Name: Dissezione di fibre muscolari scheletriche singole per analisi immunofluorescenti e morfometriche di giunzioni neuromuscolari a montaggio intero (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Impara a dissezionare fibre muscolari scheletriche singole di ratto per analisi immunofluorescenti e morfometriche di giunzioni neuromuscolari a montaggio intero. Questo metodo consente la visualizzazione ad alta risoluzione dei componenti pre- e postsinaptici.

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Molte grazie al CSIC e al PEDECIBA per il sostegno finanziario dato a questo lavoro; a Natalia Rosano per le sue correzioni manoscritte; a Marcelo Casacuberta che realizza il video e a Nicolás Bolatto per aver prestato la sua voce per questo.

Tutte le procedure animali sono state eseguite secondo le linee guida della legge nazionale n. 18611 per la cura degli animali utilizzati a fini sperimentali. Il protocollo è stato approvato dal Comitato Etico Istituzionale (CEUA IIBCE, Protocollo Numero 004/09/2015).
1. Dissezione muscolare (Giorno 1)
NOTA: Prima di iniziare, fare 40 mL di paraformaldeide (PFA) allo 0,5%, pH 7,4 nella soluzione salina fosfato di Dulbecco (DPBS). Opzionalmente, fare 20 mL del 4% di PFA. Preparare aliquote da 5 mL e congelare a -20 °C. Il giorno della dissezione, scongelare un'aliquota del 4% e aggiungere 35 mL di DPBS per ottenere 40 mL dello 0,5% di PFA.
<ol><li>
Isolamento dell'EDL (muscolo a contrazione rapida)
	<ol>
<li>Eutanasia di un topo. Posizionare l'animale con l'addome rivolto verso l'alto. Effettuare un'incisione iniziale utilizzando una lama chirurgica tra le dita dei piedi verso l'arto posteriore. NOTA: In questo caso, è stata somministrata un'iniezione intraperitoneale di 90:10 mg/Kg di chetamina:xirazina per eutanasiare il ratto, ma sono consentite anche altre opzioni di anestesia.</li>
		<li>Staccare la pelle, tirandolo verso l'alto fino a quando il ginocchio del ratto non è esposto.</li>
		<li>Per trovare l'EDL, seguire i tendini del piede fino al legamento anulare. Questo legamento circonda due tendini. Tagliare il legamento tra i due tendini con forbici uniband (o simili). Identificare il tendine EDL sollevando entrambi e scegliere quello che fa muovere le dita dei piedi verso l'alto.</li>
		<li>Tagliare il tendine con forbici uniband. Quindi, mentre si tiene il tendine con pinzette biologiche fini, iniziare a separare lentamente il muscolo EDL dal tibialis anteriore, dal peroneus brevis e dal peroneus longus40 (vedi figura 1A). NOTA: Assicurarsi che il muscolo sia separato senza alcun danno. Fallo tagliando il resto dei muscoli laterale per aprire un percorso tra di loro (l'EDL non ha una posizione superficiale) mentre si tiene e si solleva il muscolo EDL.</li>
		<li>Per isolare completamente il muscolo, tagliare il tendine attaccato al ginocchio del topo con forbici uniband.</li>
		<li>Immergere il muscolo sezionato in 5 mL dello 0,5% di PFA e lasciare per 24 ore a 4 °C. Facoltativamente, graffettare il muscolo in un pezzo di cartone e girarlo con il muscolo rivolto verso il basso. Quindi immergerlo completamente in 8 mL della soluzione fissante. Questo passaggio aiuta a mantenere il muscolo allungato durante il processo di fissazione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Isolamento del soleo (muscolo a contrazione lenta)
	<ol>
<li>Capovolgere l'animale (l'addome è ora rivolto verso il basso). Attraverso la pelle, tagliare il tendine calcaneale usando una lama chirurgica.</li>
		<li>Con l'aiuto delle pinzette biologiche e delle forbici uniband, separare il muscolo gastrocnemio dalle ossa, creando un "coperchio muscolare". Il soleo sarà sul lato interno del coperchio muscolare. Può essere identificato perché è di colore rosso e ha una morfologia piatta.</li>
		<li>Con un paio di pinzette biologiche, raggiungere e sollevare il tendine soleo che si trova sopra il gastrocnemio (vedi figura 1B).</li>
		<li>Tagliare il tendine con forbici uniband. Sollevare l'intero muscolo mentre si tagliano alcuni dei punti di attacco deboli (cioè gli elementi neurovascolari). Infine, per liberare completamente il muscolo soleo, tagliare il fasccle soleus che forma il tendine calcaneale con forbici uniband.</li>
		<li>Ripetere il passaggio 1.1.6 per fissare il muscolo soleo sezionato.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparazione della fibra presa in giro (Giorno 2)
<ol><li>Dopo 24 ore di fissazione, sciacquare i muscoli con 6 mL di soluzione DPBS 3x per 10 minuti ciascuno prima di isolare le fibre muscolari.</li>
	<li>Per isolare le fibre, mettere un muscolo su uno scivolo al microscopio. Usando uno stereomicroscopio, tenere delicatamente uno dei tendini con una coppia di pinzette biologiche. Quindi, con le altre pinzette biologiche, inizia a pizzicare lentamente il tendine per separare le fibre muscolari. Dopo di che tirare lentamente il tessuto pizzicato verso l'alto verso il tendine muscolare opposto. Sarà necessario ripetere questa azione più volte fino a ottenere più piccoli fasci isolati.</li>
	<li>Posizionarli con cura su una diapositiva pretrattata (silanizzata). È necessario mantenere tutte le fibre in ordine in modo che non si sovrappongano. A questo punto, asciugare all'aria le fibre per 24 ore.</li>
</ol>3. Immunofluorescenza
<ol><li>
Incubazione di anticorpi primari (Giorno 3) NOTA: Tutti i passaggi sono stati eseguiti a temperatura ambiente, tranne se altrimenti indicato. Il modo più efficiente per rimuovere le diverse soluzioni senza staccare le fibre dallo scivolo è utilizzare una siringa per insulina.<ol>
<li>Per iniziare il processo di immunostaining, circondare le fibre muscolari isolate essiccate con una pap pen per creare una barriera impermeabile.</li>
		<li>Per idratare le fibre muscolari, aggiungere 200 μL di acqua distillata per 5 minuti, quindi cambiare l'acqua a 200 μL di DPBS per la successiva incubazione di 5 minuti. A questo punto, avviare l'etichettatura dell'immunofluorescenza.</li>
		<li>Incubare le fibre con 300 μL di un tampone di blocco (BB) contenente glicina 50 mM, 1% BSA e 1% Tritone X-100 per 30 min.</li>
		<li>Sostituire BB con l'anticorpo primario a una concentrazione suggerita dai produttori. Utilizzare il BB per diluire l'anticorpo. Questo esperimento ha utilizzato 400 μL di SMI 32 o SMI 31 che riconoscevano il neurofilamento H non fosforilato (Nf) o fosforilato (Phos-Nf) a 1/800 diluizione per rilevare la componente presnaptica NMJ. NOTA: Quando decidi di riconoscere l'intero elemento presinattico invece di valutare la fosforilazione del neurofilamento, scegli gli anticorpi contro sinapsina, sinaptofisina o SV2a che sono stati precedentemente utilizzati con successo.</li>
		<li>Incubare le fibre con la diluizione dell'anticorpo primario a 4 °C durante la notte (facoltativamente, l'incubazione può essere eseguita a 37 °C per 1 h). In entrambi i casi, sarà importante eseguire l'incubazione utilizzando una camera umida.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Immunofluorescenza: Incubazione anticorpale secondaria (Giorno 4)
	<ol>
<li>Rimuovere l'anticorpo primario e risciacquare le fibre 3 volte per 10 minuti ciascuna con 500 μL di DPBS e l'ultima volta con BB.</li>
		<li>Rimuovere quest'ultimo lavaggio e aggiungere l'anticorpo secondario etichettato fluorescentmente diluito in BB. Per questo esperimento, sono stati utilizzati 500 μL di capra anti-topo Alexa Fluor 488 a 1/1000 diluizione in BB. Per visualizzare l'elemento postssinattico dei NMJ, 1:300 α-Bungarotoxin (Btx) biotina-XX coniugato è stato aggiunto alla diluizione anticorpale secondaria. NOTA: L'aggiunta di Btx-biotina XX consente migliori immagini segnale-rumore una volta rilevate con streptavidina che amplifica il segnale. Inoltre, la coniugazione di streptavidina a diversi fluorofori ha aumentato le combinazioni di colori nei test di co-etichettatura. In alternativa, Btx con etichetta fluorescente consente di ottenere immagini di qualità simile.</li>
		<li>Incubare l'anticorpo secondario e il Btx per 2 ore a temperatura ambiente o 1 h a 37 °C protetto dalla luce.</li>
		<li>Rimuovere l'anticorpo secondario e il Btx. Lavare 3 volte per 10 minuti ciascuno con 500 μL di DPBS e l'ultimo risciacquo con BB.</li>
		<li>Incubare con 500 μL di Streptavidin Alexa Fluor 555 a 1/1000 diluizione con BB per 1 h a temperatura ambiente. A questo punto, se lo si desidera, aggiungere una sonda per controsostenere i nuclei, come il diaminofenillindolo ad una concentrazione finale di 1 μg/mL.</li>
		<li>Rimuovere la soluzione di incubazione e lavare le fibre 3 volte per 10 minuti ciascuna con 500 μL di DPBS. Quindi, montare le fibre.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Montante
	<ol>
<li>Posizionare 4 punti di smalto trasparente sul vetrino del microscopio come se fossero i vertici di un quadrato. Lasciarli asciugare 1-2 minuti. Questi saranno i punti in cui i coprispalli riposeranno, aiutando ad evitare la frantumazione dei tessuti.</li>
		<li>Rimuovere l'ultimo lavaggio DPBS e aggiungere abbastanza supporti di montaggio (~ 200 μL) per coprire le fibre; evitare l'asciugatura. NOTA: Per preparare 10 mL del mix di supporti di montaggio, utilizzare Tris-HCl 1,5 M pH 8,8: glicerolo in un 4:1 (v:v).</li>
		<li>Utilizzare una punta di pipetta da 200 μL per distribuire con cura i supporti di montaggio sulle fibre per garantire una completa immersione di tutti loro. Prima di posizionare il vetro di copertura, rimuovere le bolle d'aria.</li>
		<li>Posizionare il coverslip sui campioni cercando di prevenire la generazione di bolle d'aria. Questo movimento può essere fatto con l'aiuto di forcep.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Microscopia e analisi morfometrica
<ol><li>Immagini i preparati in fibra presa in giro usando la microscopia confocale laser.</li>
	<li>Prendere una serie di sezioni ottiche (pile Z da 30 μm) attraverso l'intera sinapsi usando un intervallo di un micrometro. Per impostare lo stack, utilizzare il segnale Btx. Immagine di almeno 15-20 NMJ per ogni condizione muscolare con una risoluzione px x 2048 px 2048 2048. Questo metodo è stato scelto per ottenere immagini con qualità ottica e risoluzione sufficienti per l'analisi morfometrica.</li>
	<li>Per eseguire le misurazioni, utilizzare le immagini di proiezione delle pile con qualsiasi software di analisi. NOTA: Sebbene l'analisi morfometrica spiegata sia stata eseguita manualmente, esistono due strumenti basati su Image J recentemente sviluppati per studiare molti aspetti diversi della morfologia NMJ pre e postinaptica33,34.</li>
	<li>Per ottenere i valori dell'area NMJ totale, selezionate il bordo esterno (contorno esterno dell'area macchiata, vedere figura 2) della piastra finale utilizzando lo strumento lazo magnetico di Photoshop e determinate il numero di pixel selezionati nella finestra Istogramma. Quindi, le aree pixel possono essere convertite in micrometri quadrati utilizzando la scala specificata dal software confocale.</li>
	<li>Con lo stesso strumento lazo, selezionare il bordo interno (contorni dell'area macchiata all'interno della piastra finale, vedere figura 2) e determinare l'area non macchiata nell'intera struttura (o nell'area vuota) come descritto sopra (passaggio 4.4.). I valori dell'area postsinaptica verranno ottenuti dopo aver sottratto l'area totale dall'area vuota di ogni NMJ.</li>
	<li>Ottenere l'Area Presnaptica, che è definita come l'area con immunofluorescenza anti-neurofilamento, in modo simile all'area NMJ totale. NOTA: Tutti questi parametri sono stati utilizzati per determinare l'indice di densità post-sinaptica (area postsinaptica/area totale) e la copertura NMJ (area presnaptica/area postsinaptica). Un indice di densità postsinaptica più elevato implica una banda terminale più densa o più compatta, mentre una copertura NMJ più piccola riflette un'interazione molto più povera tra terminale nervoso e piastra terminale (entrambe compatibili con un processo di denervazione). Nel caso qui mostrato, poiché sono state rilevate forme fosforilate e non fosforilate di neurofilamenti a livello terminale nervoso, sono stati calcolati il rapporto segnale presnaptico fosforilato/non fosforilato e il rapporto di copertura fosforilato/non fosforilato.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In questo articolo, presentiamo un protocollo dettagliato per la dissezione di due muscoli scheletrici del ratto (uno a contrazione lenta e l'altro a contrazione rapida), isolamento muscolare delle fibre e rilevamento dell'immunofluorescenza dei marcatori pre e postinaptici per valutare quantitativamente i cambiamenti nmj e i processi di assemblaggio / smontaggio. Questo tipo di protocollo può essere utile nei modelli diroditori 41,42 per valutare NMJ durante i p...

La giunzione neuromuscolare del mammifero (NMJ) è una grande sinapsi tripartita colinergica composta dalla terminazione nervosa del motoneurone, dalla membrana postssinaptica sulla fibra muscolare scheletrica e dalle cellule terminali di Schwann1,2,3. Questa sinapsi presenta un'elevata plasticità morfologica e funzionale4,5,6,7,8,anche durante l'età adulta quando gli MN possono subire modifiche strutturali dinamiche. Ad esempio, alcuni ricercatori hanno dimostrato che le terminazioni nervose motorie cambiano continuamente la loro forma alla scala micrometrica9. È stato anche riferito che la morfologia della NMJ risponde a requisiti funzionali, uso alterato, invecchiamento, esercizio fisico o variazioni nell'attivitàlocomotoria 4,10,11,12,13,14,15. Pertanto, l'allenamento e la mancanza di utilizzo rappresentano uno stimolo essenziale per modificare alcune caratteristiche della NMJ, come le sue dimensioni, lunghezza, dispersione di vescicole sinaptiche e recettori, così come la ramificazione terminalenervosa 14,16,17,18,19,20.
Inoltre, è stato dimostrato che qualsiasi cambiamento strutturale o degenerazione di questa giunzione vitale potrebbe causare la morte delle cellule dei motoneuroni e l'atrofiamuscolare 21. Si pensa anche che la comunicazione alterata tra nervi e muscoli potrebbe essere responsabile dei fisiologici cambiamenti di NMJ legati all'età e possibilmente della sua distruzione in stati patologici. Lo smantellamento della giunzione neuromuscolare gioca un ruolo cruciale nell'insorgenza della sclerosi laterale amiotrofica (SLA), una malattia neurodegenerativa che costituisce uno dei migliori esempi di interazione muscolo-nervosa compromessa3. Nonostante i numerosi studi condotti sulla disfunzione dei motoneuroni, si discute ancora se il deterioramento osservato nella SLA si verifichi a causa del danno diretto al motoneurone e poi si estenda alle proiezioni cortico-spinali22; o se deve essere considerato come un'assonopatia distale in cui la degenerazione inizia nelle terminazioni nervose e progredisce verso il somasdel motoneurone 23,24. Data la complessità della patologia della SLA, è logico considerare che si verifica un mix di processi indipendenti. Poiché nmj è il protagonista dell'interazione fisiopatologica tra muscolo e nervo, la sua destabilizzazione rappresenta un punto cardne dell'origine della malattia che è rilevante per essere analizzata.
Il sistema neuromuscolare dei mammiferi è funzionalmente organizzato in unità motorie discrete, costituite da un motoneurone e dalle fibre muscolari che sono esclusivamente innervate dal suo terminale nervoso. Ogni unità motore ha fibre con proprietà strutturali e funzionali simili o identiche25. Il reclutamento selettivo dei motoneuroni consente di ottimizzare la risposta muscolare alle esigenze funzionali. Ora è chiaro che i muscoli scheletrici dei mammiferi sono composti da quattro diversi tipi di fibre. Alcuni muscoli sono nominati in base alle caratteristiche del loro tipo di fibra più abbondante. Ad esempio, il soleo (un muscolo posteriore dell'arto posteriore coinvolto nel mantenimento della postura del corpo) porta la maggior parte delle unità a contrazione lenta (tipo 1) ed è riconosciuto come un muscolo lento. Invece, l'estensore digitorum longus (EDL) è essenzialmente composto da unità con proprietà simili a contrazione rapida (fibre di tipo 2) ed è noto come muscolo veloce specializzato per i movimenti fasici necessari per la locomozione. In altre parole, sebbene i muscoli adulti siano di natura plastica a causa delle influenze ormonali e neurali, la sua composizione in fibra determina la capacità di svolgere diverse attività, come si vede nel soleus che sperimenta un'attività continua a bassa intensità e L'EDL che mostra una singola contrazione più rapida. Altre caratteristiche che sono variabili tra i diversi tipi di fibre muscolari sono correlate alla loro struttura (contenuto mitocondriale, estensione del reticolo sarcoplasmatico, spessore della linea Z), contenuto di miosina ATPasi e composizione della catena pesante della miosina26,27,28,29.
Per i NMJ roditori, ci sono differenze significative tra imuscoli 28,29. Le analisi morfometriche eseguite in soleus ed EDL dai ratti hanno rivelato una correlazione positiva tra l'area sinaptica e il diametro delle fibre (cioè, l'area sinaptica nelle fibre lente soleus è maggiore che nelle fibre veloci EDL) ma il rapporto tra l'area NMJ e la dimensione della fibra è simile in entrambi imuscoli 30,31. Inoltre, in relazione ai terminali nervosi, le aree assolute della piastra terminale nelle fibre di tipo 1 erano inferiori rispetto alle fibre di tipo 2, mentre la normalizzazione per diametro delle fibre ha reso le aree dei terminali nervosi nelle fibre di tipo 1 lepiù grandi 32.
Tuttavia, pochissimi studi si concentrano sull'analisi morfometrica per mostrare l'evidenza dei cambiamenti in alcuni dei componentiNMJ 33,34. Pertanto, a causa della rilevanza della NMJ nella funzione dell'organismo, la cui morfologia e fisiologia sono alterate in varie patologie, è importante ottimizzare i protocolli di dissezione di diversi tipi di muscoli con qualità sufficiente a consentire la visualizzazione dell'intera struttura NMJ. È inoltre necessario valutare il verificarsi di cambiamenti pre o postinaptici in diverse situazioni o condizioni sperimentali come l'invecchiamento ol'esercizio fisico 35,36,37,38. Inoltre, può essere utile evidenzare alterazioni più sottili nei componenti NMJ come la fosforilazione del neurofilamento alterato nelle terminazioni nervose terminali come riportato nella SLA39.

<table><tbody><tr><td>Stereomicroscopio con illuminazione a luce fredda</td><td>Nikon</td><td>SMZ-10A</td><td></td></tr><tr><td>Piattaforma oscillante</td><td>Biometra (WT 16)</td><td>042-500</td><td></td></tr><tr><td>Vetri di copertura (24 x 32 mm)</td><td>Vetrini per microscopio Deltalab</td><td>D102432</td><td></td></tr><tr><td>Premium (Plus)</td><td>PORLAB</td><td>PC-201-16</td><td></td></tr><tr><td>Pinzetta</td><td>F.S.T</td><td>11253-20</td><td></td></tr><tr><td>Uniband LA-4C Forbici 125mm</td><td>E.M.S</td><td>77910-26</td><td></td></tr><tr><td>Lame chirurgiche monouso #10</td><td>Sakira Medical</td><td>1567</td><td></td></tr><tr><td>Siringa sterile monouso (1 ml)</td><td>Sakira Medical</td><td>1569</td><td></td></tr><tr><td>Super PAP pen</td><td>E.M.S</td><td>71310</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; l o 200 &mu; l pipetta</td><td>Finnpipette</td><td>9400130</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Zeiss</td><td>LSM 800 - AiryScan</td><td></td></tr><tr><td>NTac:SD-TgN(SOD1G93A)L26H ratti</td><td>Taconic</td><td>2148-M</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS (Dulbecco)</td><td>Gibco</td><td>21600-010</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Amresco</td><td>167</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Bio Basic INC.</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Mallinckrodt</td><td>5092</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco</td><td>497</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Neurofilamento purificato H (NF-H), Anticorpo fosforilato</td><td>BioLegend</td><td>801601</td><td>Precedentemente Covance # SMI 31P</td></tr><tr><td>Anti-Neurofilamento purificato H (NF-H), Anticorpo non fosforilato</td><td>BioLegend</td><td>801701</td><td>Precedentemente Covance # SMI-32P</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 capra anti-Topo IgG (H+L)</td><td>Thermo Scientific</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>&alfa;-Bungarotossina, biotina-XX coniugato</td><td>Invitrogen</td><td>B1196</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidina, Alexa Fluor 555 coniugato</td><td>Invitrogen</td><td>S32355</td><td></td></tr><tr><td>Diaminofenilindolo (DAPI)</td><td>Sigma</td><td>D8417</td><td></td></tr></tbody></table>

dissezione di fibre muscolari scheletriche singole per analisi immunofluorescenti e morfometriche di giunzioni neuromuscolari a montaggio intero

Dissection of Single Skeletal Muscle Fibers for Immunofluorescent and Morphometric Analyses of Whole-Mount Neuromuscular Junctions

La giunzione neuromuscolare (NMJ) è un punto di contatto specializzato tra il nervo motorio e il muscolo scheletrico. Questa sinapsi periferica presenta un'elevata plasticità morfologica e funzionale. In numerosi disturbi del sistema nervoso, nmj è un bersaglio patologico precoce con conseguente fallimento della neurotrasmissione, debolezza, atrofia e persino nella morte delle fibre muscolari. A causa della sua rilevanza, la possibilità di valutare quantitativamente alcuni aspetti della relazione tra i componenti NMJ può aiutare a comprendere i processi associati al suo assemblaggio / smontaggio. Il primo ostacolo quando si lavora con i muscoli è quello di acquisire l'esperienza tecnica per identificare e sezionare rapidamente senza danneggiare le loro fibre. La seconda sfida consiste nell'utilizzare metodi di rilevamento di alta qualità per ottenere immagini NMJ che possono essere utilizzate per eseguire analisi quantitative. Questo articolo presenta un protocollo passo-passo per sezionare i muscoli extensor digitorum longus e soleus dai ratti. Spiega anche l'uso dell'immunofluorescenza per visualizzare elementi pre e postinaptici di NMJs a montaggio intero. I risultati ottenuti dimostrano che questa tecnica può essere utilizzata per stabilire l'anatomia microscopica della sinapsi e identificare sottili cambiamenti nello stato di alcuni dei suoi componenti in condizioni fisiologiche o patologiche.

Questo protocollo offre un metodo semplice per isolare e immunostain fibre muscolari da due diversi tipi di muscoli (muscoli a contrazione rapida e lenta, vedi Figura 1). Utilizzando i marcatori e/o le sonde corretti, i componenti NMJ possono essere rilevati e valutati poiché un punto di vista quantitativo per valutare alcuni dei cambiamenti morfologici che possono verificarsi come conseguenza della progressione della malattia o di uno specifico trattamento farmacologico. Nel presente studio...

La capacità di rilevare con precisione i componenti della giunzione neuromuscolare è fondamentale per valutare le modifiche nella sua architettura a causa di processi patologici o di sviluppo. Qui presentiamo una descrizione completa di un metodo semplice per ottenere immagini di alta qualità di giunzioni neuromuscolari a montaggio intero che possono essere utilizzate per eseguire misurazioni quantitative.

Dissezione di fibre muscolari scheletriche singole per analisi immunofluorescenti e morfometriche di giunzioni neuromuscolari a montaggio intero

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized point of contact between the motor nerve and the skeletal muscle. This peripheral synapse exhibits high ...

Dissezione di singole fibre muscolari scheletriche per analisi immunofluorescenti e morfometriche di giunzioni neuromuscolari a montaggio intero. Questo video dimostrerà un protocollo per sezionare in modo efficace e sicuro i muscoli EDL e soleus con un approccio ripetibile. Questo video insegnerà anche come ottenere giunzioni neuromuscolari a montaggio intero con l'obiettivo di riconoscere componenti sinaptici con integrità 3D per consentire un'accurata analisi morfometrica.Per sezionare i muscoli, sono necessari questi strumenti chirurgici. Per iniziare la procedura, posizionare l'animale con l'addome rivolto verso l'alto. Effettuare un'incisione iniziale utilizzando una lama chirurgica tra le dita dei piedi verso gli arti posteriori.Staccare la pelle, tirando verso l'alto fino a quando il ginocchio destro non è esposto. Per trovare l'EDL, seguire i tendini del piede fino al legamento anulare. Questo legamento circonda due tendini.Tagliare il legamento con le forbici Uniband tra i due tendini. Identificare il tendine EDL sollevando entrambi e vedendo quale fa muovere le dita dei piedi verso l'alto. Tagliare il tendine con le forbici.Tenendo il tendine con pinzette biologiche, inizia a separare lentamente il muscolo EDL dagli altri muscoli degli arti posteriori. La separazione del muscolo senza causare danni può essere fatta facendo vari tagli sul resto dei muscoli laterale per aprire un percorso tra di loro, tenendo e sollevando il muscolo dalla sezione di scissione del tendine EDL. Per isolare completamente il muscolo, tagliare il tendine attaccato al ginocchio del topo usando le forbici Uniband.Immergere il muscolo sezionato nella soluzione fissante e lasciarlo per 24 ore a quattro gradi Celsius. In generale, è utile avere un muscolo allungato. Per fare questo, utilizzare cartone e graffette per attaccare il muscolo per la fissazione.Per isolare il muscolo soleo, capovolgere l'animale. Attraverso la pelle, tagliare il tendine calcaneale usando una lama chirurgica. Con l'aiuto delle pinzette biologiche e delle forbici Uniband, separare il muscolo gastrocnemio dalle ossa, creando un coperchio muscolare.Il soleo sarà sul lato interno del coperchio muscolare. Può essere identificato perché è rosso e piatto. Con un paio di pinzette biologiche, raggiungere e sollevare il tendine soleo che si trova sopra il gastrocnemio sopra.Tagliare il tendine con le forbici Uniband. Sollevare l'intero muscolo mentre si tagliano alcuni dei punti di attacco deboli. Infine, per liberare completamente il muscolo soleo, tagliare la vescicola del soleo che forma il tendine calcaneale.Ripetere la fase di fissazione come fatto con il muscolo EDL. Per utilizzare questo metodo, è importante fissare le graffette ai tendini e non al muscolo. Una volta superato il periodo di fissazione di 24 ore, sciacquare i muscoli nella soluzione DPBS prima di iniziare a isolare le fibre muscolari.Per isolare le fibre, tenere delicatamente uno dei tendini con un paio di pinzette biologiche. Quindi, con l'altra coppia di pinzette biologiche, inizia a pizzicare lentamente il tendine per separare le fibre muscolari. Per isolare le fibre, tirare lentamente verso l'alto verso il tendine muscolare opposto.Sarà necessario ripetere questa azione più volte fino a ottenere più, piccoli bundle isolati. Una volta separati in piccoli fasci isolati, posizionarli con cura in uno scivolo silanizzato pretrattato. È necessario mantenere tutte le fibre in ordine in modo che non si sovrappongano.A questo punto, le fibre possono essere lasciate asciugare all'aria per 24 ore. Dopo 24 ore, inizia l'immunosocienza. Per creare una barriera impermeabile, utilizzare una penna PAP per circondare le fibre muscolari isolate nello scivolo pretrattato.Questo è un esempio di un'immagine confocale ad alta risoluzione che può essere ottenuta seguendo il protocollo descritto qui. In alto a sinistra, viene mostrato l'elemento post-sinaptico, e in alto a destra, l'elemento presinaptico, mentre le immagini in basso mostrano i componenti sinaptici schematizzati al fine di illustrare i parametri che verranno utilizzati per l'analisi morfometrica. La seconda diapositiva mostra l'unione dei segnali pre e post-sinaptici con la macchia dei nuclei dell'API.Le differenze tra le giunzioni neuromuscolari di animali transgenici e animali non transgenici sono chiaramente visibili. L'analisi morfometrica delle giunzioni neuromuscolari mostra prove del segnale post-sinaptico negli animali transgenici e sembra essere più compatta, principalmente a causa della ridotta area totale della giunzione neuromuscolare. Come mostrato qui, l'area pre-sinaptica della giunzione neuromuscolare dell'animale transgenico è ridotta.Il più piccolo rilevato è stato quello trovato con segnale di neurofilamento anti-fosforilato, come mostrato nell'immagine B, per esempio. L'ultima immagine mostra i risultati relativi allo stato delle giunzioni neuromuscolari a montaggio intero. Utilizzando l'indice di copertura, è stato stabilito che le giunzioni neuromuscolari transgeniche sono state trovate parzialmente denervate.Inoltre, potrebbe determinare che la copertura e il nesso del neurofilamento fosforilato è inferiore a quello ottenuto quando viene rilevato un neurofilamento non fosforilato. Il protocollo proposto consente di ottenere preparati di giunzione neuromuscolare di alta qualità da fibre muscolari lente e veloci. I componenti di giunzione neuromuscolare pre e post-sinaptica sono stati identificati da sonde o anticorpi specifici, e quindi immagini in microscopia confocale o confocale a super-risoluzione, consentendo l'analisi morfometrica su scala micrometrica.

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Dissezione e immagini di zone attive nel Drosophila Giunzione neuromuscolare

Visualizzare le singole celle di densamente tessuti confezionati, come le cellule di Schwann terminali (SC) a giunzioni neuromuscolari (NMJs), è una sfida. "Sequenziale foto-bleaching" permette di delineare SC singolo terminale, per esempio nel triangularis espianto muscolo Sterni, un comodo nervo-muscolo preparazione, dove sequenziale sbiancamento può essere combinato con time-lapse imaging...

Sequential Photo-sbiancante per Delineare cellule di Schwann singoli sulla giunzione neuromuscolare

Fonte: Marinello, M., et al. Caratterizzazione delle giunzioni neuromuscolari nei topi mediante microscopia combinata confocale e a super-risoluzione. J. Vis. Exp. (2021)Questo video mostra la preparazione, l'immunocolorazione e l'imaging delle giunzioni neuromuscolari nel tessuto muscolare di ratto utilizzando la microscopia confocale e a super-risoluzione per visualizzare e analizzare le strutture presinaptiche e postsinaptiche.

Caratterizzazione delle giunzioni neuromuscolari nei topi mediante microscopia combinata confocale e a super-risoluzione

In questo video dimostriamo un protocollo per la dissezione del muscolo transversus abdominis del topo e usiamo l'immunofluorescenza e la microscopia per visualizzare le giunzioni neuromuscolari.

Dissezione del muscolo Transversus Abdominis per l'analisi della giunzione neuromuscolare a montaggio intero

La giunzione neuromuscolare (NMJ) è alterata in una varietà di condizioni che a volte possono culminare in un fallimento sinaptico. Questo rapporto descrive i metodi basati sul microscopio a fluorescenza per quantificare tali cambiamenti strutturali.

La giunzione neuromuscolare: Synapse Misurazione circonferenza, la frammentazione e Variazioni Synaptic Proteine ​​Densità Uso confocale microscopia a fluorescenza

Descriviamo una tecnica sperimentale che chiamiamo minimamente invasiva muscolo Embedding (MIME), che si basa sull'evidenza che il tessuto muscolare scheletrico contiene cellule miogeniche vitali che possono facilitare la miogenesi donatore-cellula-mediata quando impiantato nel un muscolo di host.

Minimamente invasiva muscolo incorporamento (MIME) - una nuova tecnica sperimentale per facilitare la miogenesi donatore-cellulo-mediata

Questo protocollo descrive un metodo per l'analisi morfometrica delle giunzioni neuromuscolari mediante microscopia combinata confocale e STED che viene utilizzata per quantificare i cambiamenti patologici in modelli murini di SMA e CMS correlati a ColQ.

Caratterizzazione delle giunzioni neuromuscolari nei topi mediante microscopia combinata confocale e super-risoluzione

Il protocollo mostra un metodo per esaminare la correlazione spaziale tra i terminali pre-sinaptici, i recettori post-sinaptici e le cellule di Schwann peri-sinaptiche nel muscolo gastrocnemio mediale del ratto utilizzando immunoistochimica fluorescente con diversi biomarcatori, vale a dire, neurofilamento 200, trasportatore vescicolare dell'acetilcolina, alfa-bungarotossina e S100.

Visualizzazione delle caratteristiche morfologiche della giunzione neuromuscolare nel muscolo gastrocnemio mediale di ratto

Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per visualizzare le reti di microtubuli nelle giunzioni neuromuscolari e nelle cellule muscolari. In combinazione con i potenti strumenti genetici di Drosophila melanogaster, questo protocollo facilita notevolmente lo screening genetico e l'analisi della dinamica dei microtubuli per il ruolo delle proteine regolatrici della rete di microtubuli nel sistema nervoso.

Utilizzo della giunzione neuromuscolare larvale e delle cellule muscolari della Drosophila per visualizzare la rete di microtubuli

Descriviamo un protocollo per ottenere fibre enzimaticamente dissociate di diverse lunghezze e tipologie da sei muscoli di topi adulti: tre di essi già descritti (flessore breve delle dita, estensore lungo delle dita, soleo) e tre di essi dissociati con successo per la prima volta (estensore lungo dell'alluce, peroneo lungo, peroneo delle dita quarti).

Fibre muscolari scheletriche corte, intermedie e lunghe intatte ottenute dalla dissociazione enzimatica di sei muscoli degli arti posteriori di topi: oltre il flessore breve delle dita

Iniezioni locali di un colorante mitocondriale con etichetta di dotante terminale di cellula di Schwann in vivo per microscopia confocale. Questo metodo utilizza prove di concetto dimostrate su tessuto muscolare scheletrico di topi con muscoli sani o malati per fornire una visualizzazione mitocondriale ad alta risoluzione.

Metodi per la quantificazione in situ della morfologia mitocondriale nelle cellule muscolari e terminali di Schwann di topi

Impara a dissezionare fibre muscolari scheletriche singole di ratto per analisi immunofluorescenti e morfometriche di giunzioni neuromuscolari a montaggio intero. Questo metodo consente la visualizzazione ad alta risoluzione dei componenti pre- e postsinaptici.

Dissezione di fibre muscolari scheletriche singole per analisi immunofluorescenti e morfometriche di giunzioni neuromuscolari a montaggio intero (Video) | JoVE Journal

Dissezione di fibre muscolari scheletriche singole per analisi immunofluorescenti e morfometriche di giunzioni neuromuscolari a montaggio intero

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