Ultracentrifugazione a gradiente di densità per lo studio del riciclaggio endocitico nelle cellule di mammifero
30 giugno 2021
Questo documento mira a presentare un protocollo per la preparazione del riciclaggio di endosomi da cellule di mammifero utilizzando l'ultracentrifugazione del gradiente di densità del saccarosio.
Questo protocollo aiuta a isolare gli endosomi di riciclaggio contenenti frazione da cellule di mammifero trasfettate per facilitare lo studio del traffico proteico attraverso il traffico endocitico. Questa tecnica è facile da maneggiare e applicabile sia ai campioni di tessuto che a quelli cellulari. A dimostrare la procedura sarà miss Zhai Yu Qi, dottoranda del Dr.Lao's Laboratory.
Per iniziare, piastra 2 volte 10 alle 6 celle in un piatto di coltura da 100 millimetri. Il giorno successivo, trasfettare le cellule con Lipofectamine secondo le istruzioni del produttore. Per raccogliere le cellule, scartare il terreno di coltura 48 ore dopo la trasfezione e lavare le cellule due volte con PBS ghiacciato.
Quindi aggiungere un millilitro di PBS ghiacciato integrato con cocktail inibitore della proteasi 0,5X in cocktail inibitore della fosfatasi 0,5X a ciascun piatto. Successivamente, utilizzando un raschietto cellulare, raccogliere le cellule e trasferire la sospensione cellulare in un tubo centrifugo da 15 millilitri. le celle mediante centrifugazione mediante rotore a benna oscillante.
Scartare il surnatante e risospescere delicatamente il pellet cellulare in cinque millilitri di tampone di omogeneizzazione. Raccogliere nuovamente le cellule mediante centrifugazione e risospescere il pellet cellulare in un millilitro di tampone di omogeneizzazione. Omogeneizzare le cellule con un omogeneizzatore Dounce usando da 15 a 20 colpi.
Quindi trasferire l'omogonato in un tubo di centrifugazione da due millilitri. Aggiungere 700 microlitri di buffer di omogeneizzazione all'omogonato. Quindi ruotare l'omogonato diluito e raccogliere 1,5 millilitri del surnatante.
Ruotare di nuovo il surnatante raccolto, quindi raccogliere 1,4 millilitri del surnatante ed etichettarlo come surnatante post-nucleare. Per preparare la colonna del gradiente di densità, trasferire 1,2 millilitri del surnatante post-nucleare in un tubo ultracentrifuga. Quindi aggiungere un millilitro di soluzione di saccarosio al 62% al campione e mescolare bene con un pipettaggio delicato.
Quindi, aggiungere con attenzione 3,3 millilitri di soluzione di saccarosio al 35% sopra il campione, seguito da 2,2 millilitri di soluzione di saccarosio al 25% sopra la soluzione di saccarosio al 35%. Infine, riempire il tubo ultracentrifuga verso l'alto con un tampone di omogeneizzazione. Centrifugare la colonna del gradiente di densità e raccogliere con cura 12 frazioni di 1 millilitro ciascuna, partendo dalla parte superiore del gradiente.
Quindi, diluire tutte le frazioni con un millilitro di tampone di diluizione e centrifugare i campioni diluiti. Dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante e aggiungere 50 microlitri di tampone campione 1X per raccogliere le frazioni. Il marcatore endosomico di riciclaggio Rab11 è stato rilevato nella frazione sette.
Sono stati sondati anche altri marcatori subcellulari, tra cui beta COP, COX IV, GAPDH, EEA1, Rab 7 e Lamp1. Un segnale EEA1 positivo è stato rilevato anche nella frazione sette. Le intensità di banda misurate di GAPDH, Cox IV e Rab11 sia nella frazione sette che nel surnatante post-nucleare sono mostrate qui.
Dopo aver transettato le cellule HEC293 con ELMO1, ELMO1 ARF6Q67L o ELMO1 ARF6Q67L FE65, non sono stati riscontrati cambiamenti nella distribuzione ELMO1 con sovraespressione di ARF6Q67L e FE65. Il livello di ELMO1 nella Frazione sette è stato confrontato tra diverse trasfezioni ed è risultato elevato dopo la cotrasfezione di ARF6Q67L. Un ulteriore aumento è stato osservato quando sia ARF6Q67L che FE65 sono stati co-espressi.
Al contrario, l'eliminazione di FE65 ha diminuito l'arricchimento Elmo1 mediato da ARF6 nella frazione sette. La frazione ottenuta potrebbe essere utilizzata per analisi successive. Ad esempio, western blotting per visualizzare i cambiamenti del livello proteico nella frazione.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per la preparazione di endosomi di riciclo da cellule di mammifero mediante ultracentrifugazione su gradiente di densità di saccarosio. Questa tecnica è stata ideata per facilitare lo studio del traffico proteico attraverso le vie endocitiche.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Biologia cellulare
- Endocitosi
- Trasporto delle proteine
Sfondo
- I endosomi di riciclo svolgono un ruolo cruciale nel traffico cellulare.
- Comprendere il traffico delle proteine è essenziale per ottenere informazioni su diversi processi cellulari.
- L'ultracentrifugazione è una tecnica ampiamente utilizzata per isolare componenti cellulari.
- Questo protocollo è applicabile sia a campioni di tessuto che a campioni cellulari.
Scopo dello studio
- Fornire un metodo affidabile per l'isolamento degli endosomi di riciclo.
- Migliorare la comprensione dei meccanismi del traffico endocitico.
- Sostenere ricerche future sulla dinamica delle proteine all'interno delle cellule.
Metodi Utilizzati
- Trasfezione di cellule di mammifero con Lipofectamine.
- Raccolta delle cellule a 48 ore dalla trasfezione.
- Lavaggio delle cellule con PBS freddo di ghiaccio.
- Utilizzo della ultracentrifugazione su gradiente di densità di saccarosio per l'isolamento.
Risultati principali
- Isolamento riuscito di endosomi di riciclo da cellule trasfettate.
- Dimostrazione del protocollo da parte di uno studente di dottorato.
- Agevolazione di ulteriori studi sul traffico delle proteine.
- Convalida dell'applicabilità del metodo a diversi tipi di campione.
Conclusioni
- Il protocollo fornisce un approccio semplice per l'isolamento degli endosomi di riciclo.
- Si prevede che contribuisca alla comprensione del traffico proteico.
- Questo metodo può essere utilizzato in svariati contesti di ricerca biologica.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'isolamento dei endosomi di riciclo permette una riduzione meccanicistica dei rischi associati ai bersagli del traffico endocitico, fornendo dati quantitativi di frazionamento subcellulare. Questo approccio supporta la validazione dei bersagli e lo sviluppo di saggi per proteine che regolano il riciclo delle proteine di membrana, come gli effettori di ARF6. Il metodo aumenta la fiducia predittiva nell'identificazione dei composti attivi collegando la localizzazione proteica a vie funzionali di riciclo.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Verifica ipotesi terapeutiche riguardo a regolatori del riciclo endocitosico come ARF6 ed ELMO1.
- Valore operativo: Fornisce dati di frazionamento per chiarire i meccanismi di traffico proteico specifici per il percorso.
- Valore scientifico: Supporta la riduzione del rischio biologico mediante la validazione dell'interazione con il bersaglio nelle frazioni di endosomi di riciclo.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara frazioni contenenti endosomi di riciclo validate per analisi successive mediante Western blot.
- Valore operativo: Permette l'isolamento standardizzato e riproducibile di organelli per la misurazione quantitativa delle proteine.
- Valore scientifico: Facilita la preparazione del saggio per lo screening di composti che modulano il riciclo endocitico.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Collega i dati di traffico della fase di scoperta a modelli preclinici mediante l'isolamento della frazione positiva per Rab11.
- Valore operativo: Garantisce la continuità dal frazionamento subcellulare alla validazione funzionale in sistemi rilevanti per la malattia.
- Valore scientifico: Supporta un avanzamento proporzionato al rischio confermando la localizzazione del bersaglio nei percorsi di riciclo.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta isolando frazioni subcellulari che forniscono informazioni per la validazione delle proteine bersaglio e l'identificazione dei composti promettenti.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sui regolatori del riciclo endocitico mediante frazionamento e analisi dei marcatori.
- Screening: Permette lo sviluppo di saggi attraverso l'isolamento standardizzato di frazioni positive per Rab11 per la quantificazione proteica.
- Analisi: Genera letture quantitative di Western blot a partire dalle frazioni per confrontare l'arricchimento proteico in diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega i dati di frazionamento alla continuità preclinica mediante la validazione dell'isolamento degli endosomi di riciclo.
- Riutilizzo aziendale: Fornisce una piattaforma riutilizzabile per il frazionamento subcellulare in diversi progetti di validazione di bersagli.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica nei percorsi di traffico.
- Valore operativo: Garantisce riproducibilità e scalabilità dell'isolamento degli organelli per analisi successive costanti.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione fornendo dati sulla localizzazione subcellulare per gli obiettivi coinvolti nei percorsi di riciclo.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione degli obiettivi corretta rispetto al rischio, basata sui dati di arricchimento nei endosomi di riciclo.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nelle tecniche di coltura cellulare, trasfezione e ultracentrifugazione.
- Dipende dall'accesso a rotorini oscillanti e ultracentrifughe per la separazione tramite gradiente di densità.
- Necessita della standardizzazione dei protocolli di frazionamento tra i diversi gruppi per ottenere frazioni di Rab11 confrontabili.
- Richiede l'adattamento dei pannelli di marcatori (ad esempio, Rab11, EEA1) per diversi tipi cellulari o vie di traffico.
- È limitato dalla necessità di marcatori di validazione per confermare la purezza delle frazioni prima delle applicazioni successive.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:33
Mammalian Cell Culture, Transfection and Cell Harvest
2:07
Density Gradient Column Preparation
2:46
Fractionation and Recovery of Recycling Endosome-Containing Fraction
3:17
Results: Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells
4:47
Conclusion
