Esperimenti NMR ad alta pressione per il rilevamento di stati conformazionali a bassa pressione delle proteine

L'alta pressione è il metodo di scelta per modificare la popolazione relativa di un campione conformazionale proteico. È estremamente utile per isolare e caratterizzare stati conformazionali ad alta energia. Rispetto a tutti i metodi di perturbazione, come pH o temperatura, la perturbazione a pressione è facile da applicare e completamente reversibile.

È anche una perturbazione locale, che colpisce principalmente le regioni con cavità di vetro o volumi vuoti. Per iniziare, introdurre il campione etichettato con azoto-15 nella provetta di zirconia usando una pipetta di vetro e assicurarsi che il campione si sieda nella parte inferiore del tubo. Per evitare che il campione si mescoli con il liquido di trasmissione, sovrapporre il campione con 200 microlitri di olio minerale e quindi riempire il resto del tubo con liquido di trasmissione.

Mettere un O-ring monouso sopra il tubo di zirconia e far scorrere il tubo nella base. Quindi collegare il tubo alla linea di collegamento ad alta pressione e stringere la base alla cella a mano. Quindi applicare una coppia di 14,7 newton metri per evitare perdite a pressione inferiore.

Per verificare l'integrità del gruppo cella di pressione, pressurizzare il tubo fino a 300 bar all'esterno dello spettrometro utilizzando il supporto della cella e il contenitore di contenimento. Dopo 15 minuti, ripristinare la pressione a una barra e verificare la disponibilità di perdite con una salvietta pulita senza lanugine. Inserire il tubo non pressurizzato nello spettrometro guidando attentamente la linea di legame.

Far scorrere il tubo nello spettrometro fino a quando il tubo raggiunge la posizione seduta del campione. Blocca, shim, abbina e sintonizza i canali del prozio e dell'azoto e salva gli spessori ottimizzati per il futuro. Impostare la spettroscopia ottimizzata per il rilassamento trasversale con spettroscopia coerente etero-singolo-quantistica e procedere con la registrazione di un esperimento di riferimento alle condizioni atmosferiche.

Registra una serie di esperimenti 2D da una barra a 2,5 kilobar per ogni 500 bar. Se sono note le velocità precise di piegatura o di dispiegamento, dopo ogni incremento di 500 bar, lasciare che il campione si equilibri per 15-20 minuti. Quando il punto di flessione della transizione di piegatura o dispiegamento raggiunge, registrare ulteriori esperimenti per migliorare la precisione della vestibilità.

Questo protocollo è stato utilizzato per sondare la dipendenza dalla pressione di RRM2, il secondo motivo di riconoscimento dell'RNA eterogeneo ribonucleoproteina nucleare A1. La spettroscopia ottimizzata per il rilassamento trasversale con spettri di spettroscopia a coerenza quantistica singola etero è stata raccolta a una barra, 1,5 kilobar, due kilobar e 2,5 kilobar. L'RRM2 è quasi completamente aperto all'interno della gamma di 2,5 kilobar. I singoli profili di intensità di pressione sono stati montati secondo l'equazione mostrata qui, per ottenere le corrispondenti variazioni dell'energia libera di Gibbs standard e del volume associati alla reazione di dispiegamento.

Quando mappati sulla struttura del dominio, i residui con la più grande grandezza di variazione di volume sono stati trovati all'interno del nucleo strutturale del dominio, mentre quelli con la più piccola grandezza della variazione di volume si trovavano principalmente negli anelli di collegamento tra i filamenti beta e il filamento beta all'elica terminale C. Per sondare il grado di comprimibilità e l'eterogeneità conformazionale dell'insieme di stati piegati, sono stati analizzati gli spostamenti chimici del prozio. I profili individuali degli spostamenti chimici del prozio in funzione della pressione sono stati montati utilizzando l'equazione mostrata, per estrarre i coefficienti lineari e non lineari specifici del sito.

I residui con i più grandi coefficienti non lineari sono stati per lo più trovati nel nucleo strutturale del dominio, mentre i residui con i più piccoli coefficienti non lineari sono stati per lo più situati all'interno di anelli che collegano i diversi motivi strutturali. È importante impostare il tubo come una pressione impostata correttamente, per evitare perdite. Se si verifica una perdita, la sonda dovrebbe probabilmente essere rimossa per ripulire qualsiasi traccia di olio minerale.