Name: Produzione di vettori virali adeno-associati in pile cellulari per studi preclinici in modelli animali di grandi dimensioni (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Scopri la produzione di vettori virali AAV ad alta resa e purezza utilizzando cellule HEK293 aderenti. Questo metodo efficiente supporta studi preclinici in modelli animali di grandi dimensioni per la terapia genica.

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Amira D. Rghei, Brenna A. Y. Stevens, Sylvia P. Thomas e Jacob G. E. Yates hanno ricevuto stipendi per studenti dell'Ontario Veterinary College e borse di studio per laureati dell'Ontario. Amira D. Rghei è stata la destinataria di un Mitacs Accelerate Studentship. Questo lavoro è stato finanziato dal Canadian Institutes for Health Research (CIHR) Project Grant (# 66009) e da una sovvenzione Collaborative Health Research Projects (NSERC partnered) (# 433339) a SKW.

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<li>Ylä-Herttuala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endgame%3A+glybera+finally+recommended+for+approval+as+the+first+gene+therapy+drug+in+the+European+union%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%3A+The+Journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Endgame: glybera finally recommended for approval as the first gene therapy drug in the European union.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 20 (10), 1831-1832 (2012).</li>
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<li>Cathomen, T., Stracker, T. H., Gilbert, L. B., Weitzman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+identifies+a+cellular+regulator+of+adeno-associated+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A genetic screen identifies a cellular regulator of adeno-associated virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 14991-14996 (2001).</li>
<li>McCarty, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-complementary+AAV+vectors%3B+advances+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Self-complementary AAV vectors; advances and applications.</a> Molecular Therapy. 16 (10), 1648-1656 (2008).</li>
<li>Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+transduction+efficiency%2C+tropism+and+axonal+transport+of+aav+serotypes+1%2C+2%2C+5%2C+6%2C+8+and+9+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of aav serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain.</a> PLOS One. 8 (9), 76310(2013).</li>
<li>Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+AAV+serotypes+1-9+mediated+gene+expression+and+tropism+in+mice+after+systemic+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection.</a> Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).</li>
<li>Pillay, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+%28AAV%29+serotypes+have+distinctive+interactions+with+domains+of+the+cellular+AAV+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus (AAV) serotypes have distinctive interactions with domains of the cellular AAV receptor.</a> Journal of Virology. 91 (18), (2017).</li>
<li>Merkel, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking+of+adeno-associated+virus+vectors+across+a+model+of+the+blood-brain+barrier%3B+a+comparative+study+of+transcytosis+and+transduction+using+primary+human+brain+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Trafficking of adeno-associated virus vectors across a model of the blood-brain barrier; a comparative study of transcytosis and transduction using primary human brain endothelial cells.</a> Journal of Neurochemistry. 140 (2), 216-230 (2017).</li>
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<li>Burnham, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+ultracentrifugation+as+an+approach+to+characterize+recombinant+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy+Methods%22%5BJournal%5D)">Analytical ultracentrifugation as an approach to characterize recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Human Gene Therapy Methods. 26 (6), 228-242 (2015).</li>
<li>Dobnik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+quantification+and+characterization+of+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1570(2019).</li>
<li>Backovic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capsid+protein+expression+and+adeno-associated+virus+like+particles+assembly+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Capsid protein expression and adeno-associated virus like particles assembly in Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbial Cell Factories. 11, 124(2012).</li>
</ol>

Sarah K. Wootton è un inventore di un brevetto statunitense US10806802B2 per il capside AAV6.2FF.

La produzione di vettori AAV ricombinanti (rAAV) descritti in questo documento utilizza materiali, reagenti e attrezzature comuni presenti nella maggior parte dei laboratori e delle strutture di ricerca di biologia molecolare. Questo documento consente al lettore di produrre rAAV di alta qualità in vitro e in vivo. Soprattutto, questo protocollo per la produzione di rAAV, rispetto ai protocolli più noiosi che coinvolgono la purificazione del cloruro di cesio, è efficiente ed evita l'uso dell'ultracentri...

La terapia genica che utilizza vettori di virus adeno-associati (AAV) ha fatto passi da gigante negli ultimi tre decenni1,2. I miglioramenti dimostrati in una vasta gamma di malattie genetiche, tra cui cecità congenita, emofilia e malattie del sistema muscolo-scheletrico e del sistema nervoso centrale, hanno portato la terapia genica AAV in prima linea nella ricerca clinica3,4. Nel 2012, l'Agenzia europea per i medicinali (EMA) ha approvato Glybera, un vettore AAV1 che esprime lipoproteina lipasi (LPL) per il trattamento del deficit di LPL, rendendolo la prima autorizzazione all'immissione in commercio per un trattamento di terapia genica in Europa o negli Stati Uniti5. Da allora, due ulteriori terapie geniche AAV, Luxturna6 e Zolgensma7,hanno ricevuto l'approvazione della FDA e il mercato dovrebbe espandersi rapidamente nei prossimi 5 anni con ben 10-20 terapie geniche previste entro il 20258. I dati clinici disponibili indicano che la terapia genica AAV è una modalità sicura, ben tollerata ed efficace che la rende uno dei vettori virali più promettenti, con oltre 244 studi clinici che coinvolgono AAV registrati con ClinicalTrials.gov. Il crescente interesse per le applicazioni cliniche che coinvolgono vettori AAV richiede metodi di produzione robusti e scalabili per facilitare la valutazione delle terapie AAV in modelli animali di grandi dimensioni, in quanto questo è un passo critico nella pipeline traslazionale9.
Per la produzione di vettori AAV, i due requisiti principali sono il genoma AAV e il capside. Il genoma di wild-type (wt)-AAV è DNA a singolo filamento che è di circa 4,7 kb di lunghezza10. Il genoma wt-AAV comprende ripetizioni terminali invertite (ITR) che si trovano ad entrambe le estremità del genoma, che sono importanti per il packaging, e i geni rep e cap 11. I geni rep e cap, necessari per la replicazione del genoma, l'assemblaggio del capside virale e l'incapsulamento del genoma nel capside virale, vengono rimossi dal genoma virale e forniti in trans per la produzione di vettori AAV12. La rimozione di questi geni dal genoma virale fornisce spazio per i transgeni terapeutici e tutti gli elementi regolatori necessari, tra cui il promotore e il segnale polyA. Gli ITR rimangono nel genoma vettoriale per garantire una corretta replicazione del genoma e l'incapsulamento virale13,14. Per migliorare la cinetica dell'espressione transgenica, i genomi vettoriali AAV possono essere progettati per essere auto-complementari, il che mitiga la necessità di conversione dalla conversione del DNA a singolo filamento a quella a doppio filamento durante la replicazione del genoma AAV, ma riduce la capacità di codifica a ~ 2,4 kb15.
Oltre alla progettazione del genoma AAV, la selezione del sierotipo del capside determina il tropismo tissutale e cellulare del vettore AAV in vivo2. Oltre al tropismo tissutale, diversi sierotipi AAV hanno dimostrato di mostrare diverse cinetiche di espressionegenica 16. Ad esempio, Zincarelli et al.17 hanno classificato diversi sierotipi AAV in sierotipi a bassa espressione (AAV2, 3, 4, 5), sierotipi a espressione moderata (AAV1, 6, 8) e sierotipi ad alta espressione (AAV7 e 9). Hanno anche classificato i sierotipi AAV in espressione ad esordio lento (AAV2, 3, 4, 5) o espressione ad esordio rapido (AAV1, 6, 7, 8 e 9). Questi tropismi divergenti e la cinetica di espressione genica sono dovuti a variazioni aminoacidiche nelle proteine del capside, formazioni di proteine del capside e interazioni con i recettori / co-recettori delle cellule ospiti18. Alcuni capsidi AAV hanno caratteristiche benefiche aggiuntive come la capacità di attraversare la barriera emato-encefalica dopo somministrazione intravascolare (AAV9) o risiedere in cellule muscolari longeve per un'espressione transgenica duratura (AAV6, 6.2FF, 8 e 9)19,20.
Questo documento mira a dettagliare un metodo economico per la produzione di vettori AAV ad alta purezza, ad alto titolo e di grado di ricerca da utilizzare in modelli preclinici di animali di grandi dimensioni. La produzione di AAV utilizzando questo protocollo è ottenuta utilizzando la trasfezione a doppio plasmide in cellule aderenti del rene embrionale umano (HEK) 293 coltivate in pile cellulari. Inoltre, lo studio descrive un protocollo per la purificazione della cromatografia dell'affinità dell'eparina solfato, che può essere utilizzato per i sierotipi AAV che contengono domini leganti l'eparina, tra cui AAV2, 3, 6, 6.2FF, 13 e DJ21,22.
Sono disponibili numerosi sistemi di imballaggio per la produzione di vettori AAV. Tra questi, l'uso di un sistema di co-trasfezione a due plasmidi, in cui i geni Rep e Cap e i geni Ad helper (E1A, E1B55K, E2A, E4orf6 e VA RNA) sono contenuti all'interno di un plasmide (pHelper), presenta alcuni vantaggi pratici rispetto al comune metodo di trasfezione a tre plasmidi (triplo), tra cui costi ridotti per la produzione di plasmidi23,24 . Il plasmide del genoma AAV contenente la cassetta di espressione transgenica (pTransgene), deve essere affiancato da ITR e non deve superare ~ 4,7 kb di lunghezza. Il titolo e la purezza del vettore possono essere influenzati dal transgene a causa dei potenziali effetti citotossici durante la trasfezione. La valutazione della purezza del vettore è descritta nel presente documento. I vettori prodotti con questo metodo, che producono un 1 x 1013 vg / mL per ciascuno, sono stati valutati in topi, criceti e modelli animali ovini.
Tabella 1: Composizione delle soluzioni richieste. Informazioni necessarie, incluse percentuali e volumi, dei componenti necessari per varie soluzioni in tutto il protocollo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62727/Table%201-%2062727_R2.xlsx" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questa tabella.</a>

<table><tbody><tr><td>0,22 &mu; m filtro</td><td>Millipore Sigma</td><td>S2GPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Tripsina</td><td>Fisher Scientific</td><td>SM2001C</td><td></td></tr><tr><td>1-Butanolo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A399-4</td><td>ATTENZIONE. Utilizzare sotto una cappa a flusso laminare. Indossare guanti</td></tr><tr><td>Cellstack a 10 camere</td><td>Corning</td><td>3271</td><td></td></tr><tr><td>Flacone PETG da 1 litro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2019-1000</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di acrilammide/Bis al 30%</td><td>Bio-Rad</td><td>1610158</td><td></td></tr><tr><td>Piastra con gonna a 96 pozzetti</td><td>FroggaBio</td><td>FS-96</td><td></td></tr><tr><td>Guarnizioni per piastre adesive</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-408-240</td><td></td></tr><tr><td>Persolfato di ammonio (APS)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0700</td><td>ATTENZIONE. Utilizzare sotto una cappa a flusso laminare. Indossare guanti</td></tr><tr><td>Kit per la pulizia del sangue e dei tessuti</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td>Utilizzare per la pulizia del DNA nella sezione 4.6 del protocollo</td></tr><tr><td>Blu di bromofenolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>B392-5</td><td>ATTENZIONE. Utilizzare sotto una cappa a flusso laminare. Indossare i guanti</td></tr><tr><td>Piastre per colture cellulari</td><td>Greiner bio-one</td><td>7000232</td><td>piastre da 15 cm</td></tr><tr><td>Provetta conica per coltura</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339650</td><td>Provetta conica da 15 mL</td></tr><tr><td>Provetta conica per coltura</td><td>Fisher Scientific</td><td>14955240</td><td>Provetta conica da 50 mL</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) con 1000 mg/L di D-glucosio, L-glutammina</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>ECL Western Blotting Substrato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>32209</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Greenfield</td><td>P016EA95</td><td>Diluire l'alcol etilico (95% vol) al 20% per la sezione 3.7.4 e al 70% per la sezione 6.1.1.1</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico glaciale</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38-500</td><td>CAUTELA. Utilizzare sotto una cappa a flusso laminare. Indossare i guanti</td></tr>: <tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr>, <tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-500</td><td></td></tr><tr><td>HBSS con Mg2+ e Ca2+</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH302268.02</td><td></td></tr><tr><td>HBSS senza Mg2+ e Ca2+</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30588.02</td><td></td></tr><tr><td>Cellule HEK293</td><td>Collezione americana di colture tissutali</td><td>CRL-1573</td><td>Al ricevimento, scongelare le cellule e la coltura come descritto nel . Una volta che le cellule sono state minimamente passate e stanno crescendo bene, congelare una sottofrazione per il futuro in aliquote e immagazzinarle in azoto liquido. Utilizzare sempre le celle al di sotto del passaggio numero 30. Una volta che le cellule coltivate sono state passate più di 30 volte, si consiglia di riavviare una coltura dalle aliquote conservate</td></tr><tr><td>HEK293 kit ELISA per la proteina della cellula ospite</td><td>Cygnus</td><td>Technologies F650S</td><td>Segui il produttore s istruzioni</td></tr><tr><td>Colonna di solfato di eparina</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>17040703</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>KC34120</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; L-glutammina (200 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30034.02</td><td></td></tr><tr><td>Cuscino di supporto per provette da centrifuga di grande volume</td><td>Corning</td><td>CLS431124</td><td>Il cuscino di supporto deve essere utilizzato con provette da centrifuga di grande volume a meno che il rotore della centrifuga non abbia i cuscini con fondo a V appropriati Provette</td></tr> da <tr><td>centrifuga di grande volume</td><td>Corning</td><td>CLS431123-6EA</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>MgCl2&nbsp; </td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>Provetta per microcentrifuga</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td>Provetta per microcentrifuga da 1,5 mL, sterilizzare prima dell'uso</td></tr><tr><td>Acqua di grado molecolare</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>SH30538.03</td><td></td></tr><tr><td>N-Lauroilsarcosina sale sodico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5125</td><td>ATTENZIONE. Indossare guanti</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Thermo Fisher Scientific BP35810</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optimem, siero ridotto medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20D</td><td>Sterilizzare prima dell'uso</td></tr><tr><td>PBS (10x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>70011044</td><td>Diluire a 1x per l'uso su cellule</td></tr><tr><td>Soluzione di penicillina-streptomicina</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>plasmide pHelper</td><td>Design de novo o ottenuto dal deposito di plasmidi</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Bacino di pipette</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-681-502</td><td>Acquisto di bacinelle per pipette sterili</td></tr><tr><td>Etere di polietilenglicole terz-ottilfenile (Triton X-100)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>9002-93-1</td><td>ATTENZIONE. Indossare guanti</td></tr><tr><td>Polietilenimmina (PEI)</td><td>Polyscience</td><td>24765-1</td><td>Seguire il produttore' per produrre una soluzione da 1 litro. 0,22&mu; m filtrare e conservare a 4 gradi C</td></tr><tr><td>Piastra PCR semi-gonna in polipropilene</td><td>FroggaBio</td><td>WS-96</td><td></td></tr><tr><td>Polisorbato 20 (Tween 20)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td>ATTENZIONE. Indossare guanti</td></tr>, <tr><td>membrana in polivinilidene difluoruro (PVDF),</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>10600023</td><td>Utilizzare una pinza per manipolare. Indossare i guanti.</td></tr><tr><td>Anticorpo primario</td><td>Progen</td><td>65158</td><td></td></tr><tr><td>Scala proteica</td><td>FroggaBio</td><td>PM008-0500</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2546</td><td></td></tr><tr><td>plasmide pTrangene</td><td>Design de novo o ottenuto da un deposito di plasmidi</td><td>NA</td><td>Deve contenere SV40 polyA nel genoma per essere compatibile con la titolazione AAV nella sezione 5.0</td></tr><tr><td>Tubo della pompa</td><td>Cole-Parmer</td><td>RK-96440-14</td><td>Ottimizza la lunghezza del tubo e il contenimento del virus nelle frazioni E1-E5</td></tr><tr><td>RQ1 Dnase 10 Tampone di reazione</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td>Uso a concentrazione 10x nel protocollo dalla sezione 4.0</td></tr><tr><td>RQ1 Dnase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td></td>Senza RNASI</tr><tr><td>Campione diluente</td><td>Cygnus Technologies</td><td>I700</td><td>Deve essere acquistato separatamente per l'uso con il kit</td></tr> <tr><td>ELISA per la proteina della cellula ospite HEK293Anticorpo secondario, HRP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>G-21040</td><td></td></tr><tr><td>Latte scremato in polvere</td><td>Ossoide</td><td>LP0033B</td><td></td></tr><tr><td>Sodio dodecil solfato (SDS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28312</td><td>ATTENZIONE. Utilizzare sotto una cappa a flusso laminare. Indossare guanti</td></tr><tr><td>Idrossido di sodio (NaOH)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SS266-4</td><td></td></tr><tr><td>SV40 polyA primer probe</td><td>IDT</td><td></td><td>Utilizzare la sequenza nella Tabella X per la citazione da IDT per la sintesi</td></tr><tr><td>Tetrametiletilendiammina (TEMED)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15524010</td><td>ATTENZIONE. Utilizzare sotto una cappa a flusso laminare. Indossare i guanti</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Bio-Rad</td><td>1450021</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Filter</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC810024</td><td>Ultra-4 Centrifugal 10K deve essere utilizzato, in quanto ha un cutoff di 10000 peso molecolare</td></tr><tr><td>Nucleasi universale per la lisi cellulare</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88702</td><td></td></tr><tr><td>Universal qPCR master mix</td><td>NEB</td><td>M3003L</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Paper</td><td>Millipore Sigma</td><td>WHA1001325</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>21985023</td><td>ATTENZIONE. Utilizzare sotto una cappa a flusso laminare. Indossare i guanti</td></tr><tr><td>ATTENZIONE:&nbsp; Fare riferimento alla Tabella dei materiali per le linee guida sull'uso di sostanze chimiche pericolose.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

produzione di vettori virali adeno-associati in pile cellulari per studi preclinici in modelli animali di grandi dimensioni

Production of Adeno-Associated Virus Vectors in Cell Stacks for Preclinical Studies in Large Animal Models

I vettori del virus adeno-associato (AAV) sono tra i vettori di terapia genica clinicamente più avanzati, con tre terapie geniche AAV approvate per l'uomo. Il progresso clinico di nuove applicazioni per AAV comporta la transizione da piccoli modelli animali, come topi, a modelli animali più grandi, tra cui cani, pecore e primati non umani. Uno dei limiti della somministrazione di AAV ad animali più grandi è il requisito di grandi quantità di virus ad alto titolo. Mentre la coltura cellulare in sospensione è un metodo scalabile per la produzione di vettori AAV, pochi laboratori di ricerca hanno l'attrezzatura (ad esempio, bioreattori) o sanno come produrre AAV in questo modo. Inoltre, i titoli AAV sono spesso significativamente più bassi se prodotti in sospensione hek 293 celle rispetto alle celle HEK293 aderenti. Qui è descritto un metodo per produrre grandi quantità di AAV ad alto titolo utilizzando pile di celle. Vengono inoltre descritti un protocollo dettagliato per il titolo AAV e metodi per convalidare la purezza del vettore. Infine, vengono presentati i risultati rappresentativi dell'espressione transgenica mediata da AAV in un modello di pecora. Questo protocollo ottimizzato per la produzione su larga scala di vettori AAV in cellule aderenti consentirà ai laboratori di biologia molecolare di far progredire la sperimentazione delle loro nuove terapie AAV in modelli animali più grandi.

La traduzione da modelli di piccoli roditori a modelli animali più grandi e l'eventuale applicazione clinica rappresentano una sfida significativa a causa della grande quantità di AAV necessaria per trasdurre animali più grandi e ottenere effetti terapeutici. Per confrontare l'efficienza di trasduzione del capside AAV6.2FF progettato razionalmente, precedentemente dimostrato un aumento di 101 volte dell'efficienza di trasduzione nelle cellule muscolari murine rispetto ad AAV63,topi, criceti e agne...

Qui forniamo una procedura dettagliata per la produzione su larga scala di vettori AAV di grado di ricerca utilizzando cellule HEK 293 aderenti coltivate in pile cellulari e purificazione cromatografica di affinità. Questo protocollo produce costantemente >1 x 1013 genomi vettoriali / mL, fornendo quantità vettoriali appropriate per studi su animali di grandi dimensioni.

Produzione di vettori virali adeno-associati in pile cellulari per studi preclinici in modelli animali di grandi dimensioni

Adeno-associated virus (AAV) vectors are among the most clinically advanced gene therapy vectors, with three AAV gene therapies approved for humans. ...

Questo protocollo per la produzione di vettori virali AAV è conveniente e produce AAV di elevata purezza, alto titolo, grado di ricerca per l'uso in modelli preclinici di grandi animali. Questa tecnica utilizza cellule HEK293 aderenti nelle camere di coltura cellulare, che è efficiente in termini di tempo e meno pratica, consentendo meno interruzioni alle cellule. Questo protocollo può essere di grande aiuto nella produzione di vettori virali per il campo della terapia genica e può anche essere utilizzato per la produzione di altri sierotipi AAV che legano anche il solfato di eparan.Per iniziare, raccogliere le cellule HEK293 dalla coltura quando raggiunge l'80% di confluenza. Aspirare il fluido prima di lavare delicatamente la piastra di coltura cellulare con tre millilitri di PBS. Quindi aspirare PBS e aggiungere tre millilitri di tripsina.Incubare le piastre per due minuti a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, neutralizzare la tripsina, aggiungendo sette millilitri di DMEM completo alla piastra, e raccogliere il surnatante in tubi conici da 50 millilitri. Invertire delicatamente i tubi per garantire che le cellule siano omogenee.Per determinare la densità cellulare, mescolare 10 microlitri dei campioni cellulari con 10 microlitri di tripano blu. E aggiungi la miscela a un vetrino di conteggio delle celle da analizzare nel contatore delle celle. Mescolare la sospensione cellulare con un litro di DMEM completo preriscaldato per vedere la camera di coltura.Ruotare delicatamente la camera per distribuire le cellule in modo uniforme. Incubare la camera a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Oltre alla camera di coltura cellulare, le cellule di coltura da 10 a quarte cellule per centimetro quadrato in una piastra di 15 centimetri come riferimento per la confluenza.Dopo 65 ore di incubazione, quando le cellule sono confluenti all'80-90%, aggiungere lentamente la miscela polietileneimina-DNA e DMEM nella porta della camera di coltura cellulare. Distribuire il liquido uniformemente su tutte le file prima di incubare a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 72 ore. Dopo l'incubazione, agitare vigorosamente la camera di coltura cellulare per rimuovere le cellule fino a quando il mezzo appare torbido e versarlo in quattro o 500 tubi di centrifuga da 500 millilitri.Pellet le celle per centrifugazione a 18.000 volte G per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Versare il surnatante chiarificato in una bottiglia di PETG da un litro e risospescere i pellet di cella in 50 millilitri di tampone autorizzato in tubi di centrifuga da 500 millilitri. Incubare i tubi per 60 minuti a 37 gradi Celsius.Dopo l'incubazione, centrifugare i tubi a 18.000 volte G per 30 minuti e trasferire il surnatante nella stessa bottiglia di PETG da un litro. Conservare a meno 80 gradi Celsius. Scongelare il lisato grezzo a quattro gradi Celsius durante la notte.Una volta scongelato, filtrarlo utilizzando un filtro da 0,22 micron. Immediatamente prima delle fasi di purificazione, passivare il concentratore centrifugo aggiungendo quattro millilitri di tampone di pretrattamento del filtro per ogni colonna di eparina-sefarosio utilizzata. Posizionare il tubo in una pompa peristaltica.Eseguire in sequenza le soluzioni e i supporti. Prepararsi per la cromatografia attaccando una colonna di eparina-sefarosio da cinque millilitri al tubo e facendo scorrere 25 millilitri di Bazell DMEM attraverso la colonna. Quindi caricare 0,2 micromolari del lisato grezzo filtrato sulla colonna ad una portata di una o due gocce al secondo.Lavare la colonna in sequenza per eluire cinque millilitri cinque volte con 300 millimolari di cloruro di sodio HBSS, con magnesio e calcio, ed etichettare le cinque eluizioni come da E1 a E5. Quando è pronto, ruotare il concentratore centrifugo contenente il tampone di pretrattamento a 900 volte G per due minuti. Scartare il flusso attraverso. Lavare il filtro concentratore centrifugo con quattro millilitri di HBSS con magnesio e calcio ruotando a 1000 volte G per due minuti.Quindi aggiungere l'eluizione E2 al concentratore centrifugo e ruotare a 1000 volte G per cinque minuti. Scartare il flusso attraverso. Allo stesso modo ruotare l'eluizione E3 nel concentratore centrifugo fino a quando il virus concentrato è di circa un millilitro.Rimuovere il virus concentrato dal concentratore centrifugo utilizzando una punta filtrata P200 e raccoglierlo in un tubo centrifugo sterile da 1,5 millilitri. Dopo la raccolta del virus, sciacquare il concentratore centrifugo con 200 microlitri di HBSS con magnesio e calcio. Pipettare su e giù vigorosamente per 30 secondi per rimuovere qualsiasi virus aderente alla membrana e raccogliere il virus concentrato nello stesso tubo di centrifuga da 1,5 millilitri.Mescolare bene il tubo. Lavare la colonna e saturare con etanolo al 20% prima di conservarla a quattro gradi Celsius. Conservare il tubo della pompa in un idrossido di sodio molare.L'efficienza di trasduzione del capside AAV6.2FF è stata confrontata in topi, criceti e agnelli per 28 giorni dopo la somministrazione intramuscolare. I topi hanno somministrato cinque volte 10 al 12 ° genoma vettoriale per chilogrammo di IgG umane AAV6.2FF, espresso tra 171 e 237 microgrammi per millilitro di IgG umane nel siero. Il criceto viene somministrato a due volte 10 al 13 ° genoma vettoriale per chilogrammo di IgG umane AAV6.2FF, espresso livelli molto più elevati di IgG umane rispetto ai topi.Mentre il modello animale di grandi dimensioni è stato in grado di esprimere una media di 35 microgrammi per millilitro di livelli di IgG umane nel plasma. Grandi modelli animali possono determinare l'espressione del transgene AAV in vivo e determinare se i transgeni hanno un effetto terapeutico contro il disturbo o la malattia di interesse. Lo studio ha mostrato la grande capacità di trasduzione di AAV6.2FF, un nuovo vettore sierotipo AAV 6 nel muscolo scheletrico, nonché la bassa immunogenicità dei vettori virali AAV in vivo.

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Ricombinante adeno-associato virus (rAAVs) vettori stanno diventando sempre più prezioso...

Produzione e titolazione di vettori virali ricombinanti adeno-associato

Dimostriamo la tecnica di base per progettare molecolare ed evolvere sintetici virale adeno-associati (AAV) vettori di terapia genica attraverso la famiglia shuffling DNA. Inoltre, fornire linee guida generali ed esempi rappresentativi per la selezione e l'analisi delle singole capsidi chimerici con proprietà migliorate sulle cellule bersaglio in coltura o nei topi.

Ingegneria ed evoluzione del sintetico virus adeno-associato (AAV) Vettori Terapia genica attraverso la famiglia Shuffling DNA

Source: Ehrke-Schulz, E., et al. Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the large-scale amplification of high-capacity adenoviral vectors in suspension-adapted human embryonic kidney cells expressing Cre recombinase for use in gene delivery applications requiring high-titer, helper-free vector preparations.

Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors 

Qui, descriviamo una strategia efficiente e riproducibile per produrre, titolo e batch di controllo di qualità di vettori di virus adeno-associato. Permette all'utente di ottenere una preparazione di vettore con alto-titolo (≥ 1 x 1013 vettoriale genomi/mL) e un'elevata purezza, pronta per l'uso in vitro o in vivo .

Produzione, purificazione e controllo di qualità per i vettori basati su Virus Adeno-associato

In questo protocollo, il vettore AAV2 è prodotto co-coltivando cellule di insetti Spodoptera frugiperda (Sf9) con baculovirus (BV)-AAV2-green fluorescent protein (GFP) o gene terapeutico e cellule Sf9 infette da BV-AAV2-rep-cap in coltura in sospensione. Le particelle AAV vengono rilasciate dalle cellule utilizzando detergente, chiarificate, purificate mediante cromatografia a colonna di affinità e concentrate mediante filtrazione a flusso tangenziale.

Sviluppo del processo per la produzione e la purificazione del vettore adeno-associato al virus (AAV)2 utilizzando il sistema di coltura cellulare baculovirus-insetto

In questo manoscritto, l'iniezione subcongiuntivale è dimostrata come un valido metodo di somministrazione vettoriale per i tessuti oculari nei topi utilizzando un sistema di iniezione costituito da una pompa a siringa per infusione/prelievo e una siringa rimovibile a tenuta di gas accoppiata con aghi di microiniezione. Questo sistema di iniezione è adattabile anche ad altre vie di somministrazione intraoculare.

Somministrazione subcongiuntivale di vettori virali adeno-associati in modelli di piccoli animali

Qui, viene presentato un protocollo di produzione AAV basato su celle HEK293 in sospensione, con conseguente riduzione del tempo e della manodopera necessari per la produzione di vettori utilizzando componenti disponibili per scopi di ricerca da fornitori commerciali.

Produzione di lotti vettoriali adeno-associati ad alto rendimento utilizzando celle di sospensione HEK293

Con la continua evoluzione del campo della terapia genica, c'è una crescente necessità di metodi innovativi in grado di affrontare queste sfide. Qui viene presentato un metodo unico, che semplifica il processo di generazione di vettori AAV ad alto rendimento e ad alta purezza utilizzando una piattaforma di fabbrica cellulare, soddisfacendo gli standard di qualità per gli studi in vivo .

Una procedura semplificata e standardizzata per la generazione di vettori virali adeno-associati ad alto titolo e di alta qualità utilizzando una piattaforma di fabbrica cellulare

Il tasso di turnover dei virus in sistemi marini e d'acqua dolce può essere stimato da una riduzione e tecnica ripetersi. I dati permettono ai ricercatori di dedurre i tassi di virus-mediata mortalità microbica nei sistemi acquatici.

Stimare i tassi di produzione del virus nei sistemi acquatici

Questo articolo descrive le diverse procedure di screening per i ratti e topi per rilevare endo o ectoparassiti. Diversi test diagnostici sarà dimostrato, sia quelli adatti per l'uso su animali vivi e di quelli utilizzati dopo l'eutanasia dell'animale. Fotografie per facilitare l'identificazione dei parassiti ratto e nel topo saranno inclusi.

La diagnosi di Ecto-e endoparassiti in ratti e topi di laboratorio

Scopri la produzione di vettori virali AAV ad alta resa e purezza utilizzando cellule HEK293 aderenti. Questo metodo efficiente supporta studi preclinici in modelli animali di grandi dimensioni per la terapia genica.

Produzione di vettori virali adeno-associati in pile cellulari per studi preclinici in modelli animali di grandi dimensioni

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