Profilazione spaziale dell'espressione di proteine e RNA nei tessuti: un approccio alla messa a punto della microdissezione virtuale

Questo protocollo aiuta a guidare la selezione delle regioni di interesse per le tecnologie omiche spaziali, che consente una caratterizzazione più mirata dei tessuti o delle popolazioni cellulari. Un protocollo automatizzato per la selezione del ROI nei saggi di proteomica è più robusto e riproducibile rispetto ai protocolli manuali e l'utilizzo di ROI a 50 micrometri per i saggi di trascrittomica consente la profilazione di specifiche popolazioni cellulari. Inizia con la programmazione dell'autostainer per applicare anticorpi di visualizzazione fluorescenti.

Nel software autostainer, fare clic sul pulsante Home e scegliere Protocolli. Quindi fare clic su Crea/Modifica protocolli e selezionare RUO Discovery Universal come procedura. Fare clic su Prima sequenza, quindi selezionare Deparaffinazation, seguito da Depar v2.

Per Temperatura media, scegliere 72 gradi Celsius, quindi fare clic su Pretrattamento e selezionare Condizionamento cellulare e CC1 Reservoir. Per Temperatura molto elevata, scegliere 100 gradi Celsius, quindi fare clic su CC1 otto minuti e continuare a fare clic fino a selezionare CC1 64 minuti. Fare clic su Inibitore, quindi selezionare Inibitore DISCOVERY e, per Tempo di incubazione, scegliere otto minuti.

Quindi fare clic su Anticorpo, seguito da Incubazione di anticorpi ad alta temperatura. Per Bassa temperatura, scegli 37 gradi Celsius. Per Anticorpo, scegliere l'ANTICORPO 6 dall'etichetta del distributore.

Per Plus Incubation Time, selezionare 32 minuti. Fare clic su Multimer HRP, quindi selezionare Multimer HRP Blocker. Quindi, per il blocco degli anticorpi, scegliere Gt Ig Block.

E per Tempo di incubazione, scegli quattro minuti. Quindi, su Multimer HRP Reagent, selezionare OMap Anti-Rb HRP e, per Tempo di incubazione, scegliere 16 minuti. Quindi fare clic su Cy5 e, per Tempo di incubazione lungo, scegliere ora zero, otto minuti.

Fare clic su Doppia sequenza e scegliere Denaturazione anticorpale. Quindi selezionare Antibody Denature CC2-1 e, per una temperatura molto elevata, scegliere 100 gradi Celsius. Assicurarsi che il tempo di incubazione sia di otto minuti.

Quindi, fare clic su DS Inhibitor e selezionare Neutralizza. Fare clic su Anticorpo DS e, per Temperatura molto bassa, scegliere 37 gradi Celsius. Quindi, in Anticorpo, scegliere ANTICORPO 3 dall'etichetta del distributore.

E per Plus Incubation Time, seleziona 32 minuti. Fare clic su DS Multimer HRP e scegliere DS Multimer HRP Blocker. Quindi, per Blocco anticorpi, selezionare Gt Ig Block e per Tempo di incubazione, scegliere quattro minuti.

Quindi, su Multimer HRP Reagent, selezionare OMap anti-Ms HRP e, per Tempo di incubazione, scegliere 16 minuti. Quindi fare clic su DS Rhodamine 6G e, per Tempo di incubazione lungo, scegliere ora zero, otto minuti. Fare clic su Triple Stain e selezionare TS Antibody Denaturation, quindi selezionare Antibody Denature CC2-2 e, per Very High Temperature, selezionare 100 gradi Celsius.

Assicurarsi che il tempo di incubazione sia di otto minuti. Quindi, fare clic su TS Inhibitor e selezionare TS Neutralize. Fare clic su Anticorpo TS e, per Temperatura molto bassa, selezionare 37 gradi Celsius.

Quindi, in Anticorpo, selezionare l'ANTICORPO 7 dall'etichetta del dispenser e, per Plus Incubation Time, selezionare 32 minuti. Fare clic su TS Multimer HRP e scegliere TS Multimer HRP Blocker. Quindi, per Blocco anticorpi, selezionare Gt Ig Block e per Tempo di incubazione, scegliere quattro minuti.

Successivamente su Multimer HRP Reagent, selezionare OMap Anti-Rb HRP e, per Tempo di incubazione, scegliere 16 minuti. Quindi fare clic su TS FAM e, per Tempo di incubazione lungo, scegliere ora zero, otto minuti. Clicca su Salva e aggiungi un titolo al protocollo.

Selezionare un numero di protocollo, aggiungere un commento e fare clic su Attivo, seguito da Salva. Cuocere sezioni di tessuto umano con paraffina fissate in formalina acquistate dal fornitore in un forno impostato a 70 gradi Celsius per 20-60 minuti. Mentre le diapositive cuociono, stampa le etichette facendo clic su Crea etichetta nel software autostainer.

Quindi, fare clic su Protocolli, selezionare il numero di protocollo e fare clic su Chiudi / Stampa. Aggiungere le informazioni pertinenti sull'etichetta della diapositiva e fare clic su Stampa. Togliere i vetrini dal forno e lasciarli raffreddare a temperatura ambiente.

Applicare le etichette di protocollo stampate in precedenza alle diapositive corrispondenti. Caricare i distributori di anticorpi ricaricabili con anticorpi in base ai numeri di etichetta degli anticorpi. Diluire ciascun anticorpo nel diluente specificato e innescare i distributori di anticorpi ricaricabili.

Raccogliere i distributori di reagenti preriempiti di blocco, rilevamento e amplificazione e posizionarli sul vassoio del reagente dello strumento. Caricare le diapositive nei cassetti delle diapositive e fare clic su In esecuzione, quindi su Sì. Confermare l'inizio dell'esecuzione controllando la durata dell'esecuzione sul software autostainer.

Il giorno successivo, assicurati il completamento della corsa osservando le luci lampeggianti verdi sulle fessure dei cassetti a scorrimento. Quindi togliere i vetrini dallo strumento e sciacquarli energicamente in 1x tampone di reazione fino a quando la soluzione liquida di copertura non viene completamente rimossa. Sostituire SYTO 13 con SYTO 64 a 5.000 nanomolari per consentire l'integrazione dei fluorofori.

Diluire SYTO 64 in 1x TBS e incubare in una camera di umidità per 15 minuti. Utilizzare FITC per DISCOVERY Fam e impostare l'esposizione su 200 millisecondi. Utilizzare Cy3 per DISCOVERY Rhodamine 6G e impostare l'esposizione a 200 millisecondi.

Utilizzare Texas Red per SYTO 64 e impostare l'esposizione su 50 millisecondi. Specificare SYTO 64 come canale di messa a fuoco e, infine, utilizzare Cy5 per DISCOVERY Cy5. Impostare l'esposizione su 200 millisecondi e salvare le modifiche.

Cuocere le sezioni di pellet di cellela in paraffina fissate in formalina in un forno impostato a 70 gradi Celsius per 20-60 minuti. Scansiona le diapositive sulla piattaforma di profilazione spaziale e seleziona dimensioni di 50 micrometri e 300 micrometri. Il protocollo di visualizzazione automatizzata è stato sviluppato includendo controlli di esclusione per confermare che non vi era alcuna perdita di sangue dai canali vicini.

La mappa di calore log 2 di tutti i marcatori inclusi nel saggio di proteomica spaziale confrontando il protocollo manuale pan-citocheratina CD 45 in nero con il protocollo automatico 3-plex in grigio mostra un valore Spearman R di 0,88. Dei 31 anticorpi utilizzati nei test, 23 anticorpi avevano un valore R di Spearman superiore o uguale a 0,5. La mappa termica log 2 di target selezionati inclusa nel saggio di trascrittomica spaziale confrontando il protocollo manuale pan-citocheratina CD 45 in nero con il protocollo automatizzato 3-plex in grigio ha mostrato differenze in questi valori.

I dati di sequenziamento per il protocollo di visualizzazione automatizzata 3-plex presentavano valori più bassi rispetto al protocollo di visualizzazione manuale pan-citocheratina CD 45, che si riflette anche nei bassi valori di Spearman R di 0,15. Inoltre, è stata osservata una perdita di gamma dinamica quando si utilizza il protocollo automatizzato di visualizzazione 3-plex. Il rilevamento di piccoli ROI nel protocollo di trascrittomica spaziale è stato eseguito selezionando regioni circolari di interesse a 50 micrometri e 300 micrometri di diametro I conteggi dell'RNA per bersagli selezionati su diverse linee cellulari erano comparabili tra le due regioni di dimensioni di interesse dopo la normalizzazione.

Questo protocollo per i pannelli di visualizzazione automatica può essere adattato dai ricercatori scambiando marcatori al fine di sviluppare pannelli che definiscono con precisione i ROI per rispondere alle loro domande di proteomica spaziale.