秀丽隐杆线虫树突棘成像

该协议描述了可视化秀丽隐杆线虫神经元中的树突棘形态和钙瞬变的方法。我们的方法应该有助于遗传方法，以发现脊柱形态发生和功能的决定因素。我们的实验方案以GABA能神经元中的树突棘为特征。

其他类别的秀丽隐杆线虫神经元中的棘也可以用这些方法进行研究。我们的协议描述了固定活秀丽隐杆线虫的方法。在图像采集过程中防止动物移动，并选择正确的激光配置来激发和记录神经元活动尤为重要。

要获得高分辨率图像，请加入三微升麻醉液，并在10%琼脂糖垫上加入15至20条年轻成虫。然后应用盖玻片固定蠕虫，并用熔化的粘合剂密封剂混合物密封盖玻片边缘。对于超分辨率采集，请使用配备超分辨率显微镜的激光扫描共聚焦显微镜。

使用制造商软件推荐的步长获取 Z 堆栈。收集一系列跨越背侧D或DD腹侧突总体积的光学切片。使用制造商的软件提交 Z 堆栈进行图像处理，并分析分数高于 7 的图像。

对于奈奎斯特采集，请使用激光扫描共聚焦显微镜，并为光波长和物镜的数值孔径选择最佳像素尺寸。然后使用自动算法提交堆栈以进行 3D 反卷积。对于图像分析，请使用适当的图像处理软件来创建 Z 堆栈的最大强度投影。

并手动计算DD树突上的突起。然后确定刻痕DD枝晶的长度，以计算每10微米DD树突的刺密度。然后将刺分类为细刺或蘑菇状、丝状、粗短刺或分枝状。

使用显微注射等常规技术，创建在DD神经元中表达钙传感器GCaMP的转基因蠕虫，以及突触前VA神经元中的红移通道视紫红质Chrimson。接下来，在层流罩下，通过向每个 60 毫米线虫生长培养基营养琼脂平板添加 300 微升过夜生长的 OP50 细菌培养物和 0.25 微升 ATR 来制备所有经式视网膜或 ATR 平板。然后用无菌玻璃棒传播培养物。

对于对照板，加入300微升OP50细菌和0.25微升乙醇。为了允许细菌生长，将板在室温下孵育24小时，避免环境光。为了设置实验，将五个L4阶段幼虫放在OP50种子的ATR或对照板上，并在23摄氏度的黑暗中孵育板。

三天后，使用立体解剖显微镜确认外阴发育，并从ATR和对照板中挑选L4期后代进行成像。接下来，将两微升0.05微米的聚珠放在显微镜载玻片上。并将大约10个L4幼虫放入溶液中。

使用铂丝，在溶液中加入一小团强力胶。轻轻旋转溶液以产生丝状胶水。然后加入三微升M9缓冲液。

然后应用盖玻片并密封其边缘，如前所述。要记录树突棘中诱发的钙瞬变，请使用转盘共聚焦显微镜，并调整显微镜载物台以将DD棘定位在焦平面中。然后设置延时采集，在每帧中使用 488 纳米激光线照射样品以检测 GCaMP 荧光，并定期使用 561 纳米激光线照射 Chrimson 激发。

对于体内钙成像，使用2D反卷积和图像对齐来校正采集过程中与蠕虫运动的微小偏差。然后将DD树突棘定义为感兴趣区域或ROI。复制ROI并重新定位到蠕虫内部的邻近区域以收集背景信号。

然后使用适当的软件，将每个时间点的GFP强度导出到Excel，并从脊柱ROI荧光中减去背景荧光。通过减去561纳米激发前帧中的GFP荧光或激发后每个时间点的零点或Delta F来确定荧光的变化，然后除以F零以确定F零上的Delta F。并绘制规范化跟踪图。

首先，使用 Shapiro-Wilk 检验确定数据是否呈正态分布。对于非正态分布的数据，请使用非参数方差分析，并对多个测试进行事后校正。或者，对于显示正态分布或高斯分布的测量，在每个 561 纳米脉冲之前和之后对 GCaMP 荧光的每次测量执行配对参数方差分析检验。

并纠正两组中每组的多重比较。用三个独立的标记标记DD树突棘，细胞溶质mCherry，MYR:mRuby和LifeAct:GFP标记DD树突棘，在野生型年轻人中，每10微米DD树突的平均密度为3.4 DD树突棘。GFP:Utrophin标志物被排除在这种分析之外，因为它产生了显着较低的脊柱密度，这可能是由于utrophin与驱动脊柱形态发生的肌动蛋白细胞骨架的相互作用。

活细胞成像方法证实，与丝状、粗短和分枝等其他脊柱形状相比，DD 棘的薄蘑菇形形态在成人中占主导地位。通过DD神经元中表达GCaMP的转基因蠕虫中的突触前胆碱能信号传导和突触前VA神经元中的Chrimson来评估DD树突棘的激活。在突触前VA神经元中Chrimson的光遗传学激活后，立即在DD棘中检测到GCaMP信号的瞬时爆发。

在没有ATR的情况下进行的对照实验证实，GCaMP信号的测量取决于Chrimson的光遗传学激活，而Chrimson严格依赖于ATR。为了可视化DD刺，最好对侧卧的动物进行成像，例如突出的刺与光路成直角。通过这种方法，科学家还可以使用药理学操作来了解驱动DD棘中钙瞬变的机制。