Name: Profilazione spaziale dellespressione di proteine e RNA nei tessuti: un approccio alla messa a punto della microdissezione virtuale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Impara a selezionare regioni di interesse per tecnologie di omica spaziale utilizzando protocolli automatizzati. Questo metodo migliora la caratterizzazione dei tessuti e il profiling di popolazioni cellulari specifiche con maggiore riproducibilità.

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Gli autori riconoscono a Thomas Wu l'elaborazione dei file NGS. Ringraziamo James Ziai per le discussioni sui risultati e la revisione del manoscritto e Meredith Triplet e Rachel Taylor per la revisione interna del manoscritto.

Tutti i tessuti umani sono stati acquisiti da biobanche commerciali o banche di tessuti accreditate con la garanzia che sono stati ottenuti l'approvazione appropriata del Comitato di revisione istituzionale e il consenso informato.
NOTA: il protocollo viene eseguito utilizzando Discovery Ultra e GeoMx Digital Spatial Profiler. Vedere la tabella dei materiali per i dettagli su reagenti, apparecchiature e software utilizzati in questo protocollo.
1. Protocollo di visualizzazione automatizzata per saggi di proteomica spaziale
<ol><li>Programma autostainer per applicare anticorpi di visualizzazione fluorescente<ol><li>Nel software autostainer, fare clic sul pulsante Home e scegliere Protocolli. Quindi, fare clic su Crea / Modifica protocolli e selezionare RUO DISCOVERY Universal come procedura.</li>
		<li>Fare clic su Prima sequenza > Deparaffinizzazione > Depar v2. Per Temperatura media, scegliere 72 ° C, quindi fare clic su Pretrattamento e selezionare Condizionamento cellulare e CC1 Reservoir. Per Temperatura molto elevata, scegliere 100 ° C, quindi fare clic su CC1 8 Min e continuare a fare clic fino a selezionare CC1 64 Min.</li>
		<li>Fare clic su Inibitore > Inibitore DISCOVERY e, per Tempo di incubazione, scegliere 8 minuti. Quindi, fare clic su Anticorpo > Incubazione Ab ad alta temperatura; per Bassa temperatura, scegli 37 ° C; per Anticorpo, scegliere il numero di anticorpi dall'etichetta del distributore (Anticorpo 6 in questo esempio); per Plus Incubation Time, selezionare 32 minuti. NOTA: Questo protocollo ha tre diversi numeri di anticorpi. Il primo anticorpo è FAP, il secondo è Pan-citocheratina e il terzo è Anticorpo X.</li>
		<li>Fare clic su Multimer HRP > Multimer HRP Blocker, quindi per Antibody Blocking, scegliere Gt Ig Block, e per Tempo di incubazione, scegliere 4 minuti. Quindi, su Multimer HRP Reagent, selezionare OMap anti-Rb HRP e, per Tempo di incubazione, scegliere 16 minuti. Quindi, fai clic su Cy5 e, per Tempo di incubazione lungo, scegli 0 Hr 8 Min.</li>
		<li>Fare clic su Doppia sequenza e scegliere Denaturazione anticorpale, quindi selezionare Denatura anticorpale CC2-1 e, per Temperatura molto elevata, scegliere 100 ° C. Assicurarsi che il tempo di incubazione sia di 8 minuti. Quindi, fare clic su DS Inhibitor e selezionare Neutralizza.</li>
		<li>Fare clic su Anticorpo DS e, per Temperatura molto bassa, scegliere 37 ° C. Quindi, in Anticorpo, scegliere il numero di anticorpi dall'etichetta del distributore (Anticorpo 3 in questo esempio) e per Plus Incubation Time, selezionare 32 minuti.</li>
		<li>Fare clic su DS Multimer HRP e scegliere DS Multimer HRP Blocker. Quindi, per Blocco anticorpi, selezionare Gt Ig Block e per Tempo di incubazione, scegliere 4 minuti. Quindi, su Multimer HRP Reagent, selezionare OMap anti-Ms HRP e, per Tempo di incubazione, scegliere 16 minuti. Quindi, fai clic su DS Rhodamine 6G e, per un lungo tempo di incubazione, scegli 0 Hr 8 Min.</li>
		<li>Fare clic su Triple Stain e selezionare TS Antibody Denaturation, quindi selezionare Antibody Denature CC2-2 e, per Very High Temperature, selezionare 100 ° C. Assicurarsi che il tempo di incubazione sia di 8 minuti. Quindi, fare clic su TS Inhibitor e selezionare TS Neutralize.</li>
		<li>Fare clic su Anticorpo TS e, per Temperatura molto bassa, selezionare 37 ° C. Quindi, in Anticorpo, selezionare il numero di anticorpi dall'etichetta del distributore (Anticorpo 7 in questo esempio) e per Plus Incubation Time, selezionare 32 minuti.</li>
		<li>Fare clic su TS Multimer HRP e scegliere TS Multimer HRP Blocker. Quindi, per Blocco anticorpi, selezionare Gt Ig Block e per Tempo di incubazione, scegliere 4 minuti. Quindi, su Multimer HRP Reagent, selezionare OMap anti-Rb HRP e, per Tempo di incubazione, scegliere 16 minuti. Quindi, fai clic su TS FAM e, per Tempo di incubazione lungo, scegli 0 Hr 8 Min.</li>
		<li>Aggiungere un titolo al protocollo. Seleziona un numero di protocollo, aggiungi un commento e fai clic su Attivo seguito da Salva.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparare diapositive, stampare etichette e avviare l'esecuzione dell'autostainer<ol><li>Il fornitore di prodotti da forno ha acquistato sezioni di tessuto umano FFPE (fissate in formalina, incorporate in paraffina) in un forno impostato a 70 °C per 20-60 minuti. Mentre le diapositive cuociono, stampa le etichette facendo clic su Crea etichetta nel software autostainer. Quindi, fare clic su Protocolli, selezionare il numero di protocollo e fare clic su Chiudi / Stampa. Aggiungere le informazioni pertinenti sull'etichetta della diapositiva e fare clic su Stampa.</li>
		<li>Rimuovere i vetrini dal forno e lasciarli raffreddare a temperatura ambiente (RT). Applicare le etichette di protocollo stampate in precedenza alle diapositive corrispondenti.</li>
		<li>Caricare distributori di anticorpi ricaricabili con anticorpi in base al numero di etichetta dell'anticorpo assegnato al punto 1.1. In questo protocollo, utilizzare l'anticorpo 6 per FAP a 1 μg / ml, utilizzare l'anticorpo 3 per pan-citocheratina a 0,1 μg / ml e utilizzare l'anticorpo 7 per l'anticorpo X a 2,5 μg / ml. Diluire ciascun anticorpo nel diluente specificato e innescare i distributori di anticorpi ricaricabili.</li>
		<li>Raccogliere i distributori di reagenti preriempiti di blocco, rilevamento e amplificazione sopra menzionati e posizionarli su un vassoio di reagenti. Caricare le diapositive nei vassoi delle diapositive (fino a 30 diapositive per esecuzione) e fare clic su In esecuzione seguito da Sì. Si noti che DAPI non viene utilizzato per la controcolorazione nucleare.</li>
		<li>Confermare l'inizio dell'esecuzione controllando la durata dell'esecuzione sul software autostainer. Il protocollo richiede ~ 11 h per il completamento e può essere eseguito durante la notte.</li>
		<li>Il giorno successivo, assicurarsi del completamento della corsa osservando le luci lampeggianti verdi sugli slot del vassoio di scorrimento. Quindi, togliere i vetrini dallo strumento e sciacquarli energicamente in 1x tampone di reazione fino a quando la soluzione liquida di coprislip non viene completamente rimossa.</li>
	</ol></li>
	<li>Protocollo della piattaforma di profilazione spaziale per il saggio di proteomica<ol><li>Seguire il protocollo di proteomica spaziale indicato nella nota sottostante. Includere le seguenti modifiche al protocollo per abilitare la procedura di etichettatura automatizzata 3-plex.</li>
		<li>Eseguire i passaggi 1.2.1-1.2.6 il giorno prima di iniziare il protocollo di proteomica spaziale e passare direttamente alla fase di recupero dell'antigene del protocollo di proteomica spaziale dopo aver eseguito il passaggio 1.2.6. Omettere la procedura di visualizzazione descritta nel protocollo di proteomica di profilazione spaziale.</li>
		<li>Sostituire SYTO 13 con SYTO 64 a 5000 nM per consentire l'integrazione dei fluorofori. Diluire SYTO 64 in 1x TBS e incubare in una camera di umidità per 15 min.</li>
		<li>Quando si impostano i parametri di scansione nella piattaforma di profilazione spaziale, selezionare i filtri e i canali di messa a fuoco in base ai fluorofori utilizzati nel pannello di visualizzazione per consentire l'integrazione di 3-plex. Utilizzare FITC per DISCOVERY FAM e impostare l'esposizione a 200 ms, utilizzare Cy3 per DISCOVERY Rhodamine 6G e impostare l'esposizione su 200 ms, utilizzare Texas Red per SYTO 64 e impostare l'esposizione su 50 ms (specificare questo come canale di messa a fuoco) e, infine, utilizzare Cy5 per DISCOVERY Cy5, impostare l'esposizione su 200 ms, e salvare le modifiche. NOTA: le istruzioni dettagliate del protocollo di proteomica di profilazione spaziale si trovano nella scheda Supporto del sito Web ufficiale selezionando Documentazione > Manuali utente. Qui, cerca il protocollo proteico per nCounter usando Bond RX.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Selezione del ROI per i saggi di trascrittomica spaziale
<ol><li>Cuocere le sezioni di pellet a celle FFPE in forno impostato a 70 °C per 20-60 min. Seguire il protocollo NGS della piattaforma di profilazione spaziale indicato nella nota sottostante e scansionare le diapositive sulla piattaforma di profilazione spaziale, selezionando dimensioni di 50 μm e 300 μm. La seguente raccomandazione è evidenziata per il saggio di trascrittomica spaziale:<ol><li>Quando si prepara la libreria, se sono state selezionate varie dimensioni di ROI, raggruppare ROI di dimensioni simili per creare una libreria per dimensione. Questo per garantire che vengano raggiunte profondità di sequenziamento sufficienti per tutti i ROI senza distorsioni dalle dimensioni. NOTA: le istruzioni dettagliate della piattaforma di profilazione spaziale si trovano nella scheda Supporto del sito Web ufficiale selezionando Documentazione > Manuali utente. Qui, cerca il protocollo RNA per applicazioni NGS utilizzando Bond RX.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Nerurkar, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+spatial+profiling+of+cancer+tissues+in+the+era+of+immunotherapy%3A+The+potential+and+promise%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Transcriptional spatial profiling of cancer tissues in the era of immunotherapy: The potential and promise.</a> Cancers. 12 (9), 2572(2020).</li>
<li>Decalf, J., Albert, M. L., Ziai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+pathology%3A+a+user%27s+review+of+a+highly+multiplexed+method+for+in+situ+analysis+of+protein+and+RNA+expression+in+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">New tools for pathology: a user's review of a highly multiplexed method for in situ analysis of protein and RNA expression in tissue.</a> Journal of Pathology. 247 (5), 650-661 (2019).</li>
<li>McGinnis, L. M., Ibarra-Lopez, V., Rost, S., Ziai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+research+applications+of+multiplexed+immunohistochemistry+and+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Clinical and research applications of multiplexed immunohistochemistry and in situ hybridization.</a> Journal of Pathology. 254 (4), 405-417 (2021).</li>
<li>NanoString. GeoMx Digital Spatial Profiler. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://nanostring.com/products/geomx-digital-spatial-profiler/geomx-dsp-overview">https://nanostring.com/products/geomx-digital-spatial-profiler/geomx-dsp-overview</a> (2022).</li>
<li>NanoString. GeoMx Digital Spatial Profiler. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://nanostring.com/wp-content/uploads/BR_MK0981_GeoMx_Brochure_r19_FINAL_Single_WEB.pdf">https://nanostring.com/wp-content/uploads/BR_MK0981_GeoMx_Brochure_r19_FINAL_Single_WEB.pdf</a> (2022).</li>
<li>McCart Reed, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+spatial+profiling+application+in+breast+cancer%3A+a+user%27s+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Arch%3A+An+International+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Digital spatial profiling application in breast cancer: a user's perspective.</a> Virchows Arch: An International Journal of Pathology. 477 (6), 885-890 (2020).</li>
<li>McNamara, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+proteomic+characterization+of+HER2-positive+breast+tumors+through+neoadjuvant+therapy+predicts+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cancer%22%5BJournal%5D)">Spatial proteomic characterization of HER2-positive breast tumors through neoadjuvant therapy predicts response.</a> Nature Cancer. 2 (4), 400-413 (2021).</li>
<li>Kim, S. W., Roh, J., Park, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry+for+pathologists%3A+Protocols%2C+pitfalls%2C+and+tips%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology+and+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry for pathologists: Protocols, pitfalls, and tips.</a> Journal of Pathology and Translational Medicine. 50 (6), 411-418 (2016).</li>
<li>Muñoz, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecularly+targeted+photothermal+ablation+improves+tumor+specificity+and+immune+modulation+in+a+rat+model+of+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecularly targeted photothermal ablation improves tumor specificity and immune modulation in a rat model of hepatocellular carcinoma.</a> Communications Biology. 3 (1), 783(2020).</li>
<li>Coleman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronidase+impairs+neutrophil+function+and+promotes+Group+B+Streptococcus+invasion+and+preterm+labor+in+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Hyaluronidase impairs neutrophil function and promotes Group B Streptococcus invasion and preterm labor in nonhuman primates.</a> mBio. 12 (1), 03115-03120 (2021).</li>
<li>Gupta, S., Zugazagoitia, J., Martinez-Morilla, S., Fuhrman, K., Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+quantitative+assessment+of+PD-L1+using+digital+spatial+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%3B+A+Journal+of+Technical+Methods+and+Pathology%22%5BJournal%5D)">Digital quantitative assessment of PD-L1 using digital spatial profiling.</a> Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 100 (10), 1311-1317 (2020).</li>
<li>Carter, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+and+spatially+defined+immune+%28micro%29landscapes+of+early-stage+PD-L1-positive+triple-negative+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Characteristics and spatially defined immune (micro)landscapes of early-stage PD-L1-positive triple-negative breast cancer.</a> Clinical Cancer Research. 27 (20), 5628-5637 (2021).</li>
<li>Busse, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoprofiling+in+neuroendocrine+neoplasms+unveil+immunosuppressive+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Immunoprofiling in neuroendocrine neoplasms unveil immunosuppressive microenvironment.</a> Cancers. 12 (11), 3448(2020).</li>
<li>Kulasinghe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+lung+SARS-CoV-2+and+influenza+virus+infection+dissects+virus-specific+host+responses+and+gene+signatures%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Profiling of lung SARS-CoV-2 and influenza virus infection dissects virus-specific host responses and gene signatures.</a> European Respiratory Journal. 59 (1), (2021).</li>
<li>Li, X., Wang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+bulk%2C+single-cell+to+spatial+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Oral+Science%22%5BJournal%5D)">From bulk, single-cell to spatial RNA sequencing.</a> International Journal of Oral Science. 13 (36), (2021).</li>
<li>Merritt, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+digital+spatial+profiling+of+proteins+and+RNA+in+fixed+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue.</a> Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).</li>
<li>Van, T. M., Blank, C. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+user%27s+perspective+on+GeoMxTM+digital+spatial+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Immuno-Oncology+Technology%22%5BJournal%5D)">A user's perspective on GeoMxTM digital spatial profiling.</a> Immuno-Oncology Technology. 1, 11-18 (2019).</li>
<li>Introduction to GeoMx Normalization: Protein. White Paper. Nanostring. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://nanostring.com/wp-content/uploads/MK2593_GeoMx_Normalization-Protein.pdf">https://nanostring.com/wp-content/uploads/MK2593_GeoMx_Normalization-Protein.pdf</a> (2020).</li>
<li>Bergholtz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+practices+for+spatial+profiling+for+breast+cancer+research+with+the+geomx+spatial+profiler%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Best practices for spatial profiling for breast cancer research with the geomx spatial profiler.</a> Cancers. 13 (17), 4456(2021).</li>
<li>Hwang, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+and+spatial+transcriptomics+of+archival+pancreatic+cancer+reveals+multi-compartment+reprogramming+after+neoadjuvant+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus and spatial transcriptomics of archival pancreatic cancer reveals multi-compartment reprogramming after neoadjuvant treatment.</a> BioRxiv. , (2020).</li>
<li>Jerby-Arnon, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+immune+and+genetic+mechanisms+shape+oncogenic+programs+in+synovial+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Opposing immune and genetic mechanisms shape oncogenic programs in synovial sarcoma.</a> Nature Medicine. 27 (2), 289-300 (2021).</li>
</ol>

Veronica Ibarra-Lopez, Sangeeta Jayakar, Yeqing Angela Yang, Zora Modrusan e Sandra Rost sono dipendenti e azionisti di Genentech, membro del Gruppo Roche. Altre aziende che fanno parte di Roche producono reagenti e strumenti utilizzati in questo manoscritto. Ciara Martin è una dipendente a tempo pieno di NanoString Technologies Inc, che produce reagenti e strumenti utilizzati in questo manoscritto.

Ad oggi, gli anticorpi fluorescenti direttamente coniugati in un protocollo manuale sono più comunemente usati come pannelli di visualizzazione per la proteomica spaziale o saggi di trascrittomica spaziale 9,10. Tuttavia, l'uso di anticorpi fluorescenti direttamente coniugati può essere difficile per marcatori meno abbondanti, limitando la selezione di anticorpi adatti. Questo protocollo mostra che l'etichettatura dei marcatori di visualizzazione può essere autom...

I progressi nelle tecniche di multiplexing continuano a fornire migliori strumenti di caratterizzazione per i bersagli presenti nei tumori. Il microambiente tumorale (TME) è un sistema complesso di cellule tumorali, cellule immunitarie infiltranti e stroma, in cui le informazioni spaziali sono fondamentali per comprendere e interpretare meglio i meccanismi di interazione tra biomarcatori di interesse1. Con tecniche emergenti come GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) e 10x Visium, è possibile rilevare e quantificare contemporaneamente più target all'interno del loro contesto spaziale. L'uso di protocolli di immunofluorescenza che facilitano la visualizzazione dei tessuti può migliorare ulteriormente le capacità di profilazione spaziale di queste tecnologie.
La tecnologia Spatial Omics su cui ci siamo concentrati per lo sviluppo di questo metodo consiste in saggi di proteomica spaziale e trascrittomica in cui gli oligonucleotidi sono attaccati ad anticorpi o sonde di RNA tramite un linker fotocliviale sensibile ai raggi UV. I vetrini istologici sono etichettati con questi anticorpi o sonde oligo-coniugati e quindi visualizzati sulla piattaforma di profilazione spaziale. Successivamente, vengono selezionati ROI di diverse dimensioni e forme per l'illuminazione e gli oligonucleotidi fotoscissi vengono aspirati e raccolti in una piastra da 96 pozzetti. Gli oligonucleotidi fotoscissi sono preparati per essere quantificati con il sistema Nanostring nCounter o Next Generation Sequencing (NGS)2,3 (Figura 1)4,5.
Le distribuzioni cellulari variano all'interno dei tessuti e la capacità di caratterizzare posizioni specifiche delle cellule utilizzando marcatori selezionati e diverse dimensioni del ROI è di grande importanza per comprendere appieno l'ambiente tissutale e identificare caratteristiche specifiche. Nella tecnologia Spatial Omics qui menzionata, il protocollo di visualizzazione standard utilizza anticorpi coniugati direttamente ed è un protocollo manuale. I marcatori standard per distinguere tra tumore e stroma sono panCytokeratin (panCK) e CD456,7, ma sono necessari ulteriori marcatori per indirizzare specifiche popolazioni cellulari di interesse. Inoltre, l'uso di anticorpi fluorescenti direttamente coniugati manca di amplificazione, il che limita la selezione degli anticorpi a marcatori abbondanti. Inoltre, i saggi manuali sono soggetti a una maggiore variabilità rispetto ai flussi di lavoro automatizzati8. Pertanto, è auspicabile disporre di un protocollo di visualizzazione personalizzabile, automatizzato e amplificato per la selezione del ROI.
Qui, lo studio dimostra che, per i saggi di proteomica spaziale, la tecnologia TSA può essere utilizzata per protocolli di visualizzazione su una piattaforma automatizzata con conseguente test più mirato e standardizzato. Inoltre, i saggi basati su TSA consentono l'uso di marcatori a bassa espressione, aumentando la gamma di obiettivi che possono essere selezionati per la visualizzazione. Un test 3-plex per panCK, FAP e Antibody X è stato sviluppato utilizzando una piattaforma automatizzata in cui panCK e FAP sono stati utilizzati per differenziare tra tumore e stroma, rispettivamente. L'anticorpo X è una proteina stromale frequentemente riscontrata nei tumori, ma la sua biologia e l'impatto sull'immunità antitumorale non sono completamente compresi. La caratterizzazione del contesto immunitario in aree ricche di anticorpi X può chiarire il suo ruolo nell'immunità antitumorale e nella risposta terapeutica, nonché il suo potenziale come bersaglio farmacologico.
Mentre i pannelli di visualizzazione automatizzati TSA personalizzati si sono dimostrati efficaci per i saggi di proteomica spaziale, l'applicazione di questi saggi per i saggi di trascrittomica spaziale non ha potuto essere confermata. Ciò è probabilmente dovuto ai reagenti e al protocollo utilizzato per i protocolli di visualizzazione automatica, che sembrano compromettere l'integrità dell'RNA. Riconoscere che un protocollo di etichettatura automatizzato per i marcatori di visualizzazione può essere utilizzato per i saggi di proteomica spaziale ma non per i saggi di trascrittomica spaziale fornisce importanti indicazioni sui progetti di analisi della tecnologia Spatial Omics.
Inoltre, lo studio dimostra che il saggio di trascrittomica spaziale può essere utilizzato per profilare bersagli in regioni di diametro fino a 50 μm o circa 15 cellule. Sono stati selezionati due ROI di dimensioni diverse per testare la capacità del test di rilevare anche trascrizioni in piccoli ROI. Per ogni regione di interesse, gli oligo corrispondenti a 1.800 bersagli di mRNA sono stati raccolti e trasformati in librerie secondo il protocollo della piattaforma di profilazione spaziale. Le librerie sono state indicizzate singolarmente, successivamente raggruppate e sequenziate. Ciò ha permesso di valutare sia l'efficienza del pooling che la capacità di identificare specifiche popolazioni cellulari in piccoli ROI.
Questo articolo mostra che per i saggi di proteomica spaziale, un protocollo automatizzato per guidare la selezione del ROI su specifici marcatori di interesse può essere utilizzato per indirizzare selettivamente l'interrogazione di aree tissutali rilevanti e caratterizzare l'ambiente spaziale del tessuto. Inoltre, dimostriamo che ROI più piccoli possono essere utilizzati per saggi trascrittomici spaziali per rilevare e caratterizzare specifiche popolazioni cellulari.

<table><tbody><tr><td>10x Soluzione salina tamponata Tris (TBS)</td><td>Tecnologie di segnalazione cellulare</td><td>12498S</td><td>Diluito a 1x TBS in acqua trattata con DEPC</td></tr><tr><td>Anticorpo X (non divulgato)</td><td></td><td></td><td>Anticorpo cieco a causa della riservatezza</td></tr><tr><td>Acqua trattata con DEPC</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9922</td><td>Un altro può essere utilizzato</td></tr><tr><td>DISCOVERY Cell Conditioning ( CC1)</td><td>Ventana</td><td>950-500</td><td></td></tr><tr><td>DISCOVERY Cy5 Kit</td><td>Ventana</td><td>760-238</td><td>Indicato come Cy5</td></tr><tr><td>DISCOVERY FAM Kit</td><td>Ventana</td><td>760-243</td><td>Indicato come FAM</td></tr><tr><td>DISCOVERY Goat Ig Block</td><td>Ventana</td><td>760-6008</td><td>Indicato come Gt Ig Block</td></tr><tr><td>DISCOVERY OmniMap anti-Ms HRP</td><td>Ventana</td><td>760-4310</td><td>Indicato come OMap anti-Ms HRP</td></tr><tr><td>DISCOVERY OmniMap anti-Rb HRP</td><td>Ventana</td><td>760-4311</td><td>Indicato come OMap anti-Rb HRP</td></tr><tr><td>DISCOVERY Rhodamine 6G Kit</td><td>Ventana</td><td>760-244</td><td>Indicato come Rhodamine 6G</td></tr><tr><td>DISCOVERY ULTRA Sistema automatizzato di preparazione dei vetrini</td><td>Ventana</td><td>05 987 750 001 / N750-DISU-FS</td><td>Indicato come autostainer sul manoscritto</td></tr><tr><td>FAP [EPR20021] Anticorpo</td><td>Abcam</td><td>Ab207178</td><td></td></tr><tr><td>GeoMx Digital Spatial Profiler</td><td>NanoString</td><td>GMX-DSP-1Y</td><td>Indicato come piattaforma di profilazione spaziale sul manoscritto</td></tr><tr><td>Camera di umidità</td><td>Simport</td><td>M920-2</td><td>Un altro può essere utilizzato</td></tr><tr><td>Pan-Citocheratina [AE1/AE3] Anticorpo</td><td>Abcam</td><td>Ab27988</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>ThermoFisher</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Python</td><td></td><td></td><td>Python Analisi statistica</td></tr><tr><td>Buffer di reazione (10x)</td><td>Ventana</td><td>950-300</td><td></td></tr><tr><td>Software di analisi statistica</td><td>GraphPad</td><td>Prism 7</td><td>Analisi statistica</td></tr><tr><td>SYTO 64</td><td>ThermoFisher</td><td>S11346</td><td></td></tr><tr><td>ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2)</td><td>Ventana</td><td>950-223</td><td></td></tr><tr><td>Ventana Antibody Diluente con caseina</td><td>Ventana</td><td>760-219</td><td>Indicato come diluente specificato sul manoscritto</td></tr><tr><td>Ventana Dispenser di anticorpi primari</td> Il numero di catalogo <td>Ventana</td><td></td><td>dipende dal numero del dispenser</td></tr></tbody></table>

profilazione spaziale dell'espressione di proteine e rna nei tessuti: un approccio alla messa a punto della microdissezione virtuale

Spatial Profiling of Protein and RNA Expression in Tissue: An Approach to Fine-Tune Virtual Microdissection

Il multiplexing consente la valutazione di diversi marcatori sullo stesso tessuto, fornendo al contempo un contesto spaziale. Le tecnologie di omiche spaziali consentono il multiplexing sia di proteine che di RNA sfruttando rispettivamente anticorpi e sonde oligo-marcati foto-scissibili. Gli oligo vengono scissi e quantificati da regioni specifiche attraverso il tessuto per chiarire la biologia sottostante. Qui, lo studio dimostra che i protocolli di visualizzazione automatica degli anticorpi personalizzati possono essere utilizzati per guidare la selezione del ROI in combinazione con saggi di proteomica spaziale. Questo metodo specifico non ha mostrato prestazioni accettabili con saggi di trascrittomica spaziale. Il protocollo descrive lo sviluppo di un test immunofluorescente (IF) a 3 plessi per la visualizzazione dei marcatori su una piattaforma automatizzata, utilizzando l'amplificazione del segnale del tiramido (TSA) per amplificare il segnale fluorescente da un determinato bersaglio proteico e aumentare il pool di anticorpi tra cui scegliere. Il protocollo di visualizzazione è stato automatizzato utilizzando un test 3-plex accuratamente convalidato per garantire qualità e riproducibilità. Inoltre, è stato valutato lo scambio di DAPI per coloranti SYTO per consentire l'imaging di saggi IF basati su TSA sulla piattaforma di profilazione spaziale. Inoltre, abbiamo testato la capacità di selezionare piccoli ROI utilizzando il saggio di trascrittomica spaziale per consentire l'indagine di aree di interesse altamente specifiche (ad esempio, aree arricchite per un determinato tipo di cellula). Sono stati raccolti ROI di 50 μm e 300 μm di diametro, che corrispondono rispettivamente a circa 15 cellule e 100 celle. I campioni sono stati inseriti in librerie e sequenziati per studiare la capacità di rilevare segnali provenienti da piccoli ROI e regioni specifiche del profilo del tessuto. Abbiamo determinato che le tecnologie di proteomica spaziale traggono grande vantaggio da protocolli automatizzati e standardizzati per guidare la selezione del ROI. Sebbene questo protocollo di visualizzazione automatizzata non fosse compatibile con i saggi di trascrittomica spaziale, siamo stati in grado di testare e confermare che specifiche popolazioni cellulari possono essere rilevate con successo anche in piccoli ROI con il protocollo di visualizzazione manuale standard.

Protocollo di visualizzazione automatizzato per guidare la selezione del ROI In questo documento, presentiamo l'uso di un protocollo IF automatizzato e personalizzato basato su TSA per visualizzare il tessuto e selezionare ROI specifici. Lo sviluppo del pannello di visualizzazione utilizzando il melanoma e la pelle umana normale come tessuti di controllo consisteva in test di stabilità dell'epitopo, messa a punto delle intensità dei marcatori e valutazione del sanguinamento attraverso controlli esclus...

Qui, descriviamo un protocollo per la messa a punto delle regioni di interesse (ROI) per le tecnologie di omiche spaziali per caratterizzare meglio il microambiente tumorale e identificare specifiche popolazioni cellulari. Per i saggi di proteomica, i protocolli personalizzati automatizzati possono guidare la selezione del ROI, mentre i saggi di trascrittomica possono essere ottimizzati utilizzando ROI di soli 50 μm.

Profilazione spaziale dell'espressione di proteine e RNA nei tessuti: un approccio alla messa a punto della microdissezione virtuale

Multiplexing enables the assessment of several markers on the same tissue while providing spatial context. Spatial Omics technologies allow both protein ...

Questo protocollo aiuta a guidare la selezione delle regioni di interesse per le tecnologie omiche spaziali, che consente una caratterizzazione più mirata dei tessuti o delle popolazioni cellulari. Un protocollo automatizzato per la selezione del ROI nei saggi di proteomica è più robusto e riproducibile rispetto ai protocolli manuali e l'utilizzo di ROI a 50 micrometri per i saggi di trascrittomica consente la profilazione di specifiche popolazioni cellulari. Inizia con la programmazione dell'autostainer per applicare anticorpi di visualizzazione fluorescenti.Nel software autostainer, fare clic sul pulsante Home e scegliere Protocolli. Quindi fare clic su Crea/Modifica protocolli e selezionare RUO Discovery Universal come procedura. Fare clic su Prima sequenza, quindi selezionare Deparaffinazation, seguito da Depar v2.Per Temperatura media, scegliere 72 gradi Celsius, quindi fare clic su Pretrattamento e selezionare Condizionamento cellulare e CC1 Reservoir. Per Temperatura molto elevata, scegliere 100 gradi Celsius, quindi fare clic su CC1 otto minuti e continuare a fare clic fino a selezionare CC1 64 minuti. Fare clic su Inibitore, quindi selezionare Inibitore DISCOVERY e, per Tempo di incubazione, scegliere otto minuti.Quindi fare clic su Anticorpo, seguito da Incubazione di anticorpi ad alta temperatura. Per Bassa temperatura, scegli 37 gradi Celsius. Per Anticorpo, scegliere l'ANTICORPO 6 dall'etichetta del distributore.Per Plus Incubation Time, selezionare 32 minuti. Fare clic su Multimer HRP, quindi selezionare Multimer HRP Blocker. Quindi, per il blocco degli anticorpi, scegliere Gt Ig Block.E per Tempo di incubazione, scegli quattro minuti. Quindi, su Multimer HRP Reagent, selezionare OMap Anti-Rb HRP e, per Tempo di incubazione, scegliere 16 minuti. Quindi fare clic su Cy5 e, per Tempo di incubazione lungo, scegliere ora zero, otto minuti.Fare clic su Doppia sequenza e scegliere Denaturazione anticorpale. Quindi selezionare Antibody Denature CC2-1 e, per una temperatura molto elevata, scegliere 100 gradi Celsius. Assicurarsi che il tempo di incubazione sia di otto minuti.Quindi, fare clic su DS Inhibitor e selezionare Neutralizza. Fare clic su Anticorpo DS e, per Temperatura molto bassa, scegliere 37 gradi Celsius. Quindi, in Anticorpo, scegliere ANTICORPO 3 dall'etichetta del distributore.E per Plus Incubation Time, seleziona 32 minuti. Fare clic su DS Multimer HRP e scegliere DS Multimer HRP Blocker. Quindi, per Blocco anticorpi, selezionare Gt Ig Block e per Tempo di incubazione, scegliere quattro minuti.Quindi, su Multimer HRP Reagent, selezionare OMap anti-Ms HRP e, per Tempo di incubazione, scegliere 16 minuti. Quindi fare clic su DS Rhodamine 6G e, per Tempo di incubazione lungo, scegliere ora zero, otto minuti. Fare clic su Triple Stain e selezionare TS Antibody Denaturation, quindi selezionare Antibody Denature CC2-2 e, per Very High Temperature, selezionare 100 gradi Celsius.Assicurarsi che il tempo di incubazione sia di otto minuti. Quindi, fare clic su TS Inhibitor e selezionare TS Neutralize. Fare clic su Anticorpo TS e, per Temperatura molto bassa, selezionare 37 gradi Celsius.Quindi, in Anticorpo, selezionare l'ANTICORPO 7 dall'etichetta del dispenser e, per Plus Incubation Time, selezionare 32 minuti. Fare clic su TS Multimer HRP e scegliere TS Multimer HRP Blocker. Quindi, per Blocco anticorpi, selezionare Gt Ig Block e per Tempo di incubazione, scegliere quattro minuti.Successivamente su Multimer HRP Reagent, selezionare OMap Anti-Rb HRP e, per Tempo di incubazione, scegliere 16 minuti. Quindi fare clic su TS FAM e, per Tempo di incubazione lungo, scegliere ora zero, otto minuti. Clicca su Salva e aggiungi un titolo al protocollo.Selezionare un numero di protocollo, aggiungere un commento e fare clic su Attivo, seguito da Salva. Cuocere sezioni di tessuto umano con paraffina fissate in formalina acquistate dal fornitore in un forno impostato a 70 gradi Celsius per 20-60 minuti. Mentre le diapositive cuociono, stampa le etichette facendo clic su Crea etichetta nel software autostainer.Quindi, fare clic su Protocolli, selezionare il numero di protocollo e fare clic su Chiudi / Stampa. Aggiungere le informazioni pertinenti sull'etichetta della diapositiva e fare clic su Stampa. Togliere i vetrini dal forno e lasciarli raffreddare a temperatura ambiente.Applicare le etichette di protocollo stampate in precedenza alle diapositive corrispondenti. Caricare i distributori di anticorpi ricaricabili con anticorpi in base ai numeri di etichetta degli anticorpi. Diluire ciascun anticorpo nel diluente specificato e innescare i distributori di anticorpi ricaricabili.Raccogliere i distributori di reagenti preriempiti di blocco, rilevamento e amplificazione e posizionarli sul vassoio del reagente dello strumento. Caricare le diapositive nei cassetti delle diapositive e fare clic su In esecuzione, quindi su Sì. Confermare l'inizio dell'esecuzione controllando la durata dell'esecuzione sul software autostainer.Il giorno successivo, assicurati il completamento della corsa osservando le luci lampeggianti verdi sulle fessure dei cassetti a scorrimento. Quindi togliere i vetrini dallo strumento e sciacquarli energicamente in 1x tampone di reazione fino a quando la soluzione liquida di copertura non viene completamente rimossa. Sostituire SYTO 13 con SYTO 64 a 5.000 nanomolari per consentire l'integrazione dei fluorofori.Diluire SYTO 64 in 1x TBS e incubare in una camera di umidità per 15 minuti. Utilizzare FITC per DISCOVERY Fam e impostare l'esposizione su 200 millisecondi. Utilizzare Cy3 per DISCOVERY Rhodamine 6G e impostare l'esposizione a 200 millisecondi.Utilizzare Texas Red per SYTO 64 e impostare l'esposizione su 50 millisecondi. Specificare SYTO 64 come canale di messa a fuoco e, infine, utilizzare Cy5 per DISCOVERY Cy5. Impostare l'esposizione su 200 millisecondi e salvare le modifiche.Cuocere le sezioni di pellet di cellela in paraffina fissate in formalina in un forno impostato a 70 gradi Celsius per 20-60 minuti. Scansiona le diapositive sulla piattaforma di profilazione spaziale e seleziona dimensioni di 50 micrometri e 300 micrometri. Il protocollo di visualizzazione automatizzata è stato sviluppato includendo controlli di esclusione per confermare che non vi era alcuna perdita di sangue dai canali vicini.La mappa di calore log 2 di tutti i marcatori inclusi nel saggio di proteomica spaziale confrontando il protocollo manuale pan-citocheratina CD 45 in nero con il protocollo automatico 3-plex in grigio mostra un valore Spearman R di 0,88. Dei 31 anticorpi utilizzati nei test, 23 anticorpi avevano un valore R di Spearman superiore o uguale a 0,5. La mappa termica log 2 di target selezionati inclusa nel saggio di trascrittomica spaziale confrontando il protocollo manuale pan-citocheratina CD 45 in nero con il protocollo automatizzato 3-plex in grigio ha mostrato differenze in questi valori.I dati di sequenziamento per il protocollo di visualizzazione automatizzata 3-plex presentavano valori più bassi rispetto al protocollo di visualizzazione manuale pan-citocheratina CD 45, che si riflette anche nei bassi valori di Spearman R di 0,15. Inoltre, è stata osservata una perdita di gamma dinamica quando si utilizza il protocollo automatizzato di visualizzazione 3-plex. Il rilevamento di piccoli ROI nel protocollo di trascrittomica spaziale è stato eseguito selezionando regioni circolari di interesse a 50 micrometri e 300 micrometri di diametro I conteggi dell'RNA per bersagli selezionati su diverse linee cellulari erano comparabili tra le due regioni di dimensioni di interesse dopo la normalizzazione.Questo protocollo per i pannelli di visualizzazione automatica può essere adattato dai ricercatori scambiando marcatori al fine di sviluppare pannelli che definiscono con precisione i ROI per rispondere alle loro domande di proteomica spaziale.

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Profilazione spaziale dellespressione di proteine e RNA nei tessuti: un approccio alla messa a punto della microdissezione virtuale (Video) | JoVE Journal

Profilazione spaziale dell'espressione di proteine e RNA nei tessuti: un approccio alla messa a punto della microdissezione virtuale

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