Isolamento delle cellule linfoidi innate uterine per l'analisi mediante citometria a flusso
14 ottobre 2021
Questo è un metodo per isolare le cellule linfoidi uterine da topi sia gravidi che non gravidi. Questo metodo può essere utilizzato per molteplici applicazioni a valle come la fenotipizzazione FACS, lo smistamento cellulare, i saggi funzionali, l'RNA-seq e la proteomica. Il protocollo qui dimostra come fenotipizzare le cellule linfoidi innate uterine del gruppo 1 mediante citometria a flusso.
Il nostro metodo consente di valutare la composizione e le caratteristiche funzionali di diverse sottopopolazioni di linfociti presenti nel tessuto uterino di animali gravidi e non gravidi. Questo protocollo consente l'isolamento dei linfociti uterini preservando l'espressione superficiale delle proteine, la vitalità cellulare e la funzionalità. Pertanto è adatto per una serie di applicazioni successive.
La rimozione del feto all'inizio dell'esperimento e la raccolta dei leucociti sono passaggi tecnicamente impegnativi. Poiché si tratta di un esperimento lungo, è necessaria particolare attenzione e attenzione una volta raggiunti i passaggi di colorazione degli anticorpi. Per iniziare, trasferire il tessuto uterino raccolto da un topo femmina C57 nero sei femmina in una capsula di Petri sterile, quindi utilizzando strumenti sterili rimuovere delicatamente il grasso che circonda il tessuto, facendo attenzione a non lasciare asciugare il tessuto.
Rimuovere i feti sezionando ogni sito di impianto con strumenti sterili, quindi riportare l'utero al suo tubo di raccolta originale di cinque millilitri contenente un millilitro di mezzi di raccolta. Usando le forbici, tritare il tessuto nel tubo di raccolta, quindi posizionare il tubo in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Quindi aggiungere tre millilitri di miscela di digestione enzimatica preriscaldata al tubo.
Incubare il tubo per 30 minuti a 37 gradi Celsius con agitazione per migliorare l'attività di digestione enzimatica. Al termine dell'incubazione, ruotare il tubo e tenerlo sul ghiaccio per inibire l'attività enzimatica, quindi trasferire il tessuto digestivo in un tubo centrifugo da 15 millilitri opportunamente etichettato. Risciacquare il tubo di raccolta da cinque millilitri con un totale di 10 millilitri di soluzione EDTA PBS a cinque millimolari ghiacciati per raccogliere tutto il tessuto rimanente e trasferirlo nel tubo centrifuga da 15 millilitri.
Centrifugare il campione di tessuto digerito per 10 minuti a 400 volte G.Scartare il surnatante, far scorrere delicatamente il pellet e quindi risospeso in 10 millilitri di soluzione EDTA PBS preriscaldata a cinque millimolari. Per ridurre l'aggregazione cellulare, incubare il campione a 37 gradi Celsius con agitazione, seguito da vortice in alto per 10 secondi. Per rimuovere i grumi cellulari nel tessuto non disassociato, posizionare un filtro da 70 micrometri sopra un tubo sterile da 50 millilitri per centrifuga, quindi utilizzare lo stantuffo di una siringa sterile da un millilitro, forzare il tessuto digerito attraverso il filtro nel tubo.
Lavare il colino più volte con un totale di 10 millilitri di PBS freddo per raccogliere tutte le cellule, quindi spendere il tubo della centrifuga da 50 millilitri per 10 minuti a 400 volte G.Dopo aver scartato il surnatante, le cellule linfoidi innate possono essere isolate utilizzando l'opzione A o l'opzione B.Per l'opzione A, risospesere il pellet in cinque millilitri dell'80% isotonico per chiamata usando un voy pipetta. Quindi, utilizzando la pipetta a bassa velocità, sovrapporre con cura otto millilitri, il 40% per soluzione di chiamata, sul pellet risospeso in un tubo di centrifuga da 15 millilitri. Pipettare lentamente e continuamente, tenendo i 15 millilitri a circa un angolo di 45 gradi.
Senza disturbare la sovrapposizione, centrifugare il tubo per 20 minuti a 850 volte G con accelerazione media e pause minime a temperatura ambiente. Una volta completata la centrifugazione, rimuovere con cura il tubo dalla centrifuga senza disturbare gli strati per chiamata. Quindi, senza disturbare l'anello dei leucociti all'interfaccia delle due soluzioni per chiamata, utilizzare una pipetta pasteur sterile per scartare tutti tranne 0,5 a un millilitro dello strato superiore per chiamata.
Mentre si cerca di mantenere al minimo la quantità di soluzione per chiamata aspirata nella pipetta, raccogliere con cura l'anello dei leucociti e trasferire le cellule in un nuovo tubo centrifugo da 15 millilitri etichettato. Aggiungere 10 millilitri di mezzo RPMI sterile integrato con il 10% di calore e FBS attivato alle celle, quindi centrifugare le celle per cinque minuti a 500 volte G e quattro gradi Celsius. Scartare il surnatante e procedere alla lisi dei globuli rossi.
Per isolare le cellule utilizzando l'opzione B, dopo aver fatto passare il tessuto digerito attraverso il filtro cellulare e aver centrifugato il risultato in sospensione cellulare come dimostrato in precedenza, risospesere il pellet con otto millilitri del 35% isotonico per richiamo e mezzo RPMI e trasferire le cellule in un tubo da 15 millilitri. Centrifugare il tubo a 940 volte G per 10 minuti a temperatura ambiente con accelerazione media e pause minime. Quindi, utilizzando un aspiratore o una pipetta voy, aspirare attentamente il surnatante prima di risospendere il pellet in 14 millilitri di mezzo RPMI integrato con il 10% di calore e FBS attivato.
Centrifugare nuovamente il campione per cinque minuti a 500 volte G e quattro gradi Celsius, quindi scartare il surnatante per aspirazione e procedere alla lisi dei globuli rossi. Per lisare i globuli rossi, risospesciare il campione in tre millilitri di una soluzione lisante dei globuli rossi X e incubare per tre minuti a temperatura ambiente, quindi aggiungere 10 millilitri di PBS nel campione per fermare la reazione. Centrifugare il tubo a 400 volte G per cinque minuti dopo aver scartato il surnatante, aggiungere altri 10 millilitri di PBS e ripetere la centrofugazione.
Risospendare il pellet in un millilitro di mezzo RPMI integrato con FBS inattivato al 10% di calore, quindi passare la sospensione in cella attraverso un filtro cellulare sterile da 70 micrometri. Dopo aver contato le cellule regolano la concentrazione della sospensione cellulare da uno a 2 milioni di cellule in 100 microlitri di PBS e procedono alla colorazione e all'analisi facs. Le ILC del primo gruppo uterino includono cellule NK convenzionali, cellule NK residenti nei tessuti e ILC del gruppo uno con le loro percentuali che variano durante la vita e la gravidanza.
Questi sottoinsiemi possono essere discriminati utilizzando la citometria a flusso prima gating le cellule sulla loro capacità di disperdere la luce, quindi isolando singole cellule CD 45 cd positive CD 19 negative e quindi identificando il gruppo uno ILC che sono NK 1.1 e NKP 46 positivi. All'interno del gruppo uno ILC, cd49A negativo EM positivo sono cellule NK convenzionali. Le cellule CD49A positive Ems positive sono cellule NK residenti nei tessuti.
E le cellule CD49 positive Ems negative sono ILC uterine di gruppo uno. La colorazione dei linfociti splenici e uterini con anticorpi anti NK P46 e anti NK 1.1 mostra che i linfociti splenici esprimono quantità più elevate di NKP 46 sulla loro superficie rispetto alla loro controparte uterina. Nella dissociazione enzimatica dei tessuti, gli epitopi superficiali possono essere alterati a seconda degli enzimi utilizzati nel mezzo di digestione.
Ad esempio, la colorazione per il recettore MHC CD49 NKG2A è scarsa quando si utilizza liberase TM. Tuttavia la digestione con liberase DH preserva il riconoscimento NKG2A da parte del clone di anticorpi 1611. Circa il 6,5% delle ILC del primo gruppo presenti nei campioni di tessuto uterino al giorno di gestazione 8,5 sono derivate dal sangue.
I contaminanti del sangue possono essere esclusi attraverso la colorazione intravitale con anticorpi anti CD45 coniugati con un fluorocromo. Quando si impostano riunioni a tempo, è necessario prendere in considerazione che i topi sono notturni. Pertanto dovrebbero essere impostati il più tardi possibile nel pomeriggio poiché l'accoppiamento avverrà durante la notte.
Anche quando si selezionano le femmine, è necessario assicurarsi che non abbiano un setto vaginale. In genere eseguiamo analisi citometriche a flusso per esaminare molte proteine all'esterno delle cellule e all'interno delle cellule. Facciamo anche l'estrazione di acidi nucleici per studiare l'espressione genica, incluso il sequenziamento dell'RNA.
E riusciamo anche a circa saggi funzionali per studiare le risposte delle cellule linfoidi innate uterine.
Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo per isolare cellule linfoidi uterine da topi gravidi e non gravidi, preservando la vitalità e la funzionalità cellulare. È applicabile per diverse analisi successive, inclusi la citometria a flusso e saggi funzionali.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Immunologia
- Biologia cellulare
- Neuroscienze
Sfondo
- Le cellule linfoidi uterine svolgono un ruolo cruciale nell'immunologia riproduttiva.
- Comprendere la loro composizione può fornire informazioni sui processi di gravidanza e sulle risposte immunitarie.
- I metodi di isolamento devono mantenere la vitalità cellulare e l'espressione delle proteine di superficie.
- Le difficoltà includono gli aspetti tecnici della manipolazione dei tessuti e del recupero dei leucociti.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo affidabile per l'isolamento dei linfociti uterini.
- Permettere il fenotipaggio delle cellule linfoidi innate mediante citometria a flusso.
- Facilitare ulteriori saggi funzionali e analisi.
Metodi Utilizzati
- Dissezione del tessuto uterino da topi gravidi.
- Digestione enzimatica per isolare linfociti.
- Tecniche di centrifugazione e separazione tramite gradiente di densità.
- Citometria a flusso per la fenotipizzazione delle sottopopolazioni di linfociti.
Risultati principali
- Isolamento con successo di cellule linfoidi uterine vitali.
- Identificazione di subpopolazioni distinte di cellule linfoidi innate.
- Preservazione della funzionalità cellulare per applicazioni successive.
- Il metodo dimostra riproducibilità ed efficienza nell'isolamento cellulare.
Conclusioni
- Il protocollo fornisce un approccio solido per lo studio dei linfociti uterini.
- Migliora la comprensione della dinamica immunitaria durante la gravidanza.
- Applicazioni future potrebbero includere l'esplorazione delle risposte immunitarie nella salute riproduttiva.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'isolamento delle cellule linfoidi innate uterine permette una riduzione meccanicistica dei rischi associati a bersagli in immunologia riproduttiva, fornendo un sistema rilevante per la patologia in cui valutare le risposte dei linfociti a fattori materni e fetali. Questo approccio supporta la validazione dei bersagli e lo screening fenotipico in modelli preclinici di disturbi legati alla gravidanza, aumentando la fiducia predittiva nell'identificazione dei candidati principali. Il metodo facilita la scoperta di biomarcatori traslazionali e lo sviluppo di saggi per terapie immunomodulanti.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche isolando e fenotipizzando le ILC di gruppo 1 dell'utero per chiarirne il ruolo nella regolazione immunitaria durante la gravidanza.
- Valore operativo: Fornisce un flusso di lavoro riproducibile per l'isolamento di linfociti uterini vitali, preservando al contempo l'espressione e la funzionalità delle proteine di superficie.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Genera sospensioni cellulari monocellulari standardizzate adatte per lo screening basato sulla citometria a flusso di composti immunomodulatori.
- Valore operativo: Favorisce la prontezza del saggio garantendo resa cellulare e vitalità costanti, consentendo una valutazione affidabile dei composti tra diversi lotti sperimentali.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Collega il profiling immunitario in fase di scoperta alla validazione preclinica, mettendo in relazione l'eterogeneità degli uILC con l'espressione genica e gli esiti funzionali.
- Valore operativo: Favorisce la continuità dalla fase di isolamento alle applicazioni successive, inclusi il sequenziamento dell'RNA e i saggi funzionali.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel processo di scoperta permettendo la verifica di ipotesi in immunologia della riproduzione, sostenendo lo sviluppo di saggi per modulatori immunitari e informando decisioni di avanzamento corrette per il rischio attraverso un profilo immunitario quantitativo.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante l'isolamento di sottopopolazioni di linfociti uterini per analisi funzionali e fenotipiche.
- Screening: Permette la standardizzazione dei saggi e letture quantitative mediante citometria a flusso per confrontare le risposte immunitarie in diverse condizioni.
- Analisi: Fornisce misurazioni quantitative di variabili dipendenti, come percentuali di sottogruppi cellulari ed espressione di marcatori, per consentire analisi comparative.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica associando fenotipi cellulari a risultati funzionali e profili di espressione genica.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma di isolamento riutilizzabile applicabile in diverse fasi della gravidanza e modelli di malattia.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Maggiore affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi attraverso la riduzione del rischio meccanicistico dei meccanismi immunitari uterini.
- Valore operativo: Standardizzazione e riproducibilità nell'isolamento dei linfociti tra diversi set sperimentali.
- Valore strategico: Miglioramento delle decisioni di avanzamento o interruzione dello sviluppo, riducendo l'incertezza biologica nell'interazione con bersagli riproduttivi.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione corretta per rischio dei candidati immunomodulatori basata sui dati di risposta immunitaria uterina.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella dissezione dei tessuti, digestione enzimatica e citometria a flusso.
- Dipende dall'ottimizzazione della digestione enzimatica per preservare epitopi di superficie come NKG2A.
- Necessita di standardizzazione tra gruppi di lavoro per protocolli coerenti di raccolta e colorazione dei leucociti.
- Comporta considerazioni di adattamento quando applicato a diverse fasi gestazionali o modelli genetici.
- È limitato dalla perdita di informazioni spaziali del tessuto durante la dissociazione, richiedendo tecniche di imaging complementari per il contesto spaziale.
