Name: Ultracentrifugazione a gradiente di densità per lo studio del riciclaggio endocitico nelle cellule di mammifero (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-30T13:15:00.000+00:00
Duration: 5 min 13 s
Description: Impara l'ultracentrifugazione a gradiente di densità per isolare gli endosomi di riciclaggio nelle cellule di mammifero. Questo metodo facilita lo studio del traffico proteico endocitico in biologia cellulare.

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Questo lavoro è stato sostenuto da fondi del Research Grants Council di Hong Kong, del programma di sovvenzioni dirette CUHK, del fondo di dotazione United College e del TUYF Charitable Trust. Le cifre di questo lavoro sono state adattate dalla nostra precedente pubblicazione, "ARF6-Rac1 signaling-mediated neurite outgrowth is potentiated by the neuronal adaptor FE65 through orchestrating ARF6 and ELMO1" pubblicata sul FASEB Journal nell'ottobre 2020.

1. Coltura e trasfezione cellulare di mammiferi
<ol><li>Piastra 2 x 106 celle in una pala di coltura da 100 mm. Utilizzare quattro piatti per ogni trasfezione. NOTA: il numero di celle necessarie può variare a seconda delle diverse linee di cella. L'ottimizzazione può essere necessaria prima di procedere alla fase di isolamento.</li>
	<li>Il giorno successivo, trasfettare le cellule con Lipofectamine secondo le istruzioni del produttore.</li>
</ol>2. Raccolta delle cellule
<ol><li>Scartare il terreno di coltura 48 ore dopo la trasfezione.</li>
	<li>Lavare le cellule con PBS ghiacciato (10 mM fosfati di sodio, 2,68 mM di cloruro di potassio, 140 mM di cloruro di sodio) due volte.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di PBS+ ghiacciato (PBS integrato con 0,5x cocktail inibitore della proteasi e 0,5x cocktail inibitore della fosfatasi) a ciascun piatto.</li>
	<li>Raccogliere le cellule con un raschietto cellulare e trasferire la sospensione cellulare in un tubo centrifugo da 15 ml.</li>
	<li>Pellet le celle mediante centrifugazione utilizzando un rotore a benna oscillante a 400 x g per 5 min.</li>
	<li>Scartare il surnatante e risospesciare delicatamente il pellet cellulare in 5 mL di tampone di omogeneizzazione (HB; 250 mM di saccarosio, 3 mM di imidazolo a pH 7,4, 1 mM di EDTA integrato con 0,03 mM di cicloeximide, 1x cocktail inibitore della proteasi e 1x cocktail inibitore della fosfatasi).</li>
	<li>Raccogliere le cellule per centrifugazione a 1.300 x g per 10 min.</li>
	<li>Risospesso il pellet di cella in 1 mL di HB.</li>
	<li>Omogeneizzare le cellule con un omogeneizzatore Dounce per 15-20 colpi. NOTA: potrebbero essere utilizzati altri metodi di omogeneizzazione, ad esempio il passaggio del campione attraverso una siringa. L'efficienza di omogeneizzazione potrebbe essere rivelata osservando l'omogeneizzato al microscopio a contrasto di fase.</li>
	<li>Trasferire l'omogeneizzato in un tubo di centrifugazione da 2 ml. NOTA: Raccogliere 50 μL di omogeneizzato con 12,5 μL di tampone campione 5x ed etichettarlo come lisato totale.</li>
	<li>Aggiungere 0,7 ml di HB all'omogeneizzato.</li>
	<li>Ruotare l'omogeneizzato diluito a 2.000 x g per 10 minuti a 4 °C. NOTA: Il pellet contiene nuclei e cellule ininterrotte.</li>
	<li>Raccogliere 1,5 ml del surnatante e ripetere il passaggio 2,12 una volta.</li>
	<li>Raccogliere 1,4 ml del surnatante ed etichettarlo come surnatante post-nucleare (PNS).</li>
</ol>3. Preparazione della colonna del gradiente di densità
<ol><li>Trasferire 1,2 mL di PNS a un tubo ultracentrifuga.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di soluzione di saccarosio al 62% (2.351 M di saccarosio, 3 mM di imidazolo a pH 7.4) al campione e mescolare bene con un leggero pipettaggio. NOTA: La soluzione risultante è una soluzione di saccarosio al 40,6%.</li>
	<li>Aggiungere 3,3 mL di soluzione di saccarosio al 35% (1,177 M di saccarosio, 3 mM di imidazolo a pH 7,4) con attenzione sopra il campione.</li>
	<li>Aggiungere 2,2 mL di soluzione di saccarosio al 25% (0,806 M di saccarosio, 3 mM di imidazolo a pH 7,4) con attenzione sulla soluzione di saccarosio al 35%. NOTA: l'indice di rifrazione delle soluzioni di saccarosio al 62%, 40,6%, 35% e 25% a temperatura ambiente è rispettivamente 1,44, 1,40, 1,39 e 1,37. Gli indici di rifrazione delle soluzioni di saccarosio potrebbero essere controllati con un rifrattometro per garantire la precisione e la coerenza dell'esperimento.</li>
	<li>Riempire il tubo di ultracentrifugazione con HB. NOTA: conservare temporaneamente la colonna del gradiente di densità preparata a 4 °C.</li>
</ol>4. Frazionamento e recupero della frazione contenente endosomi riciclata
<ol><li>Centrifugare la colonna a 210.000 x g per 3 ore a 4 °C.</li>
	<li>Raccogliere 12 frazioni (1 mL ciascuna) con attenzione, partendo dalla cima del gradiente. NOTA: Gli endosomi di riciclaggio devono essere trovati all'interfaccia tra il 35% e il 25% di soluzioni di saccarosio. Le frazioni raccolte possono essere congelate a scatto in azoto liquido e conservate a -80 °C.</li>
	<li>Diluire tutte le frazioni con 1 mL di tampone di diluizione (3 mM di imidazolo a pH 7,4, 1 mM di EDTA).</li>
	<li>Centrifugare il campione diluito a 100.000 x g per 1 ora a 4 °C.</li>
	<li>Aspirare il surnatante e aggiungere 50 μL di 1x tampone campione per raccogliere le frazioni.</li>
	<li>Analizzare il contenuto proteico nelle frazioni mediante western blotting.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse con i contenuti di questo articolo.

Il protocollo di cui sopra delinea le procedure per isolare gli endosomi di riciclaggio dalle cellule coltivate mediante ultracentrifugazione. L'affidabilità di questo metodo è stata dimostrata dall'ultima pubblicazione22, dimostrando che gli endosomi di riciclaggio sono isolati con successo da altri organelli (Figura 1), come l'apparato di Golgi e i mitocondri. Alcuni passaggi critici devono essere prestati attenzione per ottenere un buon risultato di separazione. Du...

Il traffico endosomiale è un processo fisiologico essenziale che coinvolge vari eventi biologici1, ad esempio il trasporto di recettori di segnalazione, canali ionici e molecole di adesione. Le proteine localizzate nella membrana plasmatica sono internalizzate dall'endocitosi2. Le proteine internalizzate vengono quindi selezionate dall'endosoma precoce3. Alcune delle proteine sono mirate ai lisosomi per la degradazione4. Tuttavia, una quantità significativa di proteine viene riciclata sulla superficie cellulare mediante un rapido riciclaggio e processi di riciclaggio lenti. Nel riciclaggio veloce, le proteine lasciano gli endosomi precoci e ritornano direttamente alla membrana plasmatica. Al contrario, nel riciclaggio lento, le proteine vengono prima selezionate nel compartimento di riciclaggio endocitico e quindi trasportate di nuovo alla membrana plasmatica. Varie proteine di carico, ad esempio clatrina, complesso retromero, complesso retriever e proteina della sindrome di Wiskott-Aldrich e complesso SCAR Homologue (WASH), partecipano a tali processi di riciclaggio della membrana4,5,6,7,8,9. L'equilibrio dell'endocitosi e dell'evento di riciclaggio è cruciale per la sopravvivenza cellulare e contribuisce a vari eventi cellulari10, ad esempio, adesione cellulare, migrazione cellulare, polarità cellulare e trasduzione del segnale.
ARF6, una piccola GTPasi, è un regolatore segnalato del traffico endocitico7,11,12. Di interesse, vari gruppi di ricerca hanno illustrato l'importanza dell'ARF6 nel riciclo endocitico13,14,15,16,17. Lo studio mira a studiare la relazione tra la crescita dei neuriti mediata da ARF6 e il riciclaggio endocitico. Il rapporto precedente suggerisce che l'attivazione di ARF6 è a monte dell'attività di Rac1 attraverso l'azione su ELMO1-dedicatore del complesso di citochinesi 1 (DOCK180)18. Tuttavia, il modo in cui ARF6 attiva la segnalazione Rac1 mediata da ELMO1-DOCK180 rimane poco chiaro. L'ultracentrifugazione del gradiente di densità è stata impiegata per studiare il ruolo del riciclaggio endocitico mediato da ARF6 in tale processo. Usando questo, la frazione contenente endosoma di riciclaggio è stata ottenuta da lisati cellulari19. La frazione è stata sottoposta a Western blotting per l'analisi del contenuto proteico. I risultati dell'immunoblot hanno rivelato che sotto la presenza di FE65, una proteina adattatrice arricchita dal cervello, L'ARF6 attivo ha aumentato sostanzialmente il livello di ELMO1 nella frazione contenente endosoma riciclato. Il seguente protocollo include le procedure per (1) trasfettare le cellule di mammifero; (2) preparazione dei campioni e delle colonne del gradiente di densità; e (3) ottenere la frazione contenente endosomi di riciclaggio.

<table><tbody><tr><td>1 mL, provetta in polipropilene a parete spessa open-top, 11 x 34 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>347287</td><td></td></tr><tr><td>piatto per coltura tissutale da 100 mm</td><td>SPL</td><td>20100</td><td></td></tr><tr><td>13,2 mL, provetta ultra-trasparente a parete sottile aperta libera certificata, 14 x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>C14277</td><td></td></tr><tr><td>5x tampone campione</td><td>GenScript</td><td>MB01015</td><td></td></tr><tr><td>cocktail completo di inibitori della proteasi senza EDTA</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>COX IV (3E11) Rabbit mAb</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4850S</td><td>Anticorpo monoclonale di coniglio per il rilevamento della COX IV.</td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1988</td><td></td></tr><tr><td>Dounce Tissue Grinder, 7 mL</td><td>DWK Life Sciences</td><td>357542</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) con basso glucosio</td><td>HyClone</td><td>SH30021.01</td><td></td></tr><tr><td>ELMO1 anticorpo (B-7)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-271519</td><td>Anticorpo monoclonale di topo per la rilevazione di ELMO1.</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>FE65 anticorpo (E-20)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-19751</td><td>Anticorpo policlonale di capra per il rilevamento di FE65.</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino,</td> anticorpo monoclonale <td>HyClone</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH (6C5)</td><td>Ambion</td><td>AM4300</td><td>Anticorpo monoclonale di topo per il rilevamento di GAPDH.</td></tr><tr><td>Software ImageLab</td><td>Bio-Rad Misurazione dell'intensità</td><td></td><td>della banda</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Reagente di trasfezione</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale anti-beta;-COP</td><td>Sigma</td><td>G6160</td><td>Anticorpo monoclonale di topo per la rilevazione di &beta;-COP.</td></tr><tr><td>Myc-tag (9B11) mAb di topo</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2276S</td><td>Anticorpo monoclonale di topo per il rilevamento di proteine marcate myc.</td></tr><tr><td>OmniPur EDTA, sale disodico, diidrato</td><td>Calbiochem</td><td>4010-OP</td><td></td></tr><tr><td>Optima L-100 XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>392050</td><td></td></tr><tr><td>Optima MAX-TL</td><td>Beckman Coulter</td><td>A95761</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Siero ridotto Media</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>PBS Compresse</td><td>Gibco</td><td>18912014</td><td></td></tr><tr><td>PhosSTOP</td><td>Roche</td><td></td><td></td>4906845001</tr><tr><td>Anticorpo policlonale specifico RAB11A</td><td>Proteintech</td><td>20229-1-AP</td><td>Anticorpo policlonale di coniglio per il rilevamento di Rab11.</td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Affymetrix</td><td>AAJ21931A4</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti Rotore a secchio oscillante</td><td>Coltro Beckman 331362</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotore ad angolo fisso TLA-120.2</td><td>Coltro Beckman</td><td>362046</td><td></td></tr><tr><td>tripsina-EDTA (0,05%), rosso fenolo</td><td>Gibco</td><td>25300062</td><td></td></tr></tbody></table>

ultracentrifugazione a gradiente di densità per lo studio del riciclaggio endocitico nelle cellule di mammifero

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

Il traffico endosomiale è un processo cellulare essenziale che regola una vasta gamma di eventi biologici. Le proteine vengono internalizzate dalla membrana plasmatica e quindi trasportate ai primi endosomi. Le proteine internalizzate potrebbero essere transitate al lisosoma per la degradazione o riciclate nella membrana plasmatica. È necessario un robusto percorso di riciclaggio endocitico per bilanciare la rimozione dei materiali di membrana dall'endocitosi. Varie proteine sono segnalate per regolare la via, tra cui ADP-ribosilazione fattore 6 (ARF6). L'ultracentrifugazione del gradiente di densità è un metodo classico per il frazionamento cellulare. Dopo la centrifugazione, gli organelli vengono sedimentati sulla loro superficie isopicnica. Le frazioni vengono raccolte e utilizzate per altre applicazioni a valle. Qui è descritto un protocollo per ottenere una frazione contenente endosomi riciclata da cellule di mammifero trasfettate utilizzando l'ultracentrifugazione del gradiente di densità. Le frazioni isolate sono state sottoposte a western blotting standard per analizzare il loro contenuto proteico. Utilizzando questo metodo, abbiamo identificato che il targeting della membrana plasmatica dell'inghiottimento e della motilità cellulare 1 (ELMO1), un substrato di scambio nucleotidico della tossina botulinica C3 correlato a Ras 1 (Rac1), avviene attraverso il riciclaggio endocitico mediato da ARF6.

Dopo aver frazionato le cellule HEK293 non trasfettate mediante ultracentrifugazione del gradiente di densità, sono state raccolte 12 frazioni a partire dalla parte superiore del gradiente. Le frazioni raccolte sono state diluite con il tampone di diluizione in rapporto 1:1 e sottoposte ad un secondo ciclo di centrifugazione. I campioni sono stati quindi sottoposti a western blotting per analizzare il loro contenuto proteico. Come mostrato nella Figura 1, il marcatore endosoma di riciclaggio...

Questo documento mira a presentare un protocollo per la preparazione del riciclaggio di endosomi da cellule di mammifero utilizzando l'ultracentrifugazione del gradiente di densità del saccarosio.

Ultracentrifugazione a gradiente di densità per lo studio del riciclaggio endocitico nelle cellule di mammifero

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...

Questo protocollo aiuta a isolare gli endosomi di riciclaggio contenenti frazione da cellule di mammifero trasfettate per facilitare lo studio del traffico proteico attraverso il traffico endocitico. Questa tecnica è facile da maneggiare e applicabile sia ai campioni di tessuto che a quelli cellulari. A dimostrare la procedura sarà miss Zhai Yu Qi, dottoranda del Dr.Lao's Laboratory.Per iniziare, piastra 2 volte 10 alle 6 celle in un piatto di coltura da 100 millimetri. Il giorno successivo, trasfettare le cellule con Lipofectamine secondo le istruzioni del produttore. Per raccogliere le cellule, scartare il terreno di coltura 48 ore dopo la trasfezione e lavare le cellule due volte con PBS ghiacciato.Quindi aggiungere un millilitro di PBS ghiacciato integrato con cocktail inibitore della proteasi 0,5X in cocktail inibitore della fosfatasi 0,5X a ciascun piatto. Successivamente, utilizzando un raschietto cellulare, raccogliere le cellule e trasferire la sospensione cellulare in un tubo centrifugo da 15 millilitri. le celle mediante centrifugazione mediante rotore a benna oscillante.Scartare il surnatante e risospescere delicatamente il pellet cellulare in cinque millilitri di tampone di omogeneizzazione. Raccogliere nuovamente le cellule mediante centrifugazione e risospescere il pellet cellulare in un millilitro di tampone di omogeneizzazione. Omogeneizzare le cellule con un omogeneizzatore Dounce usando da 15 a 20 colpi.Quindi trasferire l'omogonato in un tubo di centrifugazione da due millilitri. Aggiungere 700 microlitri di buffer di omogeneizzazione all'omogonato. Quindi ruotare l'omogonato diluito e raccogliere 1,5 millilitri del surnatante.Ruotare di nuovo il surnatante raccolto, quindi raccogliere 1,4 millilitri del surnatante ed etichettarlo come surnatante post-nucleare. Per preparare la colonna del gradiente di densità, trasferire 1,2 millilitri del surnatante post-nucleare in un tubo ultracentrifuga. Quindi aggiungere un millilitro di soluzione di saccarosio al 62% al campione e mescolare bene con un pipettaggio delicato.Quindi, aggiungere con attenzione 3,3 millilitri di soluzione di saccarosio al 35% sopra il campione, seguito da 2,2 millilitri di soluzione di saccarosio al 25% sopra la soluzione di saccarosio al 35%. Infine, riempire il tubo ultracentrifuga verso l'alto con un tampone di omogeneizzazione. Centrifugare la colonna del gradiente di densità e raccogliere con cura 12 frazioni di 1 millilitro ciascuna, partendo dalla parte superiore del gradiente.Quindi, diluire tutte le frazioni con un millilitro di tampone di diluizione e centrifugare i campioni diluiti. Dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante e aggiungere 50 microlitri di tampone campione 1X per raccogliere le frazioni. Il marcatore endosomico di riciclaggio Rab11 è stato rilevato nella frazione sette.Sono stati sondati anche altri marcatori subcellulari, tra cui beta COP, COX IV, GAPDH, EEA1, Rab 7 e Lamp1. Un segnale EEA1 positivo è stato rilevato anche nella frazione sette. Le intensità di banda misurate di GAPDH, Cox IV e Rab11 sia nella frazione sette che nel surnatante post-nucleare sono mostrate qui.Dopo aver transettato le cellule HEC293 con ELMO1, ELMO1 ARF6Q67L o ELMO1 ARF6Q67L FE65, non sono stati riscontrati cambiamenti nella distribuzione ELMO1 con sovraespressione di ARF6Q67L e FE65. Il livello di ELMO1 nella Frazione sette è stato confrontato tra diverse trasfezioni ed è risultato elevato dopo la cotrasfezione di ARF6Q67L. Un ulteriore aumento è stato osservato quando sia ARF6Q67L che FE65 sono stati co-espressi.Al contrario, l'eliminazione di FE65 ha diminuito l'arricchimento Elmo1 mediato da ARF6 nella frazione sette. La frazione ottenuta potrebbe essere utilizzata per analisi successive. Ad esempio, western blotting per visualizzare i cambiamenti del livello proteico nella frazione.

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Questo articolo descrive un protocollo per l'estrazione di tradurre ribosomi delle cellule eucariotiche. Una volta estratto, i ribosomi sono separati in monosomes e poliribosomi per frazionamento gradiente di saccarosio per consentire diverse popolazioni ribosomiale da analizzare. Come tale, questo metodo è il gold standard per l'esame della regolamentazione della traduzione.

Eucarioti Analisi Profilo Polyribosome

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Qui, presentiamo un protocollo per isolare la membrana plasmatica, citoplasma e nei mitocondri delle cellule U937 senza l'uso di centrifugazione ad alta velocità. Questa tecnica può essere utilizzata per purificare le frazioni subcellulari per l'esame successivo di localizzazione della proteina tramite immunoblotting.

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Questo protocollo di frazionamento consentirà ai ricercatori di isolare proteine citoplasmatiche, nucleari, mitocondriali e di membrana da cellule di mammifero. Le ultime due frazioni subcellulari vengono ulteriormente purificate tramite gradiente di densità isopicnica.

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Questo protocollo descrive in dettaglio l'arricchimento di vescicole extracellulari micobatteriche native (mEV) da colture axeniche di Mycobacterium smegmatis (Msm) e come possono essere progettate e arricchite le MsmEV ricombinanti contenenti mCherry (un reporter fluorescente rosso). Infine, verifica il nuovo approccio con l'arricchimento di MsmEVs contenenti la proteina EsxA di Mycobacterium tuberculosis.

Arricchimento di vescicole extracellulari native e ricombinanti di micobatteri

I siti di contatto mitocondriali sono complessi proteici che interagiscono con le proteine della membrana interna ed esterna mitocondriale. Questi siti sono essenziali per la comunicazione tra le membrane mitocondriali e, quindi, tra il citosol e la matrice mitocondriale. In questo articolo, descriviamo un metodo per identificare i candidati che si qualificano per questa specifica classe di proteine.

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Questo studio descrive un metodo per isolare e purificare le vescicole extracellulari batteriche (BEV) arricchite da feci umane tramite centrifugazione a gradiente di densità (DGC), identifica le caratteristiche fisiche dei BEV dalla morfologia, dalla dimensione delle particelle e dalla concentrazione e discute le potenziali applicazioni dell'approccio DGC nella ricerca clinica e scientifica.

Isolamento e purificazione di vescicole extracellulari batteriche da feci umane mediante centrifugazione a gradiente di densità

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Isolamento di lipoproteine ​​ad alta densità per non codificante Piccolo RNA Quantificazione

Impara l'ultracentrifugazione a gradiente di densità per isolare gli endosomi di riciclaggio nelle cellule di mammifero. Questo metodo facilita lo studio del traffico proteico endocitico in biologia cellulare.

Ultracentrifugazione a gradiente di densità per lo studio del riciclaggio endocitico nelle cellule di mammifero

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