Studi di interazioni Chaperone-Cochaperone utilizzando il saggio omogeneo basato su perle
July 21st, 2021
Questo protocollo presenta una tecnica per sondare le interazioni proteina-proteina utilizzando perle donatrici legate al glutatione con co-chaperoni tPR fusi GST e perle accettori accoppiate con un peptide derivato da Hsp90. Abbiamo usato questa tecnica per lo screening di piccole molecole per interrompere le interazioni Hsp90-FKBP51 o Hsp90-FKBP52 e identificato inibitori di interazione Hsp90-FKBP51 potenti e selettivi.
Abbiamo costruito un test omogeneo basato su perle per studiare le interazioni chaperone-cochaperone. Usando questa tecnica, vastiamo a screening piccole molecole che inibiscono le interazioni tra Hsp90 e FKDP51 o FKBP52 e identifichiamo inibitori potenti e selettivi. Questa tecnica di screening ad alta produttività è robusta e affidabile.
I risultati possono essere ottenuti entro un'ora e richiede solo piccole quantità di proteine e composti di perle. L'interazione di Hsp90 con questi cochaperones è stata implicata in disturbi umani, come il morbo di Alzheimer, il cancro, la malattia autoimmune. Questa tecnica offre l'opportunità di schermare gli inibitori chaperone-cochaperone con elevata importanza medica.
Ecco il principio di base di questo test. Quando l'interazione tra il peptide Hsp90C-terminale e il dominio TPR dei cochaperones porta le perle del donatore e dell'accettore in prossimità, viene generato un segnale altamente amplificato. Quando vengono aggiunti gli inibitori dell'interazione, le perle del donatore e dell'accettore non possono raggiungere la prossimità e non viene prodotto alcun segnale rilevabile.
Iniziare diluendo il peptide Hsp90 in PBS a una concentrazione di milligrammo per millilitro. Diluire le perle accettori non coniugate in PBS e trasferire le perle in un tubo da 1,5 millilitro. Centrifugare le perle diluite per il lavaggio, quindi rimuovere con cura il surnatante.
Per coniugare, impostare le perle accettori in peptidi in un rapporto di 10 a 1. Alle perle paletidiche al peptide diluito PBS, alla soluzione di Tween 20 e sodio cyanaboroughhydride e incubare con agitazione end over end su uno shaker rotativo. Per bloccare i siti non reazionati, aggiungere 20 microlitri di una soluzione molare di Tris cloridrato di pH 8,0 alle perline e spegnere la reazione incubando per un'ora a 37 gradi Celsius.
Al termine dell'incubazione, lavare le perle mediante centrifugazione e sospendere di sospendere il pellet di perle in un millilitro di soluzione di tris cloridrato. Ripetere il lavaggio altre due volte. Dopo l'ultimo lavaggio, sospendere di sospendere le perle a una concentrazione di milligrammi per millilitro nel tampone di stoccaggio e conservare la soluzione di perle accettore coniugata a 4 gradi Celsius al riparo dalla luce.
Aggiungere pere donatrici di glutatione a 10 microgrammi per millilitro di concentrazione in PBS. Aggiungere GSTFKBP51 a una concentrazione finale di 10 microgrammi per millilitro e incubare la reazione per 10 minuti a 25 gradi Celsius al buio. Effettuare diluizioni seriali del composto di prova in DMSO.
Aggiungere 0,25 microlitri di diluizioni composte di prova e triplicare nell'angolo di ciascun pozzetti di una piastra da 384 pozzetti. Per il controllo negativo, aggiungere 0,25 microlitri di DMSO e per il controllo positivo, aggiungere 0,25 microlitri di peptide Hsp90 C-Terminal nei pozzetti. Aggiungere 22,5 microlitri della soluzione contenente pere donatrici di glutatione con proteine marcate GST a ciascun pozzo.
Agitare accuratamente il piatto con le mani e incubare al buio a 25 gradi Celsius per 15 minuti. Diluire le perle accettori con il peptide Hsp90C-terminale collegato a 100 microgrammi per millilitro di concentrazione in 0,5 volte PBS. Aggiungere 2,25 microlitri di perle accettori diluite a ciascun pozzo.
Agitare e incubare la piastra al buio per 15 minuti come dimostrato. Accendere lo strumento del lettore di lastre, misurare il segnale della piastra e analizzare i dati come descritto nel manoscritto di testo. Creare una tabella dati X-Y nella finestra di dialogo di benvenuto, selezionare Numeri X, Y e immettere tre valori di replica nelle colonne affiancate.
Importare i valori di concentrazione nella colonna X e i valori del segnale nella colonna Y. Fare clic su Analizza, selezionare Trasforma concentrazione X, quindi selezionare Trasforma in logaritmi. Fare clic su Analizza e scegliere regressione non lineare in Analisi X-Y.
Aprire l'opzione di inibizione della risposta alla dose e scegliere l'equazione della pendenza variabile log versus response. Fare clic su OK per visualizzare i risultati contenenti il valore IC50 e i grafici. Questo test è stato utilizzato per lo screening di piccole molecole, inibendo le interazioni tra Hsp90 e FKBP51 o FKBP52.
Il punteggio Z superiore a 0,8 e il rapporto segnale/background di 13,35 dimostrano la robustezza e l'affidabilità per uno screening ad alto throughput. È stato valutato l'effetto del composto di prova di piccolo peso molecolare D10 sull'inibizione delle interazioni chaperone-cochaperone e sono stati calcolati i valori IC50, dove D10 ha mostrato un'inibizione dose-dipendente. Il valore IC50 per le interazioni Hsp90 GSTFKBP51 era di 65 nanomolari.
Mentre per le interazioni Hsp90, GSTFKBP52, l'inibizione completa non è stata raggiunta con la più alta concentrazione di composti indica che è possibile ottenere l'inibizione selettiva dell'interazione proteina-proteina con piccole molecole. Il passo critico è l'ordine di aggiunta. Per prima cosa formiamo un complesso tra una piccola molecola e il suo bersaglio TPR.
Altrimenti sono necessarie un'incubazione più lunga e concentrazioni di composti più elevate. Possiamo usare questa tecnica per lo screening di piccole molecole che interrompono l'interazione tra Hsp90 e FKB51 o Hsp90 e FKB52. Può anche essere esteso a qualsiasi interazione tra Hsp90, Hsp70 e un motivo TPR contenente inibitori selettivi dello screening del cochaperone.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un saggio omogeneo basato su perline per studiare le interazioni chaperone-cochaperone, specificamente tra Hsp90 e FKBP51 o FKBP52. La tecnica permette lo screening ad alto rendimento di piccole molecole per identificare potenti inibitori di queste interazioni, che sono rilevanti per vari disturbi umani.
Componenti Principali dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienza
- Biochimica
- Farmacologia
Sfondo
- Hsp90 è una proteina chaperone coinvolta nel ripiegamento di altre proteine.
- FKBP51 e FKBP52 sono cochaperone che interagiscono con Hsp90.
- L'interruzione di queste interazioni può avere implicazioni terapeutiche.
- Queste interazioni sono implicate in malattie come l'Alzheimer, il cancro e i disturbi autoimmuni.
Scopo dello Studio
- Sviluppare un saggio affidabile per lo screening degli inibitori delle interazioni Hsp90-cochaperone.
- Identificare piccole molecole che disruzioni selettivamente le interazioni Hsp90-FKBP51 o Hsp90-FKBP52.
- Fornire un metodo per lo screening ad alto rendimento con requisiti minimi di campioni.
Metodi Utilizzati
- Saggio omogeneo basato su perline con perline donatrici legate al glutatione.
- Co-chaperone con motivo TPR fuse con GST e perline accettore con peptidi derivati da Hsp90.
- Screening ad alto rendimento di piccole molecole.
- Risultati rapidi ottenibili entro un'ora.
Risultati Principali
- Identificazione di potenti e selettivi inibitori delle interazioni Hsp90-FKBP51.
- Dimostrazione della robustezza e dell'affidabilità del saggio.
- Potenziale per lo screening di composti con elevata rilevanza medica.
- I risultati supportano ulteriori indagini sulle applicazioni terapeutiche.
Conclusioni
- Il saggio sviluppato è efficace per studiare le interazioni chaperone-cochaperone.
- Permette l'identificazione di inibitori di piccole molecole con potenziale significato clinico.
- Questa tecnica può far progredire la ricerca sui trattamenti per le malattie associate alle interazioni Hsp90.
Domande Frequenti
Executive Industry Relevance
Targeting Hsp90-cochaperone interactions enables selective modulation of disease-relevant signaling pathways, offering a precision strategy for therapeutic intervention in oncology, neurodegeneration, and autoimmune disorders. The homogeneous bead-based assay provides a robust, scalable platform for early-stage target validation and lead identification by quantifying protein-protein disruption in a homogeneous environment. This supports mechanistic de-risking and predictive confidence in prioritizing chemical series with selective Hsp90-FKBP51 or Hsp90-FKBP52 inhibitory profiles.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of Hsp90-FKBP51 and Hsp90-FKBP52 binary interactions to validate target engagement and pathway specificity.
- Operational Value: Requires minimal protein and compound input, supporting early-stage screening with limited material availability.
- Predictive Value: Identifies selective inhibitors (e.g., D10 with 65 nM IC50 for FKBP51) to de-risk off-target effects and improve target hypothesis confidence.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers quantitative, homogeneous readouts (Z’ > 0.8, S/B = 13.35) suitable for high-throughput screening campaigns.
- Operational Value: Results obtained within one hour, enabling rapid iteration and timely go/no-go decisions in hit-to-lead progression.
- Reproducibility Value: Standardized bead conjugation and blocking steps ensure assay consistency across runs and laboratories.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports screening for compounds that disrupt Hsp90-cochaperone interactions implicated in Alzheimer’s disease, cancer, and autoimmune disorders.
- Predictive Value: Enables early assessment of target selectivity, aiding in the selection of candidates with favorable mechanistic profiles for preclinical advancement.
- Continuity Value: Assay outputs (IC50, dose response) translate directly into downstream efficacy and safety evaluation workflows.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the early discovery continuum, supporting target validation through biochemical confirmation of Hsp90-cochaperone disruption, and enabling lead identification via high-throughput screening of small molecule libraries.
- Discovery Biology: Validates target engagement by measuring disruption of Hsp90-FKBP51 or Hsp90-FKBP52 interactions, clarifying mechanism of action.
- Screening: Provides assay readiness with robust Z’ score and signal-to-background ratio, ensuring reliable compound evaluation in 384-well format.
- Analytics: Generates dose-response data and IC50 values through nonlinear regression, enabling quantitative comparison of inhibitor potency and selectivity.
- Translational Research: Connects to disease-relevant systems by screening inhibitors of interactions linked to human disorders, supporting biomarker-aligned target validation.
- Enterprise Reuse: Platform can be extended to other Hsp70/Hsp90-TPR cochaperone interactions, increasing ROI across multiple target families.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Mechanistic de-risking through selective inhibition of Hsp90-FKBP51 over Hsp90-FKBP52, reducing ambiguity in target modulation.
- Operational Value: Low sample consumption (beads, protein, compounds) and fast time-to-result (<1 hour) increase screening efficiency.
- Strategic Value: Enables early go/no-go decisions based on target selectivity, improving capital efficiency and reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of chemical series with validated target engagement and selectivity profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein purification (GST-tagged TPR domains) and bead-based assay conjugation chemistry.
- Dependent on access to plate reader capable of luminescence detection and compatible with 384-well formats.
- Necessitates standardization of peptide-bead conjugation ratios (10:1) and blocking conditions (1 M Tris, pH 8.0) for batch-to-batch consistency.
- Adaptation to alternative cochaperones requires re-validation of bead conjugation and interaction kinetics.
- Practical limitation: assay sensitivity may be affected by compound auto-fluorescence or luminescence quenching, requiring orthogonal counterscreening.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:28
Coupling of Hsp90 C-Terminal Peptide to the Acceptor Beads
2:49
Assay for Interaction Between GST-FKBP51 or GST-FKBP52 and Hsp90 C-Terminal Peptide and Inhibition with Small Molecular Mass Compounds
4:14
Dose-Response Curve Generation and IC50 Calculation
4:58
Results: Inhibitory Effect of Small Molecular Weight Test Compound D10
5:59
Conclusion
