ad altre specie di zanzare potrebbe richiedere un'ottimizzazione dei tempi di incubazione, dello stadio embrionale e della preparazione della membrana.
- Il successo dipende dalla competenza dell'operatore, a causa della curva di apprendimento tecnico associata alla manipolazione delicata degli embrioni.
