Name: Un modello di roditore ischemico del pericardio intatto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: Scopri un modello murino di infarto del miocardio con pericardio intatto per studiare il ruolo della cavità pericardica nella riparazione cardiaca. Questo metodo consente di valutare strategie terapeutiche mirate.

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Per questi esperimenti sono stati utilizzati topi maschi e femmine C57BL / 6J tra 8-14 settimane di età. Questo protocollo ha ricevuto l'approvazione etica dal Comitato per la cura degli animali dell'Università di Calgary e segue tutte le linee guida sulla cura degli animali.
1. Preparazione e chirurgia del topo
<ol><li>Sterilizzare gli strumenti chirurgici (tramite sterilizzatore di perline o autoclave).</li>
	<li>Pesare il topo per il peso prechirurgico e la dose analgesica.</li>
	<li>Posizionare il mouse in una scatola di induzione con isoflurano al 4% e 800 ml/min di ossigeno. Confermare il piano anestetico pizzicando le dita dei piedi e osservando l'animale per mancanza di riflesso.</li>
	<li>Iniettare analgesico per via sottocutanea (0,1 mg/kg di buprenorfina) (vedere Tabella dei materiali).</li>
	<li>Posizionare il topo su un tampone chirurgico riscaldato durante l'intervento chirurgico e mantenere l'anestesia con isoflurano al 3% erogato tramite cono nasale. Applicare unguento oftalmico per evitare secchezza oculare a ciascun occhio.</li>
	<li>Rasare i capelli dalle aree chirurgiche del torace e del collo.</li>
	<li>Trattenere le zampe del topo e posizionarle sul tavolo chirurgico.</li>
	<li>Intubare il topo inserendo un catetere 23 G a punta liscia nella trachea attraverso la bocca e la faringe.<ol><li>Ventilare il topo dopo l'intubazione con isoflurano al 2% e ossigeno al 100% come gas di trasporto utilizzando un ventilatore commerciale (vedi tabella dei materiali) impostato a una velocità di 110 respiri / min, un volume corrente di 250 μL e pressione positiva di fine espirazione (PEEP) di 4 mmHg.</li>
	</ol></li>
	<li>Ruotare il mouse del 30% sul lato destro per posizionare il lato sinistro del torace per un intervento chirurgico.</li>
	<li>Pulire l'area chirurgica con 3 scrub alternati di etanolo al 70% e betadine con movimenti circolari (vediTabella dei materiali). Posizionare teli chirurgici sterili intorno all'area chirurgica.</li>
	<li>Fai un'incisione laterale di 2-3 cm nella pelle del torace per visualizzare i muscoli pettorali sul lato sinistro. Tagliare le pettorali maggiori e minori usando un'incisione di 1 cm dalla linea mediana verso l'esterno per visualizzare i muscoli intercostali tra la terza e la quarta costola. NOTA: Prestare attenzione per evitare un eccessivo sanguinamento dal muscolo pettorale attraverso la cauterizzazione dei vasi sanguinanti.</li>
	<li>Fare un'incisione di 2 cm nel muscolo intercostale sinistro per introdurre aria (con movimento passivo dell'aria) nella cavità toracica per consentire al cuore e ai polmoni di allontanarsi dall'incisione chirurgica. Inoltre, espandere l'apertura con l'aiuto di un dispositivo di cauterizzazione (vedi Tabella dei materiali) per incidere l'intercostale e prevenire il sanguinamento NOTA: Il ventilatore deve essere temporaneamente interrotto durante il periodo di cauterizzazione per evitare reazioni esplosive con l'ossigeno. Si fa attenzione a non danneggiare il sacco pericardico.</li>
	<li>Usando i divaricatori, ritrarre le costole per esporre il cuore.</li>
	<li>Osservare il pericardio e il cuore sottostante sotto uno stereomicroscopio. NOTA: Il pericardio del topo è abbastanza sottile da visualizzare la vascolarizzazione del cuore.</li>
	<li>Posizionare delicatamente una pinza sulla superficie del pericardio per ridurre il suo movimento e quello del cuore sottostante.</li>
	<li>Evidenziare visivamente l'arteria coronaria discendente anteriore sinistra (LAD) tracciando la sua emersione da sotto l'appendice sinistra.</li>
	<li>Utilizzando il micro-needle driver, guidare una sutura appropriata (vedi Tabella dei materiali) attraverso il pericardio, sotto il LAD, con la sutura che emerge dall'altro lato del LAD e del pericardio. Legare la sutura per limitare il flusso sanguigno attraverso l'arteria coronaria e tagliare la sutura in eccesso con l'aiuto delle forbici (Figura 1A). NOTA: Dopo aver limitato il flusso sanguigno all'arteria coronaria, dovrebbe essere visibile lo sbiancamento della porzione anteriore del ventricolo sinistro. Questa procedura rappresenta un modello di legatura permanente. Tuttavia, in questa fase potrebbe essere applicato anche un approccio di legatura transitoria con diversi periodi di ischemia.</li>
	<li>Sotto il sito di incisione all'interno dell'area sterile, introdurre un catetere da 24 G per via percutanea nel torace (rimuovere l'ago guida dopo essere entrato nella cavità toracica). Quindi, chiudere le costole seguite dagli strati muscolari e dalla pelle usando una sutura appropriata (un ago conico per i muscoli, un ago da taglio convenzionale per la pelle).</li>
	<li>Una volta chiuso il torace, evacuare l'aria rimanente dalla cavità toracica attraverso il catetere da 24 G mediante aspirazione delicata con una siringa da 3 ml e compressioni toraciche. Una volta rimossa l'aria, estrarre il catetere da 24 G.</li>
	<li>Ridurre l'isoflurano all'1%.</li>
	<li>Spegnere l'isoflurano mantenendo la ventilazione con ossigeno per consentire al topo di riprendersi dall'anestesia. Una volta che l'animale mostra segni di respirazione indipendente, rimuovere il tubo tracheale da 23 G dalla bocca e posizionare il topo in una gabbia di recupero da monitorare per la ripresa della normale respirazione.</li>
	<li>Consentire al mouse di recuperare nella gabbia con una parte della gabbia posizionata su un pad riscaldante per fornire una fonte di calore esterna.</li>
	<li>Fornire iniezioni di mantenimento di analgesico (Buprenorfina 0,1 mg/kg, per via sottocutanea) ogni 12 ore per 72 ore post-operatorie.</li>
	<li>Monitorare lo stato di salute dei topi ogni giorno per 7 giorni, che include la valutazione delle incisioni e del disagio degli animali. NOTA: A causa dell'invasività di questa procedura (toracotomia), può essere necessaria la somministrazione di antibiotici.</li>
</ol>2. Valutazione funzionale della funzione cardiaca mediante ecocardiografia (ECG)
<ol><li>Indurre e mantenere il topo in anestesia generale con isoflurano all'1,5-2% e 800 ml/min di ossigeno.</li>
	<li>Posizionare il mouse in posizione supina su una piattaforma scenica riscaldata e attaccare le zampe agli elettrocateteri ECG.</li>
	<li>Rasare il petto del mouse.</li>
	<li>Acquisire immagini ecocardiografiche utilizzando una sonda trasduttore lineare a 40 MHz e gel di contatto e analizzarle con il software appropriato (vedi Tabella dei materiali).</li>
	<li>Spegnere l'isoflurano e consentire al mouse di recuperare sulla piattaforma di riscaldamento prima di riportare la gabbia a uno stato attivo. NOTA: La valutazione dell'ecocardiografia non è invasiva e quindi può essere eseguita longitudinalmente durante l'esperimento per determinare i cambiamenti prima e dopo la legatura coronarica.</li>
</ol>3. Raccolta del tessuto cardiaco per la colorazione della fibrosi
<ol><li>Sacrificare i topi con l'inalazione di CO 2 al 100% e sezionare attentamente il cuore. NOTA: Usando forbici e pinze, questo si ottiene tagliando attraverso i grandi vasi che entrano (vena cava, vena polmonare) ed escono (arteria polmonare, aorta) il cuore per liberarlo dal sistema circolatorio nella cavità toracica.</li>
	<li>Fissare il cuore in formalina al 10% per almeno 24 ore.</li>
	<li>Tagliare i campioni usando una lama di rasoio dritta attraverso il ventricolo destro, il setto interventricolare e il ventricolo sinistro, assicurandosi che l'incisione attraversi il centro della zona dell'infarto. I campioni vengono quindi inviati alla struttura principale per l'incorporazione della paraffina.</li>
	<li>Tagliare sezioni di tessuto di 5 μm di spessore con un microtomo e posizionarle su vetrini per la colorazione.</li>
	<li>Deparaffinizzare utilizzando xilene commerciale e lavaggi con alcool graduato (2x 99%, 1x 95%, 1x 70%) con acqua deionizzata, quindi reidratare.</li>
	<li>Colorare con 0,1% di rosso Sirio in acido picrico per 2 ore a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavare le sezioni con acido acetico allo 0,5% per 3 minuti e risciacquare con etanolo al 70% per 1 min.</li>
	<li>Disidratare le sezioni utilizzando l'ordine inverso dei lavaggi descritto al punto 3.4, con concentrazioni di etanolo crescenti e graduate, quindi xilene.</li>
	<li>Montare sezioni di tessuto con una soluzione di montaggio (vedi Tabella dei materiali) per la valutazione microscopica.</li>
</ol>4. Citometria a flusso del lavaggio del cuore e della cavità pericardica
<ol><li>Sacrificare i topi con l'inalazione di CO2 al 100% per effetto.</li>
	<li>Posizionare il mouse sul dorso e fissare le braccia e le gambe a una tavola chirurgica usando del nastro adesivo.</li>
	<li>Aprire con attenzione il lato sinistro (lato destro dalla vista dello sperimentatore) della cavità toracica, iniziando con il taglio del diaframma fino a circa il punto medio e successivamente tagliando le costole esterne verso lo sterno. NOTA: Evitare di intaccare i grandi vasi sanguigni, in particolare quelli che corrono paralleli allo sterno.</li>
	<li>Ritrarre le costole usando un emostatico per esporre il cuore e il pericardio sottostanti. NOTA: Il pericardio è molto fragile, quindi assicurati di non prenderlo con le forbici durante il taglio.</li>
	<li>Utilizzando un catetere per tubi PE-10 (vedi Tabella dei materiali) inserito nello spazio pericardico vicino alla giunzione dell'atrio sinistro e del ventricolo sinistro, iniettare 100 μL di soluzione salina sterile nella cavità pericardica.<ol><li>Lasciare che la soluzione salina si accumuli e si raccolga dal lato posteriore del cuore, facendo attenzione a non perforare o strappare il pericardio nel processo. Ripeti questo passaggio due volte e posiziona il liquido di lavaggio sul ghiaccio durante l'elaborazione del cuore.</li>
	</ol></li>
	<li>Accisa il cuore tagliando i vasi principali (aorta, arteria polmonare, vena e vena cava) che entrano ed escono dal cuore. Rimuovere gli atri destro e sinistro e pesare il tessuto cardiaco ventricolare.</li>
	<li>Tritare il tessuto in piccoli pezzi da 1 mm2 con le forbici e introdurre 10 mL di tampone digestivo contenente 450 U/mL di collagenasi I, 125 U/mL di collagenasi XI, 60 U/mL di DNasi I e 60 U/mL di ialuronidasi in PBS per 1 ora a 37 °C su uno shaker orbitale.</li>
	<li>Far passare omogenati il tessuto cardiaco attraverso un filtro cellulare da 70 μm (vedere la tabella dei materiali) e ruotare verso il basso a 60 x g per 5 minuti a 4 °C per rimuovere le cellule parenchimali cardiache.</li>
	<li>Raccogliere il surnatante, passare attraverso un filtro cellulare da 40 μm (vedere la tabella dei materiali) per una sospensione a cella singola e ruotare verso il basso a 400 x g per 5 minuti a 4 °C per pellettare le celle.</li>
	<li>Eseguire il blocco del recettore cristallizzabile (Fc) dei frammenti e la colorazione dei marcatori cellulari sulle cellule pericardiche e cardiache come descritto in precedenza8.</li>
	<li>Eseguire campioni su un citometro a flusso.</li>
</ol>5. Marcatura dei macrofagi pericardici utilizzando il metodo ICAPS (Intercostal Approach to the Pleural Space)9
<ol><li>Sterilizzare gli strumenti chirurgici (tramite sterilizzatore a perline o autoclave) e spruzzare etanolo al 70% prima di iniziare.</li>
	<li>Indurre e mantenere il topo in anestesia generale con isoflurano all'1,5-2% e 800 ml/min di ossigeno. Confermare il piano anestetico pizzicando le dita dei piedi e osservando l'animale per mancanza di riflesso.</li>
	<li>Iniettare analgesici per via sottocutanea (Buprenorfina 0,1 mg/Kg).</li>
	<li>Posizionare il mouse su un pad chirurgico riscaldato durante l'intervento chirurgico.</li>
	<li>Rasare l'area toracica anterolaterale destra.</li>
	<li>Pulire l'area chirurgica con etanolo e betadine.</li>
	<li>Fai un'incisione lunga 3 cm nella pelle e con una pinza espongi la gabbia toracica.</li>
	<li>Caricare 5 μL di sfere fluorescenti (microsfere fluorescenti disponibili in commercio, 1 μm, vedere Tabella dei materiali) e 45 μL di soluzione salina in un catetere per siringa a tubo PE-10 con punta smussata.</li>
	<li>Guidare il catetere nello spazio intercostale come descritto in precedenza9, iniettare lentamente la soluzione di perline e rimuovere il catetere con un solo movimento.</li>
	<li>Chiudere la pelle usando graffette. NOTA: Le graffette vengono utilizzate al posto delle suture per ridurre al minimo la potenziale riapertura dell'incisione.</li>
	<li>Spegnere l'isoflurano, posizionare il mouse nella gabbia di recupero e monitorare eventuali complicazioni nelle prime 24 ore.</li>
</ol>

<ol><li>Virani, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+disease+and+stroke+statistics-2020+update%3A+A+report+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association.</a> Circulation. 141, 139(2020).</li>
<li>Iismaa, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+regenerative+mechanisms+across+different+mammalian+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Comparative regenerative mechanisms across different mammalian tissues.</a> NPJ Regenerative Medicine. 3 (6), eCollection 2018 (2018).</li>
<li>Bayat, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+heart+failure+after+myocardial+infarction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Research+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Progressive heart failure after myocardial infarction in mice.</a> Basic Research in Cardiology. 97 (3), 206-213 (2002).</li>
<li>Virag, J. A., Lust, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+artery+ligation+and+intramyocardial+injection+in+a+murine+model+of+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction.</a> Journal of Visualized Experiments. 52, 2581(2011).</li>
<li>De Villiers, C., Riley, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+myocardial+infarction%3A+comparing+permanent+ligation+and+ischaemia-reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Mouse models of myocardial infarction: comparing permanent ligation and ischaemia-reperfusion.</a> Disease Models & Mechanisms. 13 (11), (2020).</li>
<li>Borlaug, B. A., Reddy, Y. N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+pericardium+in+heart+failure%3A+Implications+for+pathophysiology+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22JACC+Heart+Failure%22%5BJournal%5D)">The role of the pericardium in heart failure: Implications for pathophysiology and treatment.</a> JACC Heart Failure. 7 (7), 574-585 (2019).</li>
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<li>Deniset, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gata6%28%2B%29+Pericardial+Cavity+Macrophages+Relocate+to+the+Injured+Heart+and+Prevent+Cardiac+Fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Gata6(+) Pericardial Cavity Macrophages Relocate to the Injured Heart and Prevent Cardiac Fibrosis.</a> Immunity. 51 (1), 131-140 (2019).</li>
<li>Weber, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+targeting+of+the+pleural+space+by+intercostal+approach%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Pulmonary+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immune targeting of the pleural space by intercostal approach.</a> BMC Pulmonary Medicine. 15, 14(2015).</li>
<li>Nakatani, T., Shinohara, H., Fukuo, Y., Morisawa, S., Matsuda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericardium+of+rodents%3A+pores+connect+the+pericardial+and+pleural+cavities%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Pericardium of rodents: pores connect the pericardial and pleural cavities.</a> The Anatomical Record. 220, 132-137 (1988).</li>
<li>Tyberg, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+pericardial+pressure+and+right+atrial+pressure%3A+an+intraoperative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">The relationship between pericardial pressure and right atrial pressure: an intraoperative study.</a> Circulation. 73, 428-432 (1986).</li>
<li>Hamilton, D. R., Sas, R., Semlacher, R. A., Kieser Prieur, T. M., Tyberg, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+left+and+right+pericardial+pressures+in+humans%3A+an+intraoperative+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Canadian+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The relationship between left and right pericardial pressures in humans: an intraoperative study.</a> The Canadian Journal of Cardiology. 27, 346-350 (2011).</li>
<li>Park, D. S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pericardial+proteoglycan+4+%28lubricin%29%3A+Implications+for+postcardiotomy+intrathoracic+adhesion+formation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Human pericardial proteoglycan 4 (lubricin): Implications for postcardiotomy intrathoracic adhesion formation.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 156 (4), 1598-1608 (2018).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti da rivelare.

L'induzione di un infarto miocardico in un pericardio chiuso nei roditori è unica e può avere applicazioni potenzialmente significative. La procedura si basa fortemente sulla familiarità del chirurgo con il modello di roditore e l'anatomia cardiaca del roditore. Il successo dipende anche dalla cura prestata durante tre fasi critiche: incisione muscolare intercostale e retrazione delle costole (fasi 1.11-1.13), creazione dell'infarto (fase 1.17) e recupero degli animali (fasi 1.22-1.24).
La tor...

Ad oggi, le malattie cardiovascolari (CVD) sono riconosciute come la principale causa di morte a livello globale, con conseguente significativo onere finanziario e riduzione della qualità della vita dei pazienti1. La malattia coronarica (CAD) è un sottotipo di CVD e svolge un ruolo essenziale nello sviluppo dell'infarto miocardico (IM), che è uno dei principali contributori alla mortalità. Per definizione, l'infarto miocardico deriva da lesioni irreversibili al tessuto miocardico dovute a condizioni prolungate di ischemia e ipossia. Il tessuto miocardico manca di capacità di rigenerazione, quindi le lesioni sono permanenti e comportano la sostituzione del muscolo cardiaco con una cicatrice fibrotica che può essere inizialmente protettiva, ma alla fine contribuisce al rimodellamento cardiaco avverso e all'eventuale insufficienza cardiaca2.
Sebbene la gestione dei pazienti con CAD sia notevolmente migliorata negli ultimi decenni, l'insufficienza cardiaca cronica (CHF) secondaria a ischemia colpisce molti pazienti in tutto il mondo. Per prevenire e gestire questa epidemia, è necessario comprendere più ampiamente i meccanismi sottostanti e sviluppare nuovi approcci terapeutici. Inoltre, i risultati precedenti evidenziano i limiti della terapia sistemica e la necessità di sviluppare alternative precise. Dato che lo studio delle sequele molecolari dell'infarto miocardico nell'uomo è influenzato dalla capacità di accedere al tessuto infartuato, sono indispensabili modelli animali che ricapitolino le caratteristiche e lo sviluppo dell'infarto miocardico umano e della CHF correlati alla CVD.
Poiché i modelli animali ideali assomigliano molto a un disturbo umano per caratteristiche strutturali e funzionali, l'eziologia della malattia dovrebbe guidare il loro concepimento. Nella CAD, è la stenosi aterosclerotica cronica delle arterie coronarie o occlusione trombotica acuta. Diversi metodi sono stati sviluppati e applicati in varie specie di animali da laboratorio per indurre il restringimento o l'occlusione dell'arteria coronaria. Tali strategie possono essere ampiamente classificate in due gruppi: (1) manipolazione meccanica di un'arteria coronaria per indurre un MI e (2) accelerazione dell'aterosclerosi per facilitare il restringimento coronarico che porta a un IM. La prima strategia di solito comporta la legatura di un'arteria coronaria o il posizionamento di uno stent all'interno dell'arteria. Il secondo approccio tende a basarsi sulla modifica della dieta dell'animale per includere alimenti ricchi di grassi / colesterolo. Alcuni dei limiti di quest'ultimo approccio includono la mancanza di controllo sui tempi e sul sito delle occlusioni coronariche.
Al contrario, l'induzione chirurgica di infarto miocardico o ischemia in un modello animale ha diversi vantaggi, come la posizione, i tempi precisi e l'estensione dell'evento coronarico, portando a risultati più riproducibili. Il metodo più utilizzato è la legatura chirurgica dell'arteria coronaria discendente anteriore sinistra (LAD). Tali modelli riassumono le risposte umane al danno ischemico acuto, nonché la progressione a CHF3. Inizialmente sviluppata in animali più grandi, la chirurgia LAD su piccoli animali come i roditori è diventata più fattibile con i progressi della tecnologia4. Nello stabilire tali modelli, i topi sono stati favoriti per vari motivi, tra cui la loro relativa disponibilità, la bassa spesa per l'alloggio e la loro capacità di manipolazione genetica.
I modelli chirurgici contemporanei di cardiopatia ischemica che utilizzano l'occlusione LAD richiedono al ricercatore di aprire il pericardio per legare temporaneamente o permanentemente l'arteria5. Tali strategie comportano l'interruzione dello spazio pericardico, che svolge una funzione essenzialmente meccanica e lubrificante per garantire una corretta funzione cardiaca. Un altro svantaggio dell'apertura del pericardio è la perdita del liquido pericardico nativo dell'animale con i suoi vari componenti cellulari e proteici 6,7. In risposta, abbiamo sviluppato un metodo per indurre l'infarto miocardico mantenendo intatto il pericardio. Oltre a ridurre al minimo la perturbazione di questo ambiente omeostatico, questo approccio consente di etichettare e tracciare cellule specifiche dopo aver causato un MI. Inoltre, questo approccio rappresenta meglio la lesione ischemica miocardica in ambito umano.

<table><tbody><tr><td>Steri-350 Sterilizzatore di perline</td><td>Inotech</td><td>NC9449759</td><td></td></tr><tr><td>10% formalina</td><td>Millipore Sigma</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>40 &; m Filtro cellulare</td><td>VWR</td><td>CA21008-949</td><td>Falcon, 352340</td></tr><tr><td>70 &micro; m Filtro cellulare</td><td>VWR</td><td>CA21008-952</td><td>Falcon, 352350</td></tr><tr><td>ACK Tampone di lisi</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>BD Insyte-W Ago per catetere 24 G X 3/4"</td><td>CDMV Inc</td><td>108778</td><td></td></tr><tr><td>Betadine (soluzione topica di iodio povidone al 10%)</td> <td>CDMV Inc</td><td>104826</td><td></td></tr><tr><td>Pinze smussate</td><td>Strumenti per la scienza fine</td><td>FST 11000-12</td><td></td></tr><tr><td>BNP Unguento oftalmico</td><td>CDMV Inc</td><td>17909</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo Needle Driver</td><td>Fine Science Tools</td><td>FST 12061-01</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga 5810R</td><td>Eppendorf</td><td>22625101</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi I</td><td>Millipore Sigma</td><td>SCR103</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi XI</td><td>Millipore Sigma</td><td>C7657</td><td></td></tr><tr><td>Covidien 5-0 Sutura polisorbia - Ago conico CV-11</td><td>Medtronic Canada</td><td>GL-890</td><td></td></tr><tr><td>Covidien 5-0 Sutura in polisorbo - Ago da taglio PC-13</td><td>Medtronic Canada</td><td>SL-1659</td><td></td></tr><tr><td>Pinze smussate curve</td><td>Strumenti per la scienza fine</td><td>FST 11009-13</td><td></td></tr><tr><td>Dako Mezzo di montaggio</td><td>Agilen</td><td>CS70330-2</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Millipore Sigma</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo, 100%</td> <td>Millipore Sigma</td><td>MFCD00003568</td><td></td></tr><tr><td>Ethicon 8-0 Sutura Ethilon - BV-130-4 ago conico</td><td>Johnson & Johnson Inc.</td><td>2815G</td><td></td></tr><tr><td>Luce a fibre ottiche</td><td>Nikon</td><td>2208502</td><td></td></tr><tr><td>Pinze fini</td><td>Strumenti di scienza fine</td><td>FST 11150-10</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresbrite&reg; YG Microsfere di carbossilato 1,00 &; m</td><td>Poliscienze, Inc.</td><td>15702</td><td></td></tr><tr><td>Unità di cauterizzazione termica Geiger</td><td>World Precision Instruments</td><td>501293</td><td>Modello 150-ST</td></tr><tr><td>Ialuronidasi</td><td>Millipore Sigma</td><td>H4272</td><td></td></tr><tr><td>Vaporizzatore isofluorano</td><td>Apparecchio Harvard</td><td>75-0951</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano USP, 250 mL</td><td>CDMV Inc</td><td>108737</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di retrazione del fissatore magnetico</td><td>Strumenti di scienza fine</td><td>18200-20</td><td></td></tr><tr><td>MX550D- Sonda 40 MHz</td><td>Fujifilm- Visual Sonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Needle Driver</td><td>Fine Science Tools</td><td>FST 12002-12</td><td></td></tr><tr><td>PE-10 Tubing</td><td>Braintree Scienctific, Inc.</td><td>PE10 50 FT</td><td></td></tr><tr><td>Forbici</td><td>Strumenti per le scienze fini</td><td>FST 14184-09</td><td></td></tr><tr><td>SMZ-1B Stereomicroscopio</td><td>Nikon</td><td>SMZ1-PS</td><td></td></tr><tr><td>Ventilatore per piccoli animali VentElite</td><td>Apparecchio Harvard</td><td>55-7040</td><td></td></tr><tr><td>Vetergesic (10 mL, 0,3 mg/mL buprenorfina))</td><td>CDMV Inc</td><td>124918</td><td>farmaco controllato</td></tr><tr><td>Vevo 2100 Software</td><td>Fujifilm-Visual Sonics</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un modello di roditore ischemico del pericardio intatto

An Intact Pericardium Ischemic Rodent Model

Questo protocollo ha dimostrato che il pericardio e il suo contenuto svolgono un ruolo antifibrotico essenziale nel modello ischemico di roditore (legatura coronarica per indurre lesioni miocardiche). La maggior parte dei modelli preclinici di infarto miocardico richiedono l'interruzione dell'integrità pericardica con perdita dell'ambiente cellulare omeostatico. Tuttavia, recentemente abbiamo sviluppato una metodologia per indurre l'infarto miocardico, che riduce al minimo il danno pericardico e mantiene la popolazione di cellule immunitarie residenti nel cuore. È stato osservato un miglioramento del recupero funzionale cardiaco nei topi con uno spazio pericardico intatto dopo la legatura coronarica. Questo metodo offre l'opportunità di studiare le risposte infiammatorie nello spazio pericardico dopo infarto miocardico. L'ulteriore sviluppo delle tecniche di etichettatura può essere combinato con questo modello per comprendere il destino e la funzione delle cellule immunitarie pericardiche nella regolazione dei meccanismi infiammatori che guidano il rimodellamento nel cuore, compresa la fibrosi.

Questo modello di legatura coronarica modificato è stato ottimizzato per ottenere la riproducibilità e la sopravvivenza degli animali. Tuttavia, a causa della significativa lesione indotta nel cuore, alcune attese mortalità intraoperatoria e post-operatoria sono associate alla procedura. La mortalità standard è tipicamente più alta nei maschi (~25-35%) rispetto alle femmine (~ 10-15%).
L'induzione riuscita di un infarto miocardico con la legatura coronarica modificata dovrebbe essere evidente ...

Questo protocollo delinea i passaggi per indurre l'infarto miocardico nei topi preservando il pericardio e il suo contenuto.

Un modello di roditore ischemico del pericardio intatto

This protocol has shown that the pericardium and its contents play an essential anti-fibrotic role in the ischemic rodent model (coronary ligation to ...

Questo metodo ci permetterà di valutare il ruolo della cavità pericardica che circonda il cuore e il suo contenuto nella riparazione cardiaca dopo infarto miocardico. Rispetto ai metodi convenzionali di legatura coronarica per la modellazione dell'infarto miocardico, il nostro metodo mantiene intatta la cavità pericardica, consentendo la determinazione del contenuto e tiene traccia dei loro ruoli a seguito di lesioni ischemiche cardiache. Comprendere il contributo della cavità pericardica e la risposta alle lesioni cardiache fornirà importanti informazioni sulle strategie terapeutiche che mirano al pericardio per migliorare la guarigione del cuore.Per iniziare con post anestesia, trattenere le zampe del topo e posizionarlo sul tavolo chirurgico. Dopo aver preparato il topo per l'intervento chirurgico come descritto nel manoscritto, ventilare il topo con il 2% di isoflurano e il 100% di ossigeno come gas di trasporto utilizzando un ventilatore commerciale. Quindi impostare una velocità di 110 respiri al minuto, un volume corrente di 250 microlitri e una pressione espiratoria positiva di quattro millimetri di mercurio.Ruotare il mouse del 30% sul lato destro per posizionare il lato sinistro del torace per la chirurgia. Quindi fare un'incisione laterale di due o tre centimetri nella pelle del torace per visualizzare i muscoli pettorali sul lato sinistro. Fai un'incisione di un centimetro dalla linea mediana verso l'esterno per tagliare le pettorali maggiori e minori.Evitare un eccessivo sanguinamento durante la cauterizzazione dei vasi sanguinanti. Visualizza i muscoli intercostali tra la terza e la quarta costola. Fare un'incisione di due centimetri nel muscolo intercostale sinistro per introdurre aria nella cavità toracica e consentire al cuore e ai polmoni di allontanarsi dall'incisione.Per incidere l'intercostale senza sanguinamento, fermare temporaneamente il ventilatore ed espandere l'apertura utilizzando un dispositivo di cauterizzazione. Usando i divaricatori, ritrarre le costole per esporre il cuore. Quindi osservare il pericardio e il cuore sottostante sotto uno stereomicroscopio.Posizionare delicatamente la pinza sulla superficie del pericardio per ridurre il pericardio e il movimento cardiaco sottostante. Punto di riferimento visivo dell'arteria coronaria LAD tracciando la sua comparsa sotto l'appendice sinistra. Utilizzando il driver a microago, guidare una sutura appropriata attraverso il pericardio sotto il LAD.Osservare la sutura che emerge dall'altra parte del LAD e del pericardio. Rappresentando il modello di legatura permanente, legare la sutura per limitare il flusso sanguigno attraverso l'arteria coronaria, rendendo visibile lo sbiancamento della porzione anteriore del ventricolo sinistro. Quindi tagliare la sutura in eccesso con l'aiuto delle forbici.Fornire iniezioni di mantenimento di analgesico per via sottocutanea ogni 12 ore per 72 ore dopo l'intervento chirurgico. Dopo aver ridotto l'isoflurano all'1%, spegnere l'isoflurano mantenendo la ventilazione con ossigeno. Una volta che l'animale mostra segni di respirazione, rimuovere il tubo tracheale calibro 23 dalla bocca e posizionare il topo in una gabbia di recupero per monitorare la ripresa della respirazione.Consentire al mouse di recuperare nella gabbia con una parte della gabbia posizionata su un pad riscaldante per fornire una fonte di calore esterna. Monitorare lo stato di salute del topo ogni giorno per sette giorni valutando le incisioni e il disagio dell'animale. Se necessario, somministrare antibiotici per un recupero di successo dopo l'intervento chirurgico invasivo.Dopo aver mantenuto il topo in anestesia generale con ossigeno, posizionare il topo in posizione supina su una piattaforma riscaldata e attaccare le zampe agli elettrocateteri ECG. Quindi sfregare il petto. Acquisire immagini ECG utilizzando la sonda del trasduttore e il gel di contatto e analizzarle con il software appropriato.Dopo la valutazione ECG non invasiva, spegnere l'isoflurano e riportare il topo nella gabbia. Fissare il cuore in formalina al 10% per almeno 24 ore. Tagliare il campione usando una lama di rasoio dritta attraverso il ventricolo destro, il setto interventricolare e il ventricolo sinistro, assicurandosi che l'incisione attraversi il centro della zona dell'infarto.E poi la paraffina incorpora i campioni di tessuto. Le sezioni tagliate vengono quindi posizionate in una cassetta di montaggio per un'ulteriore incorporazione della paraffina e il successivo sezionamento in sezioni spesse cinque micrometri. Dopo il posizionamento di sezioni di tessuto su vetrini, deparaffinizzare utilizzando toluene e lavaggi con alcool graduato con acqua deionizzata.Quindi reidratare. Quindi, colorare la sezione con 0,1% di rosso sirio nell'acido picrico per due ore a temperatura ambiente. Lavare la sezione con acido acetico allo 0,5% per tre minuti, quindi risciacquare con etanolo al 70% per un minuto.Disidratare la sezione utilizzando l'ordine inverso dei lavaggi con concentrazioni di etanolo crescenti e graduate prima del montaggio per la valutazione microscopica. L'induzione di infarto miocardico di successo con la legatura coronarica modificata è stata valutata esaminando i parametri funzionali e le caratteristiche strutturali del cuore. Per la funzione, la diminuzione della frazione di eiezione del ventricolo sinistro è stata valutata mediante ecocardiografia entro tre o quattro settimane dall'infarto post-miocardico.La colorazione istologica ha dimostrato che i cambiamenti funzionali erano accompagnati da una significativa fibrosi della parete del ventricolo sinistro, che sono stati ulteriormente confermati dalla quantificazione della fibrosi colorata di rosso picrosirio nelle sezioni trasversali del cuore a quattro settimane dopo l'infarto con i modelli di legatura coronarica pericardica interrotta o intatta. La combinazione del metodo di etichettatura a sfere fluorescenti con l'analisi della citometria a flusso ha fornito un approccio per tracciare i macrofagi pericardici Gata6 positivi residenti. È importante sottolineare che è stata rilevata poca o nessuna etichettatura nel cuore o nel sangue.Dopo l'infarto miocardico, il trasferimento delle cellule può essere monitorato mediante citometria a flusso e imaging. Viene mostrata la quantificazione delle cellule mieloidi pericardiche marcate con o senza perline fluorescenti con o senza infarto miocardico. È necessario prestare attenzione per evitare di interrompere o strappare inavvertitamente il pericardio sottile durante la procedura.Questo metodo può essere combinato con il tracciamento del lignaggio del blocco cellulare o effettore, che consentirà di tracciare e determinare l'impatto della componente pericardica sulla risposta di guarigione nel cuore infartuato. Abbiamo identificato la cavità pericardica che protegge il cuore dopo l'infortunio, che è in parte mediato dai macrofagi pericardici residenti. Questo approccio apre una nuova area di ricerca per le malattie cardiovascolari.

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Un modello di roditore ischemico del pericardio intatto

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