Name: Preparazione di virus dellinfluenza aviaria H5 pseudo-tipizzati con metodo di trasfezione del fosfato di calcio e misurazione dellattività neutralizzante degli anticorpi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-22T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: Impara a preparare pseudovirus dell'influenza aviaria H5 con trasfezione al fosfato di calcio e a misurare l'attività neutralizzante degli anticorpi. Questo metodo facilita lo sviluppo di vaccini.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalle borse di ricerca dell'Innovation Capacity Building Project della provincia di Jiangsu (BM2020019), Shenzhen Scientific and Technological Project (No. JSGG20200225150702770), Programma di ricerca prioritaria strategica dell'Accademia cinese delle scienze (XDB29030103), Progetto scientifico e tecnologico del Guangdong (n. 2020B1111340076) e Programma di ricerca aperta del laboratorio della baia di Shenzhen (n. SZBL202002271003).

Tutte le operazioni sperimentali correlate allo pseudovirus sono state eseguite in condizioni ABSL2 presso l'Institut Pasteur dell'Accademia cinese delle scienze di Shanghai (IPS, CAS). Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti sulla base dei protocolli sugli animali approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali di IPS, CAS.
1. Confezionamento di pseudovirus con trasfezione calcio-fosfato
<ol><li>Effettuare sospensioni monocellulari di cellule HEK293FT (9 x 105 per ml) in mezzo DMEM completo (Tabella 1). Aggiungere 10 ml delle sospensioni monocellulari in un matraccio T75, incubare le cellule in un incubatore a 37 °C, 5% di anidride carbonica (CO2) per 20 ore prima della trasfezione. NOTA: HEK293FT passaggio basso (<20 passaggi) è consigliato. Assicurarsi che il monostrato cellulare sia confluente all'80-90%.</li>
	<li>Sostituire il terreno con 10 ml di terreno completo fresco contenente clorochina (100 μM) 2 ore prima della trasfezione.</li>
	<li>Mescolare i reagenti e il DNA plasmidico come mostrato nella Tabella 2 e nella Figura 1: ddH 2 O, pCMV/R-HA, pCMV/R-NA, pHR-Luc, pCMV Δ 8,9, 2,5 M CaCl2e 2x tampone HEPES. Pipettare su e giù 5 volte delicatamente, incubare la miscela a temperatura ambiente (RT) per 20 minuti.</li>
	<li>Trasferire la miscela nel mezzo sopra le cellule e scuotere delicatamente il pallone. Incubare le cellule nell'incubatore cellulare per 15 ore.</li>
	<li>Sostituire il fluido con 15 ml di materiale DMEM completo fresco. Incubare le cellule in un incubatore a 37 °C, 5% CO2 per 65 ore. NOTA: Il colore del mezzo sarà arancione chiaro o leggermente giallo e almeno l'80% della cellula dovrebbe mostrare l'effetto citopatico (CPE) al microscopio ottico invertito.</li>
	<li>Raccogliere il surnatante e centrifugarlo a 2095 x g per 20 minuti a 4 °C. Raccogliere il surnatante, aliquotarlo e conservarlo a -80 °C.</li>
</ol>2. Rilevazione dell'espressione delle proteine p24 di HA, NA e HIV-1 dello pseudovirus influenzale
<ol><li>Rilevare l'espressione della proteina HA mediante il test dell'emoagglutinina (HA).<ol><li>Aggiungere 50 μL di PBS nelle colonne 2-12, righe A, B e C di una piastra a fondo rotondo a 96 pozzetti. Nota : le righe A, B e C appartengono a 3 test di replica indipendenti e la colonna 12 viene utilizzata come controllo negativo.</li>
		<li>Aggiungere 100 μL di pseudovirus nei pozzetti della colonna 1. Trasferire 50 μL dalla colonna 1 alla colonna 2, miscelare bene pipettando su e giù 5 volte, eseguire le due diluizioni doppie fino all'ultima colonna 11 ed eliminare i 50 μL supplementari dalla colonna 11.</li>
		<li>Aggiungere 50 μL di eritrocita allo 0,5% in ciascun pozzetto, pipettare su e giù delicatamente due volte. Incubare la piastra per 30-60 minuti a RT o fino a quando gli eritrociti del controllo negativo formano i punti regolari sul fondo del pozzetto.</li>
		<li>Osservare e registrare i titoli HA dello pseudovirus. NOTA: L'unità HA degli pseudovirus è il più alto fattore di diluizione del virus che può causare emoagglutinazione al 100% dei globuli rossi.</li>
	</ol></li>
	<li>Rilevare l'espressione delle proteine HA e NA mediante il test western-blot. NOTA: Tutti i passaggi western-blot sono eseguiti secondo il manuale di clonazione molecolare (4° edizione).</li>
	<li>Rilevare l'espressione della proteina HIV-1 p24 mediante il kit ELISA HIV-1 p24 (Table of Materials).<ol><li>Aggiungere 50 μL del tampone di lisi in 450 μL di campione di pseudovirus. Mescolare accuratamente.</li>
		<li>Aggiungere 300 μL del tampone di lavaggio a ciascun pozzetto della micropiastra. Colpire la piastra capovolta per rimuovere completamente il tampone di lavaggio. Ripetere il lavaggio 5 volte.</li>
		<li>Aggiungere separatamente 200 μL dello standard e campioni a ciascun pozzetto. Incubarli a 37 °C durante la notte o per 2 ore.</li>
		<li>Aspirare il contenuto della piastra e lavarla come descritto al punto 2.3.2. NOTA: Lasciare vuoto un pozzetto della piastra di analisi da utilizzare come substrato vuoto.</li>
		<li>Aggiungere 200 μL di anticorpi del rivelatore p24 a ciascun pozzetto. Incubarli a 37 °C per 1 ora. Aspirare e lavare la piastra come descritto al punto 2.3.2.</li>
		<li>Aggiungere 100 μL della soluzione di lavoro di streptavidina-perossidasi a ciascun pozzetto e incubarli a 37 °C per 30 minuti. Aspirare e lavare la piastra come descritto al punto 2.3.2.</li>
		<li>Aggiungere 100 μL della soluzione di lavoro del substato a ciascun pozzetto, compreso il pozzetto bianco del substrato, e incubarli a 37 °C per 30 minuti. NOTA: Il colore blu si svilupperà nei pozzi.</li>
		<li>Aggiungere 100 μL del tampone di arresto a ciascun pozzetto. NOTA: il colore blu diventerà immediatamente giallo.</li>
		<li>Leggi la densità ottica a 450 nm entro 15 min. Registrare i titoli p24 dello pseudovirus</li>
	</ol></li>
</ol>3. Titolazione degli pseudovirus
<ol><li>Effettuare sospensioni a cella singola di cellule MDCK (5 x 104 per ml) in mezzo DMEM completo, aggiungere 1250, 2500, 5000, 10000, 20000 e 40000 celle a diversi pozzetti di una piastra a fondo piatto a 96 pozzetti. Incubare le cellule in un incubatore a 37 °C, 5% CO2 per 20 ore.</li>
	<li>Estrarre lo pseudovirus dal frigorifero a -80 °C, scongelarlo sul ghiaccio e vortice lo pseudovirus.</li>
	<li>Aggiungere 6 pseudovirus HAU (6x unità HA) a ciascun pozzetto di piastra a fondo tondo a 96 pozzetti e ricostituire ciascun pozzetto con DMEM completo fino a 120 μL.</li>
	<li>Pipettare su e giù per la miscela 5 volte per mescolare accuratamente. Incubare la piastra della miscela in un incubatore a 37 °C, 5 % CO2 per 1 ora.</li>
	<li>Trasferire 100 μL della miscela alle cellule nella piastra a 96 pozzetti. Rimettere la piastra di coltura cellulare nell'incubatore per 48 ore, 60 ore e 72 ore dopo l'infezione da virus.</li>
	<li>Estrarre la piastra dall'incubatore ed eseguire il test della luciferasi (Table of Materials).</li>
	<li>Rimuovere accuratamente il mezzo dai pozzetti della piastra. Risciacquare le cellule con 200 μL di PBS e rimuovere il PBS il più possibile. NOTA: Capovolgere la piastra e scartare il surnatante schiaffeggiandolo inversamente su carta assorbente. Se la linea cellulare di prova non è stata fissata saldamente al fondo, rimuovere con cura l'aspirazione del mezzo.</li>
	<li>Aggiungere 50 μL del tampone di lisi a ciascun pozzetto e scuotere la piastra di coltura più volte. Conservare il piatto a -80 °C per una notte. NOTA: Mescolare 1 volume di tampone di lisi 5x con 4 volumi di acqua per ottenere il tampone di lisi 1x. Equilibrare il tampone di lisi 1x a RT prima dell'uso. Scuotere la piastra per garantire che le cellule siano completamente coperte con il tampone di lisi. Il singolo processo di congelamento-disgelo può aiutare la cellula a essere completamente lisata.</li>
	<li>Estrarre il piatto, equilibrare a RT per 2 ore. NOTA: la cella deve essere completamente lisata.</li>
	<li>Scuotere la piastra più volte delicatamente e trasferire tutti i lisati cellulari in piastre opache a 96 pozzetti.</li>
	<li>Aggiungere 50 μL del substrato a ciascun pozzetto, scuotere delicatamente la piastra più volte e mescolare accuratamente il substrato e il tampone di lisi.</li>
	<li>Misurare la luce prodotta entro 5 minuti utilizzando un luminometro. Registrare i titoli luciferasi dello pseudovirus. NOTA: Quando viene aggiunto un substrato appropriato, la luce viene emessa come sottoprodotto attraverso una reazione chimica in cui la luciferina viene convertita in ossiluciferina dall'enzima luciferasi. La quantità di luce prodotta è proporzionale alla quantità dell'enzima luciferasi.</li>
</ol>4. Preparazione dei sieri immunitari
NOTA: Il siero immunitario sarà utilizzato per esperimenti correlati alle cellule e l'operazione sperimentale deve essere eseguita in condizioni asettiche.
<ol><li>Preparare 12 topi BALB / c femmina di otto settimane. Dividi equamente i topi in due gruppi. NOTA: un gruppo era il gruppo DDV e l'altro era il gruppo di controllo negativo.</li>
	<li>Immunizzazione del gruppo DDV: Prime due volte per via intramuscolare con 100 μg di un plasmide del DNA ottimizzato per il codone che codifica la proteina A/Thailand/(KAN-1)/2004 (TH) HA alla settimana 0 e alla settimana 3 e aumenta una volta per via intraperitoneale con 512 particelle simili al virus HAU TH (VLP) alla settimana 6.</li>
	<li>Immunizzazione del gruppo di controllo: Prime due volte per via intramuscolare con 100 μg di DNA plasmidico vettore vuoto alla settimana 0 e alla settimana 3 e aumenta una volta per via intraperitoneale con HIV-1 gag VLP alla settimana 6.</li>
	<li>Raccogliere il sangue del topo 2 settimane dopo l'ultima immunizzazione. NOTA: Qui, i topi sono stati anestetizzati con pentobarbital sodico (65 mg / kg) al momento della raccolta del sangue. Dopo la raccolta di sangue dalla vena sottomandibolare, i topi sono stati immediatamente eutanasizzati.</li>
	<li>Mantenere il sangue a RT per 2 ore, poi 4 °C durante la notte. Centrifugare a 900 x g per 10 minuti a 4 °C e raccogliere il surnatante. Inattivare i sieri posizionandoli a 56 °C per 30 minuti.</li>
	<li>Conservare i sieri immuni in frigorifero a -80 °C per l'uso. NOTA: fare riferimento alla Figura 1 supplementare per il diagramma di flusso che descrive le principali procedure di immunizzazione del topo.</li>
</ol>5. Saggio di neutralizzazione degli pseudovirus (PN)
<ol><li>Effettuare sospensioni a cella singola di cellule MDCK (5 x 104 per ml) in mezzo DMEM completo e aggiungere 100 μL della sospensione cellulare a ciascun pozzetto di una piastra a fondo piatto a 96 pozzetti. Incubare le cellule in un incubatore a 37 °C, 5% CO2 per 20 ore.</li>
	<li>Estrarre lo pseudovirus e i sieri dal frigorifero a -80 °C, scongelarli sul ghiaccio e vortice accuratamente.</li>
	<li>Diluire i sieri nel mezzo completo 20 volte e aggiungere 100 μL di mezzo DMEM completo ai pozzetti di una piastra a fondo rotondo a 96 pozzetti dalle colonne 2-10.</li>
	<li>Aggiungere 200 μL dei sieri diluiti nei pozzetti della colonna 2, trasferire successivamente 100 μL dalla colonna 2 alla colonna 3, diluire i sieri come 1:20, 1:40, 1:80, ecc., a 1:10240 successivamente dalla colonna 2 alla colonna 10 ed eliminare i 100 μL dalla colonna 10.</li>
	<li>Aggiungere 100 μL di mezzo completo DMEM ai pozzetti della colonna 11 come controllo negativo.</li>
	<li>Aggiungere 100 μL di pseudovirus a ciascun pozzetto, pipettare su e giù per la miscela 5 volte accuratamente e incubare la piastra della miscela in 37 °C, 5% CO2 per 1 ora.</li>
	<li>Trasferire 100 μL della miscela dalla piastra a fondo rotondo a 96 pozzetti al pozzetto corrispondente della piastra di coltura cellulare a 96 pozzetti. Rimettere la piastra nell'incubatore (37 °C, 5% CO2) per 60 ore.</li>
	<li>Estrarre il piatto dall'incubatore. Eseguire il test della luciferasi come descritto nei punti 3.7-3.12.</li>
</ol>6. Saggio di attaccamento di pseudovirus
<ol><li>Effettuare sospensioni a cella singola di cellule MDCK (4 x 104 per ml) in mezzo DMEM completo e aggiungere sospensioni di celle da 100 μL a ciascun pozzetto in una piastra a fondo piatto a 96 pozzetti. Incubare le cellule a 37 °C, 5% CO2 per 20 ore.</li>
	<li>Incubare lo pseudovirus con sieri in DMEM contenente 1% BSA a 4 °C durante la notte. NOTA: Il volume della miscela è di 100 μL.</li>
	<li>Bloccare le cellule MDCK con 100 μL per pozzetto di DMEM contenente l'1% di BSA a 4 °C per 1 ora.</li>
	<li>Inoculare lo pseudovirus e la miscela di siero (100 μL) sul monostrato MDCK e incubarlo a 4 °C per 2 ore.</li>
	<li>Lavare la piastra cellulare 4 volte con PBS contenente l'1% di BSA per rimuovere qualsiasi virus non legato.</li>
	<li>Lisare le cellule con 100 μL di tampone di lisi luciferasi a RT per 30 minuti.</li>
	<li>Quantificare la quantità di virus legato sulle cellule con un kit ELISA HIV-1 p24 come descritto sopra (paragrafo 2.3).</li>
</ol>7. Valutazione dell'ingresso virale
<ol><li>Effettuare sospensioni a cella singola di cellule MDCK (5 x 104 per ml) in mezzo DMEM completo e aggiungere 100 μL della sospensione cellulare a ciascun pozzetto di una piastra a fondo piatto a 96 pozzetti. Incubare le cellule a 37 °C, 5% CO2 per 20 ore prima del test.</li>
	<li>Inoculare lo pseudovirus (100 μL) su un monostrato MDCK in una piastra da 96 pozzetti a 4 °C per 6 ore.</li>
	<li>Lavare la piastra cellulare 4 volte con PBS contenente l'1% di BSA per rimuovere gli pseudovirus non legati.</li>
	<li>Aggiungere 100 μL dei sieri o sieri immunitari diluiti in serie da topi con vaccinazione fittizia in DMEM contenente l'1% di BSA al monostrato e incubare la cellula a 4 °C per 2 ore.</li>
	<li>Rimuovere il surnatante cellulare e lavare la piastra di coltura cellulare 4 volte con PBS contenente BSA all'1%.</li>
	<li>Aggiungere DMEM fresco alle cellule e incubare per 60 ore in un incubatore a 37 °C, 5% CO2 .</li>
	<li>Misurare l'attività relativa della luciferasi (RLA) delle cellule come descritto nei passaggi 3.7-3.12. NOTA: L'ingresso virale, come indicato da RLA, è stato espresso come percentuale della lettura ottenuta in assenza di sieri, che è stata impostata come 100%.</li>
</ol>

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<li>Corning 96-Well Solid Black or White Polystyrene Microplates. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates">https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates</a> (2021).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

HEK293FT cellule sono solitamente utilizzate come cellule di imballaggio per produrre pseudovirus. Il rilevamento regolare del micoplasma è essenziale durante la coltura cellulare. La contaminazione da micoplasma può ridurre drasticamente i raccolti di pseudovirus e talvolta vicino allo zero. Rispetto ad altre contaminazioni, le contaminazioni da micoplasma non portano a variazioni del valore del pH o torbidità del terreno di coltura cellulare. Anche un'alta concentrazione di micoplasma non è visibile ad occhio nudo o al...

Dal 1996, i virus H5 dell'influenza aviaria ad alta patogenicità (HPAI) del lignaggio A/goose/Guangdong/1/96 hanno causato continue epidemie di influenza nel pollame e negli uccelli selvatici, causando enormi perdite socio-economiche nell'industria avicola globale. A volte, anche gli esseri umani vengono infettati da esso, di fronte ad un alto tasso di mortalità 1,2. Tuttavia, la ricerca sul virus HPAI è spesso ostacolata, dato che non può essere gestita al di fuori dei laboratori di livello 3 di biosicurezza. Per affrontare questo problema, gli pseudovirus sono adottati come alternativa ai virus wild-type in alcuni esperimenti di studi H5 HPAI. Gli pseudovirus sono abbastanza sicuri da essere praticati nei laboratori di livello 2 di biosicurezza.
Gli pseudovirus H5 HPAI appartengono a virus chimerici costituiti da nuclei di virus surrogati, involucri lipidici con glicoproteine superficiali da virus influenzali e geni reporter. I nuclei di pseudovirus sono solitamente derivati dal virus dell'immunodeficienza umana lentivirale (HIV), dai retrovirus come il virus della leucemia murina (MLV) e dal virus della stomatite vescicolare (VSV)3. In particolare, il sistema di confezionamento dell'HIV-1 è ampiamente utilizzato per produrre pseudovirus influenzale, dove i geni primari forniti sono gag e pol. Il gene del bavaglio dell'HIV esprime le proteine di base. Il gene pol esprime l'integrasi e la trascrittasi inversa, entrambe necessarie per l'espressione del gene reporter nelle cellule trasdotte. Imitando il genoma del virus surrogato, il gene reporter è abbracciato nel nucleo dello pseudovirus in forma di RNA. Il gene reporter esprimerà la proteina nelle cellule ospiti. I livelli di espressione genica dei geni reporter possono essere utilizzati per misurare l'efficienza dell'infezione da pseudovirus 3,4. Il reporter principale è la lucciola luciferasi per misurare le unità di luminescenza relativa (RLU) o l'attività relativa della luciferasi (RLA) nelle cellule trasdotte. Vengono utilizzati anche altri reporter come lacZ, Gaussia e Renilla luciferasi, solo in misura minore5.
Gli pseudovirus sono strumenti ideali per studiare gli anticorpi neutralizzanti contro i virus HAPI H5. Per misurare la potenza degli anticorpi neutralizzanti, vengono utilizzati i saggi di neutralizzazione dello pseudovirus (PN)6. L'emoagglutinina (HA) e la neuraminidasi (NA) sono glicoproteine sulla superficie del virus dell'influenza A 7,8. L'HA è composto da un dominio globulare per il legame del recettore e un dominio dello stelo per la fusione della membrana. La proteina NA ha l'attività sialidasi per facilitare il rilascio del virus 7,8. Un test PN può misurare gli anticorpi neutralizzanti diretti alle proteine HA. Gli anticorpi neutralizzanti diretti alla testa e alla regione dello stelo dell'HA possono anche essere rilevati mediante test di attaccamento virale e di ingresso. Rispetto ai virus wild-type, gli esperimenti di neutralizzazione degli pseudovirus hanno valori di rilevamento più sensibili, possono essere gestiti in modo sicuro in un laboratorio di biosicurezza di livello 2 e sono generalmente più facili da utilizzare nella pratica.
Questo protocollo presenta in dettaglio le procedure e le fasi critiche dei preparati di pseudovirus H5 HPAI e dei saggi PN. Inoltre, discute la risoluzione dei problemi, la limitazione e le modifiche di questi test. In questo studio, il ceppo A/Thailand/1(KAN)-1/2004(TH) dei virus HPAI H5N1 è stato utilizzato come esempio. Per ottenere i sieri immunitari utilizzati nei saggi, questo protocollo ha selezionato la proteina HA proveniente dal ceppo TH come immunogeno per immunizzare i topi.

<table><tbody><tr><td>1% Chiken Erythrocyte</td><td>Bio-channel</td><td>BC-RBC-C001</td><td>Reagente</td></tr><tr><td>Piastre per colture cellulari a 96 pozzetti (fondo piatto)</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>167008</td><td>materiale di consumo</td></tr><tr><td>Piastre per colture cellulari a 96 pozzetti (fondo tondo)</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>163320</td><td>materiale di consumo</td></tr><tr><td>Allegra X-15R</td><td>Beckman coltro</td><td>--</td><td>Attrezzatura/Centrifuga</td></tr><tr><td>Siringhe da insulina BD</td><td></td><td>BD 324910</td><td>materiale di consumo</td></tr><tr><td>Cloruro di calcio anidro</td><td>AMRESCO</td><td>1B1110-500G</td><td>Reagente</td></tr><tr><td>clorochina difosfato</td><td>Selleck</td><td>S4157</td><td>Reagente</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Medium Eagle modificato (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>12100-046</td><td>Reagente</td></tr><tr><td>Fetale Siero bovino</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td>Reagente</td></tr><tr><td>HEK293FT</td><td>Gibco</td><td>R700-07</td><td>Linea cellulare</td></tr><tr><td>HEPES FREE ACID</td><td>AMRESCO</td><td>0511-250G</td><td>Reagente</td></tr><tr><td>HIV-1 p24 Antigene ELISA</td><td>ZeptoMetrix</td><td>801111</td><td>Kit di reagenti</td></tr><tr><td>Luciferase Assay System Freezer Confezione</td><td>Promega</td><td>E4530</td><td>Kit di reagenti</td></tr><tr><td>MDCK.1</td><td>ATCC</td><td>CRL-2935</td><td>Linea cellulare</td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga 1,5 mL</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>509-GRD-Q</td><td>materiale di consumo</td></tr><tr><td>Nunc Provette per centrifuga coniche 15 mL</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>339650</td><td>materiale di consumo</td></tr><tr><td>Nunc Provette per centrifuga coniche 50 mL</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>339652</td><td>materiale di consumo</td></tr><tr><td>Nunc EasYFlask 75 cm2Thermo</td> <td>fisher scientific</td><td>156499</td><td>materiale di consumo</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Reagente</td></tr><tr><td>Puntali per pipette (10 &mu; L)</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>TF102-10-Q</td><td>materiale di consumo</td></tr><tr><td>Puntali per pipette (100 &mu; L)</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>TF113-100-Q</td><td>materiale di consumo</td></tr><tr><td>Puntali per pipette (1000 &mu; L)</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>TF112-1000-Q</td><td>materiale di consumo</td></tr><tr><td>Pipette sierologiche (5 mL)</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>170355N</td><td>materiale di consumo</td></tr><tr><td>Pipette sierologiche (10 mL)</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>170356N</td><td>materiale di consumo</td></tr><tr><td>Tripsina/EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-072</td><td>Reagente</td></tr><tr><td>Varioskan Flash</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>--</td><td>Attrezzature/Lettore di micropiastre</td></tr><tr><td>Camicia d'acqua Incubatore</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>3111</td><td>Attrezzature/Incubatore cellulare</td></tr><tr><td>Pentobarbital sale sodico</td><td>Sigma</td><td>57-33-0</td><td>Reagente</td></tr></tbody></table>

preparazione di virus dell'influenza aviaria h5 pseudo-tipizzati con metodo di trasfezione del fosfato di calcio e misurazione dell'attività neutralizzante degli anticorpi

Preparation of Pseudo-Typed H5 Avian Influenza Viruses with Calcium Phosphate Transfection Method and Measurement of Antibody Neutralizing Activity

Dal 1996, i virus H5 dell'influenza aviaria ad alta patogenicità (HPAI) del lignaggio A/goose/Guangdong/1/96 hanno causato epidemie influenzali nel pollame e negli uccelli selvatici. Occasionalmente, anche gli esseri umani ne sono vittime, il che si traduce in un'alta mortalità. Tuttavia, la ricerca sui virus HPAI è spesso ostacolata, considerando che deve essere gestita all'interno di laboratori di livello 3 di biosicurezza. Per affrontare questo problema, gli pseudovirus sono adottati come alternativa ai virus wild-type in alcuni esperimenti di studi H5 HPAI. Gli pseudovirus si dimostrano gli strumenti ideali per studiare gli anticorpi neutralizzanti contro i virus H5 HPAI. Questo protocollo descrive le procedure e le fasi critiche dei preparativi di pseudovirus H5 HPAI e dei saggi di neutralizzazione degli pseudovirus. Inoltre, discute la risoluzione dei problemi, la limitazione e le modifiche di questi test.

Espressione delle proteine p24 di HA, NA e HIV-1 dello pseudovirus influenzale Per identificare l'efficienza del confezionamento virale, le scorte di pseudovirus influenzali sono state rilevate per la prima volta mediante saggio HA (Figura 2A). Le unità HA per millilitro di pseudovirus influenzali sono 643 (Tabella 3). Il saggio western-blot e i saggi ELISA sandwich sono stati utilizzati per testare l'espressione delle proteine p24 di HA, NA e HIV-1. Quin...

Qui descriviamo un protocollo per il confezionamento di pseudovirus e la misurazione dell'attività neutralizzante degli anticorpi.

Preparazione di virus dell'influenza aviaria H5 pseudo-tipizzati con metodo di trasfezione del fosfato di calcio e misurazione dell'attività neutralizzante degli anticorpi

Since 1996, A/goose/Guangdong/1/96-lineage highly pathogenic avian influenza (HPAI) H5 viruses have been causing flu outbreaks in poultry and wild birds. ...

Questo protocollo descrive le procedure e le fasi critiche dei preparativi di pseudovirus dell'influenza aviaria ad alta patogenicità H5 e dei saggi di neutralizzazione degli pseudo virus. Inoltre, discute la limitazione della risoluzione dei problemi e le modifiche di questi test. Gli agenti patogeni altamente patogeni devono essere effettuati nel laboratorio di biosicurezza di livello tre, mentre gli pseudo virus possono essere gestiti in modo sicuro in un laboratorio di biosicurezza di livello due.Per iniziare, effettuare una sospensione a cella singola di celle HEK293 FT in un mezzo DMEM completo. Aggiungere 10 millilitri della sospensione a cella singola in un pallone T75, seguito dall'incubazione a 37 gradi Celsius. Due ore prima della trasfezione, sostituire il vecchio mezzo con 10 millilitri di mezzo completo fresco con clorochina.Mescolare i reagenti e il DNA plasmidico come descritto nel manoscritto, quindi trasferire questa miscela nel mezzo sopra le cellule e oscillare delicatamente. Dopo l'incubazione, sostituire il mezzo con 15 millilitri di mezzo DMEM completo fresco. Dopo 65 ore, raccogliere il surnatante mediante centrifugazione.Raccogli il surnatante e aliquotalo.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Fonte: Chang, X., et al. Preparazione di virus pseudo-tipizzati dell'influenza aviaria H5 mediante metodo di trasfezione con fosfato di calcio e misurazione dell'attività neutralizzante degli anticorpi. J. Vis. Exp. (2021)Questo video illustra la produzione di pseudovirus influenzali in cellule umane mediante trasfezione di plasmidi mediata da fosfato di calcio, consentendo la generazione sicura di particelle virali a ciclo singolo per applicazioni successive, come saggi di neutralizzazione...

Produzione di pseudovirus tramite trasfezione di plasmidi in cellule umane

Source: Chang, X., et al. Preparation of Pseudo-Typed H5 Avian Influenza Viruses with Calcium Phosphate Transfection Method and Measurement of Antibody Neutralizing Activity. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates a luciferase-based pseudovirus titration assay to determine the optimal target cell density for maximum infection. By comparing luminescence across cell densities, the method ensures high assay sensitivity and reproducibility for downstream applications.

Determining Optimal Target Cell Density Using a Luciferase-Based Pseudovirus Infection Assay

Source: Chang, X., et al. Preparation of Pseudo-Typed H5 Avian Influenza Viruses with Calcium Phosphate Transfection Method and Measurement of Antibody Neutralizing Activity. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates a luciferase-based assay to quantify pseudovirus infection in epithelial cells. The pseudovirus encodes the luciferase gene, which is expressed in infected cells. After washing, and cells are incubated with lysis buffer at an ultra-low temperature, and then thawed to induce lysis.

Assessing Pseudovirus Infection Using Luciferase Reporter Assay

Questo video mostra saggi di microneutralizzazione per misurare gli anticorpi neutralizzanti utilizzando cellule renali canine Madin-Darby che sovraesprimono l'acido sialico legato all'α2,6 in sieri umani. Questo test è spesso utilizzato per la sierologia umana...

Un test di microneutralizzazione per misurare i titoli anticorpali neutralizzanti nel siero umano

Questo video mostra una tecnica per generare varianti di fuga di anticorpi monoclonali neutralizzanti del virus dell'influenza. La sospensione virale neutralizzata con anticorpi viene iniettata nelle uova di gallina embrionate per propagare selettivamente le varianti di fuga. Ciò si traduce in una popolazione virale prevalentemente di varianti di fuga, confermata tramite un test di emoagglutinazione.

Generazione di varianti di fuga dal virus dell'influenza contro gli anticorpi neutralizzanti

Questo studio descrive un   di imaging basata su test di micro-neutralizzazione per analizzare le relazioni antigeniche tra virus. Il protocollo impiega uno scanner piano ed ha quattro fasi, tra cui la titolazione, la titolazione quantificazione, neutralizzazione, e la neutralizzazione quantificazione. Il test funziona bene con corrente circolante pdm09 influenza A (H1N1), A (H3N2), e virus B.

Ottimizzazione di un Quantitative Micro-neutralizzazione Assay

Influenza A virus (IAVs) è importanti patogeni respiratori umani. Per capire la patogenicità di IAVs e per eseguire test preclinici di approcci vaccinali romanzo, modelli animali che imita la fisiologia umana sono necessari. Qui, descriviamo le tecniche per valutare IAV patogenesi, le risposte umorali e l'efficacia del vaccino utilizzando un modello murino di infezione.

Studi del Virus di riossidazione A in un modello murino di infezione

Descriviamo un metodo con cui identifichiamo residui critici necessari per l'associazione di anticorpi monoclonali umani o murini destinati l'emoagglutinina virale del virus di riossidazione A. Il protocollo può essere adattato ad altre glicoproteine di superficie del virus e loro corrispondenti anticorpi neutralizzanti.

Generazione di varianti di fuga di neutralizzare l'Influenza Virus anticorpi monoclonali

Anticorpi neutralizzanti l'influenza correlano con protezione delle infezioni influenzali. Saggi microneutralization misurano anticorpi neutralizzanti nel siero umano e sono spesso utilizzati per sierologia umana dell'influenza. Descriviamo un dosaggio di microneutralization usando le cellule MDCK-SIAT1 per misurare i titoli dell'anticorpo neutralizzante ai virus contemporaneo di A(H3N2) di 3C.2a e 3C.3a dopo la vaccinazione contro l'influenza o infezione.

Neutralizzando le risposte dell'anticorpo al virus A(H3N2) in sieri umani di Microneutralization l'Influenza di misurazione analisi utilizzando cellule MDCK-SIAT1

Questo protocollo descrive un processo sperimentale per produrre particelle pseudotimi virali infettive ad alto tipo (pp) con glicoproteine da due ceppi influenzali A e come determinarne l'infettività. Questo protocollo è altamente adattabile per sviluppare pps di qualsiasi altro tipo di virus avvolto con diversi glicoproteine busta.

Produzione di particelle pseudotioniche di influenza ad alto livello con le legiole di busta dei virus altamente patogeni H5N1 e Avian H7N9

Il protocollo descrive un metodo per la coltura di cellule T aviarie in vitro isolando le cellule T di memoria da anatre infette, consentendo la generazione di cellule T specifiche di anatra altamente purificate. Inoltre, è stato stabilito un metodo di colorazione intracellulare delle citochine (ICS) per misurare con precisione la secrezione di IFN-γ nelle cellule T di anatra.

In vitro Coltura per cellule T di anatra specifiche per H5N1 e rilevamento delle risposte immunitarie utilizzando il metodo di colorazione delle citochine intracellulari

Impara a preparare pseudovirus dell'influenza aviaria H5 con trasfezione al fosfato di calcio e a misurare l'attività neutralizzante degli anticorpi. Questo metodo facilita lo sviluppo di vaccini.

Preparazione di virus dellinfluenza aviaria H5 pseudo-tipizzati con metodo di trasfezione del fosfato di calcio e misurazione dellattività neutralizzante degli anticorpi (Video) | JoVE Journal

Preparazione di virus dell'influenza aviaria H5 pseudo-tipizzati con metodo di trasfezione del fosfato di calcio e misurazione dell'attività neutralizzante degli anticorpi

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