Microscopia a fluorescenza per l'internalizzazione dell'ATP mediata dalla macropinocitosi in cellule tumorali umane e topi xenotrapiantati da tumore

Le cellule tumorali hanno una notevole capacità di internalizzare i nutrienti, come l'ATP, dall'ambiente extracellulare. Il nostro protocollo ci consente di dimostrare l'internalizzazione dell'ATP e di visualizzare la localizzazione dell'ATP all'interno delle cellule. Questa immagine ad alta risoluzione di ATP internalizzato, all'interno di macropinozomi, è ideale per comprendere la localizzazione speciale e completare la quantità di analisi dell'internalizzazione.

Il protocollo descrive diverse applicazioni sperimentali per studiare l'internalizzazione dell'ATP. Questo metodo può essere utilizzato per studiare diversi meccanismi di internalizzazione cellulare, tra cui la macropinocitosi e l'endocitosi mediata dagli esosomi. Per le malattie metaboliche, l'internalizzazione dell'ATP nelle cellule non tumorali può essere studiata con questo protocollo.

Per iniziare, semina le cellule tumorali in un pallone di 225 centimetri quadrati, contenente DMEM integrato con FBS e antibiotici. Consentire alle cellule di crescere a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica nell'incubatore di colture cellulari. Una volta raggiunta la confluenza dell'80%, staccare le cellule e pellet giù le celle di staccamento mediante centrifugazione e risospesse le celle in PBS ghiacciato per ottenere la densità cellulare di 5 volte 10 alle 6 celle per 100 microlitri di PBS.

Trasferire la sospensione cellulare in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri. Pulire il sito di iniezione sul fianco di un topo immunodeficiente, con etanolo al 75%, e pulire l'etanolo in eccesso con una delicata salvietta. Aspirare le cellule in una siringa priva di lattice da un millilitro, dotata di un ago di scorrimento di precisione calibro 27.

Per l'iniezione sottocutanea, tenere l'ago con un angolo di circa 10 gradi rispetto alla pelle e inserire la punta dell'ago con la smussatura rivolta verso l'alto sotto la pelle, mantenendo solo uno o due millimetri dell'ago al di fuori della pelle. Erogare le cellule dalla siringa lentamente per circa 10 secondi. Dopo aver iniettato l'intero volume, tenere l'ago in posizione per tre-cinque secondi e quindi prelevare l'ago.

Applicare una pressione delicata ma decisa sul sito di iniezione per tre-cinque secondi con le dita, per evitare perdite del contenuto iniettato. Monitorare e misurare la crescita tumorale utilizzando pinze Vernier, fino a quando i tumori raggiungono un volume da 200 a 500 millimetri cubi. Sciogliere 300 microlitri da 16 milligrammi per millilitro destro fluorescente ad alto peso molecolare e DMEM senza siero e incubare a bagnomaria, temperato a 37 gradi Celsius per 30 minuti, quindi centrifugare la soluzione di destrano e trasferire il surnatante in un nuovo tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri.

A 40 microlitri, un ATP fluorescente non idrolizzabile di un millimolare analogo a 160 microlitri di DMEM senza siero, per produrre una soluzione di ATP fluorescente non idrolizzabile da 0,2 millimolari. Preparare le soluzioni di trattamento di DMEM o otto milligrammi per millilitro fluorescente ad alto o basso peso molecolare di destrano, con o senza 100 ATP fluorescente micromolare non idrolizzabile in DMEM, mescolando le soluzioni stock preparate in precedenza. Utilizzare una siringa da un millilitro per raccogliere 50 microlitri di una soluzione di trattamento.

Iniettare la soluzione direttamente nel tumore xenotrapianto e ripetere per quattro repliche biologiche di ciascun trattamento. Dopo l'eutanasia del topo e l'isolamento del tessuto tumorale, utilizzare un cucchiaio perforato per raccogliere il tessuto tumorale resecato e posizionare immediatamente il tessuto in un mezzo di congelamento e arrotolare il tessuto, assicurandosi che il tessuto rimanga immerso nei bagni medi, tutte le superfici del tessuto. Posizionare con attenzione il tessuto nello stampo di incorporamento contenente il mezzo di congelamento.

Posizionare verticalmente l'etichetta corrispondente nel mezzo di congelamento o nello stampo, assicurandosi che l'etichetta scritta sia visibile all'esterno del supporto. Quando il mezzo di congelamento diventa bianco opaco, rimuovere il blocco di tessuto dallo stampo, posizionare il blocco di tessuto su ghiaccio secco e ripetere il congelamento per ogni sezione tumorale. Conservare i blocchi di tessuto a meno 80 gradi Celsius per diversi mesi prima della procedura di criosezione.

Dopo aver fatto le diapositive dei blocchi di tessuto, fissare le diapositive della sezione di tessuto in etanolo al 95% a meno 18 gradi Celsius per cinque minuti. Lavare la sezione fissa con PBS per cinque minuti. Aggiungere da 10 a 50 microlitri di un mezzo di montaggio acquoso con DAPI alle sezioni di tessuto, in base alle dimensioni delle sezioni, e posizionare una copertura di vetro sulla sezione di tessuto.

Dopo 12-24 ore di montaggio, identificare le regioni di interesse delle sezioni tumorali fisse e acquisire le immagini utilizzando la microscopia a fluorescenza come dimostrato in precedenza. Dopo due o 24 ore di fissazione delle cellule tumorali umane e in piedi con DAPI, acquisire le immagini utilizzando un sistema di imaging a epifluorescenza e un software di acquisizione dati. Posizionare il vetrino sul palco di un microscopio a epifiorescenza verticale in modalità binoculare.

Apri il programma di imaging, seleziona l'obiettivo 10 volte e regola lo stage per definire la messa a fuoco. Scansiona la diapositiva da sinistra a destra in modo serpentino per identificare le regioni di interesse. Selezionare l'obiettivo 40 volte e utilizzare l'interruttore sul microscopio per passare dalla modalità binoculare a quella di acquisizione dell'immagine.

Clicca sull'icona della qualità live per visualizzare e successivamente acquisire le immagini. Utilizzate il pannello OC sulla barra degli strumenti di acquisizione per definire i parametri di esposizione per ogni cubo di filtro o canale fluorescente, quindi utilizzate la barra degli strumenti di acquisizione multicanale per acquisire un'immagine a tre canali con le impostazioni di esposizione definite. In alternativa, le immagini multicanale possono essere acquisite manualmente passando tra i cubi del filtro, impostando il tempo di esposizione, chiudendo o aprendo l'otturatore tra l'acquisizione dell'immagine per ciascun canale e la sovrapposizione di ogni immagine scattata per i singoli canali.

Salvare l'immagine come file nd2. Salvare i file TIF, incluse l'immagine del canale unito e le singole immagini del canale. Utilizzare la funzione di conteggio degli oggetti sulla barra degli strumenti annotazioni e misurazioni per contare il numero di celle fluorescenti NHF-ATP, TMR ad alto peso molecolare e TMR fluorescenti a basso peso molecolare su un file di immagine nd2 salvato ed esportare i dati in un foglio di calcolo attraverso il programma di analisi.

Questo protocollo è stato sviluppato per l'analisi spaziale, temporale e quantitativa dell'internalizzazione cellulare di ATP non idrolizzabile. L'internalizzazione intracellulare di ATP fluorescente non idrolizzabile è stata dimostrata mediante colocalizzazione di ATP fluorescente non idrolizzabile con destrano fluorescente ad alto o basso peso molecolare in vitro, ex vivo e in vivo. Per garantire che le cellule tumorali conservassero l'ATP interiorizzato, limitato il tempo sperimentale per tutte le iniezioni intratumorali al crio-incorporamento.

Tenere conto anche della variazione intratumorale mediante l'imaging del tessuto in tutto il tumore. Le future iterazioni del nostro metodo potrebbero comportare la visualizzazione in tempo reale del processo di internalizzazione dell'E-ATP, rivelando informazioni sulla cinetica macropinocitotica e sul traffico in tessuti specifici.