Dissezione ovarica planaria per analisi ultrastrutturale e colorazione anticorpale
10 settembre 2021
Questo protocollo presenta le misure adottate per sezionare le ovaie nelle planarie d'acqua dolce, Schmidtea mediterranea. Le ovaie sezionate sono compatibili per l'immunocolorazione anticorpale e l'analisi ultrastrutturale con microscopia elettronica a trasmissione per studiare la biologia cellulare degli ovociti e delle cellule somatiche, fornendo una profondità e una qualità di imaging precedentemente inaccessibili.
L'obiettivo di questo metodo è quello di sezionare le ovaie della Schmidtea mediterranea planaria per l'analisi cellulare e subcellulare della biologia degli ovociti con TEM o colorazione anticorpale. Questo protocollo utilizza una breve fase di fissazione per facilitare la localizzazione e la dissezione delle ovaie planarie, che fornirà una profondità e una qualità di imaging precedentemente inaccessibili. La lotta più grande per chi non ha mai eseguito questa tecnica prima sarà quella di localizzare le ovaie dopo la fissazione.
Sarà utile familiarizzare con l'anatomia delle planarie sessuali prima dell'esperimento. Preparati per l'esperimento alimentando le planarie sessuali con pasta di fegato biologica due volte a settimana per raggiungere la maturità sessuale. Trattare i vermi sessualmente maturi con il 5% di N-acetil-L-cisteina, o NAC, in un piatto a temperatura ambiente per cinque minuti.
Sostituire la NAC con 10 millilitri di paraformaldeide al 4% appena preparata e fissare i vermi per un'ora a temperatura ambiente agitando di tanto in tanto. Iniziare la dissezione 10 minuti dopo l'aggiunta del 4% di paraformaldeide poiché i vermi vengono fissati. Osservare la pigmentazione epiteliale per localizzare le corde nervose ventrali, che appaiono come due linee con una pigmentazione più chiara che va dai gangli cefalici anteriori verso la coda.
Localizzare le ovaie putative osservando la pigmentazione e convalidare la loro posizione. Usando due coltelli chirurgici, praticare dei tagli posteriori e anteriori alle ovaie per rimuovere completamente i frammenti di verme anteriori e posteriori. Usa un coltello per ancorare il verme e l'altro coltello per la dissezione.
Pulire il coltello utilizzato per eseguire i tagli. Per separare le due ovaie, tagliare la linea mediana del frammento dell'ovaio, quindi capovolgere il frammento con il lato ventrale rivolto verso il basso. Usa due paia di pinzette appuntite di tipo 5-SA per staccare il tessuto dorsale e esporre l'intestino.
Rimuovere delicatamente i rami intestinali che si trovano sopra i tessuti ventrali con la punta delle pinzette o una spazzola morbida per esporre l'ovaio. Rimuovere i tessuti circostanti per estrarre l'ovaio. Estrarre le ovaie e trasferirle in un tubo da 1,5 millilitri per lavarle con 1 millilitro di PBS.
I modelli di pigmentazione dorsale e ventrale sono stati utilizzati per localizzare la posizione delle ovaie. Il tessuto in eccesso è stato tagliato via passo dopo passo. Una volta che l'ovaio è stato esposto, il tessuto circostante è stato tagliato via.
Le ovaie contenenti più tipi di cellule somatiche sono state utilizzate sia per l'analisi ultrastrutturale che per la colorazione in immunofluorescenza. Le ovaie sezionate consentono un imaging di alta qualità dell'anatomia cellulare e subcellulare degli ovociti. Questa procedura dovrebbe consentire esperimenti di interferenza dell'RNA per esaminare le regolazioni molecolari della biologia degli ovociti.
Questa tecnica ha portato alla scoperta di un nuovo fenomeno negli ovociti dei vermi piatti che l'involucro nucleare si scompone in vescicole che incapsulano le proteine nucleari invece di rimanere intatte, ovvero la mitosi chiusa, o la rottura in pezzi, nota anche come mitosi aperta.
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Panoramica
Questo protocollo descrive la dissezione delle ovaie nel planario d'acqua dolce Schmidtea mediterranea, finalizzata a consentire l'analisi cellulare e subcellulare della biologia degli oociti. Il metodo migliora la qualità e la profondità dell'immagine mediante tecniche come la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) e l'immunomarcatura con anticorpi.
Componenti Chiave dello Studio
Area di Ricerca
- Biologia cellulare
- Analisi degli ovociti
- Biologia dei planari
Sfondo
- L'anatomia dei planari sessuali è fondamentale per una dissezione efficace.
- L'alimentazione dei planari con pasta di fegato organica favorisce la maturità sessuale.
- Le ovaie vengono localizzate in base ai modelli di pigmentazione dell'epitelio.
Metodi Utilizzati
- Metodi di dissezione chirurgica
- Planaria d'acqua dolce Schmidtea mediterranea
- Microscopia elettronica a trasmissione (TEM) e colorazione immunofluorescente
Risultati principali
- Localizzazione ed dissezione efficiente delle ovaie nei planari sessuali.
- Acquisizione di immagini di alta qualità di strutture cellulari e tipi cellulari somatici.
- Il metodo supporta esperimenti di interferenza dell'RNA per lo studio delle regolazioni molecolari.
Conclusioni
- Questo studio fornisce una nuova tecnica per l'analisi delle cellule riproduttive nei planari.
- Permette di approfondire la conoscenza della biologia degli ovociti e supporta futuri studi genetici.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'accesso diretto alle ovaie intatte di planaria consente un'analisi ad alta risoluzione dello sviluppo delle cellule germinali, supportando la riduzione dei rischi meccanicistici nelle fasi iniziali della scoperta. Questo protocollo facilita l'analisi quantitativa mediante imaging e l'interrogazione molecolare della biologia degli ovociti, migliorando la capacità predittiva negli studi sulla linea germinale. L'approccio si colloca in una posizione strategica per guidare la validazione degli obiettivi e la genomica funzionale nei percorsi di biologia riproduttiva.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Consente un'analisi precisa dello sviluppo delle cellule germinali e dei processi meiotici.
- Permette la validazione funzionale di perturbazioni geniche mediante interferenza dell'RNA negli ovociti.
- Migliora la chiarezza meccanicistica nella selezione e riduzione del rischio dei bersagli riproduttivi.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce una preparazione standardizzata di ovari integri per analisi di imaging e saggi basati su anticorpi.
- Permette un'analisi quantitativa riproducibile di strutture cellulari e subcellulari.
- Consente una valutazione robusta della funzione genica in condizioni sperimentali controllate.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea a modelli rilevanti per lo studio dell'epigenetica della linea germinale e dell'architettura cellulare.
- Permette una continuità dalla scoperta alla validazione preclinica di bersagli riproduttivi.
- Fornisce informazioni predittive sui meccanismi conservati della biologia dell'ovocita.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo di dissezione si integra nelle fasi iniziali di scoperta e di validazione del bersaglio, consentendo analisi ultrastrutturali e di immunomarcatura. Supporta flussi di lavoro che vanno dal test delle ipotesi alla valutazione della funzione genica in sistemi germinativi.
- Biologia della scoperta: Facilita studi basati su ipotesi sulla specificazione delle cellule germinali e sulla regolazione della meiosi.
- Screening: Fornisce tessuto ovarico pronto all'uso per imaging quantitativo e screening con anticorpi.
- Analisi: Offre letture cellulari e subcellulari ad alta risoluzione per analisi comparative.
- Ricerca traslazionale: Collega la scoperta fondamentale alla valutazione preclinica di bersagli riproduttivi.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un protocollo riutilizzabile per diversi studi sulla linea germinale e su perturbazioni geniche.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità nella validazione dei bersagli nelle cellule germinali.
- Valore operativo: Standardizza le procedure di dissezione e di imaging dell'ovaio per garantire riproducibilità.
- Valore strategico: Permette decisioni informate di prosecuzione o interruzione nei portafogli di biologia della riproduzione.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione basata sul rischio dei bersagli germinativi e degli studi sulla funzione genica.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'anatomia planariana e nelle tecniche di dissezione.
- Necessita dell'accesso a microscopia elettronica a trasmissione e a infrastrutture per l'immunomarcatura.
- Richiede una standardizzazione tra gruppi di lavoro per la preparazione e l'acquisizione di immagini riproducibili dei tessuti.
- Potrebbe essere necessaria un'adattamento per altri sistemi modello di invertebrati o di linee germinali.
- È limitato dal ridotto numero e dalla localizzazione profonda degli oociti planariani.
