Name: Misurazione fluorescente in tempo reale delle funzioni sinaptiche in modelli di sclerosi laterale amiotrofica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Scopri metodi di imaging fluorescente in tempo reale per valutare la funzione sinaptica in modelli di sclerosi laterale amiotrofica. Queste tecniche permettono di monitorare l'influsso di calcio presinaptico e la fusione delle vescicole sinaptiche in colture neuronali primarie e derivate da iPSC.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Vorremmo ringraziare gli attuali ed ex membri del Jefferson Weinberg ALS Center per il feedback critico e i suggerimenti per l'ottimizzazione di queste tecniche e delle loro analisi. Questo lavoro è stato supportato da finanziamenti del NIH (RF1-AG057882-01 e R21-NS0103118 a D.T),del NINDS (R56-NS092572 e R01-NS109150 a P.P), della Muscular Dystrophy Association (D.T.), del Robert Packard Center for ALS Research (D.T.), della fondazione Family Strong 4 ALS e della Farber Family Foundation (B.K.J., K.K. e P.P).

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Tre passaggi comuni a entrambi i metodi descritti sono di cruciale importanza per il successo sperimentale e risultati quantificabili. In primo luogo, la preparazione di un ACSF fresco prima di ogni ciclo di esperimenti è essenziale, seguendo le istruzioni allegate. In caso contrario, potrebbe impedire un'appropriata depolarizzazione neuronale. Un campione di neuroni di controllo non trattati dovrebbe essere costantemente testato prima della stimolazione di qualsiasi gruppo sperimentale per garantire una corretta depolar...

La modellazione della sclerosi laterale amiotrofica (SLA) in laboratorio è resa particolarmente impegnativa a causa della natura estremamente sporadica di oltre l'80% dei casi1, insieme al vasto numero di mutazioni genetiche note per essere causative della malattia2. Nonostante ciò, tutti i casi di SLA condividono la caratteristica unificante che prima della degenerazione neuronale vera e propria, esiste una comunicazione disfunzionale tra motoneuroni presinaptici e cellule muscolari postsinaptiche3,4. Clinicamente, poiché i pazienti perdono la connettività dei restanti motoneuroni superiori e inferiori, presentano caratteristiche di iper- e ipoeccitabilità neuronale in tutta la malattia5,6,7,8,9, riflettendo complessi cambiamenti molecolari sottostanti a queste sinapsi, che noi, come ricercatori della SLA, cerchiamo di capire.
Molteplici modelli transgenici hanno dimostrato che il deterioramento e la disorganizzazione della giunzione neuromuscolare si verificano con l'espressione di mutazioni genetiche causative della SLA, tra cui SOD110, FUS11,12, C9orf7213,14,15,16 e TDP4317,18,19 attraverso valutazioni morfologiche, compresa la valutazione dei bouton sinaptici, delle densità della colonna vertebrale e dell'organizzazione pre/postsinaptica. Meccanicamente, a partire dai documenti di riferimento di Cole, Hodgkin e Huxley nel 1930, è stato anche possibile valutare le risposte sinaptiche attraverso tecniche elettrofisiologiche in colture cellulari in vitro o preparazioni di fette di tessuto20. Attraverso queste strategie, molti modelli di SLA hanno dimostrato deficit di trasmissione sinaptica. Ad esempio, una variante mutante di TDP43 provoca una maggiore frequenza di attivazione e diminuisce la soglia del potenziale d'azione nelle cellule simili a motoneuroni NSC-34 (midollo spinale x neuroblastoma ibrido linea 34)21. Questa stessa variante causa anche la trasmissione sinaptica disfunzionale alla giunzione neuromuscolare (NMJ) prima dell'insorgenza di deficit motori comportamentali in un modello murino22. In precedenza è stato dimostrato che l'espressione di FUS mutante provoca una ridotta trasmissione sinaptica all'NMJ in un modello di drosophila di FUS-ALS prima dei difetti locomotori11. Un recente rapporto che utilizza cellule staminali pluripotenti indotte derivate da portatori di espansione C9orf72 ha rivelato una riduzione del pool prontamente rilasciabile di vescicole sinaptiche23. Complessivamente, questi studi e altri evidenziano l'importanza di costruire una comprensione più completa dei meccanismi alla base della segnalazione sinaptica nei modelli rilevanti per la malattia della SLA. Questo sarà fondamentale per comprendere la patobiologia della SLA e sviluppare potenziali bersagli terapeutici per i pazienti.
I metodi delle celle di serraggio di corrente e tensione sono stati preziosi nel determinare le proprietà della membrana come la conduttanza, il potenziale di membrana a riposo e il contenuto quantico delle singole sinapsi20,24. Tuttavia, uno dei limiti significativi dell'elettrofisiologia è che è tecnicamente impegnativo e fornisce solo approfondimenti da un singolo neurone alla volta. La microscopia confocale a cellule vive, accoppiata con specifiche sonde fluorescenti, offre l'opportunità di indagare la trasmissione sinaptica dei neuroni in modo spaziotemporale25,26,27. Sebbene non sia una misura diretta dell'eccitabilità neuronale, questo approccio di fluorescenza può fornire una misura relativa di due correlazioni molecolari della funzione sinaptica: rilascio di vescicole sinaptiche e transienti di calcio ai terminali sinaptici.
Quando un potenziale d'azione raggiunge la regione terminale presinaptica dei neuroni, si innescano transitori di calcio, facilitando la transizione da un segnale elettrico al processo di rilascio di neurotrasmettitori28. I canali del calcio voltaggio-dipendenti localizzati in queste aree regolano strettamente la segnalazione del calcio per modulare la cinetica del rilascio dei neurotrasmettitori29. Le prime registrazioni riportate a fluorescenza di transienti di calcio sono state eseguite utilizzando l'indicatore a doppia lunghezza d'onda Fura-2 AM o il colorante a singola lunghezza d'onda Fluo-3 AM30,31,32. Mentre questi coloranti offrivano grandi nuove intuizioni all'epoca, soffrono di diverse limitazioni come la compartimentazione non specifica all'interno delle cellule, la perdita di colorante attiva o passiva dalle cellule etichettate, il fotosbiancamento e la tossicità se ripresi per lunghi periodi di tempo33. Negli ultimi dieci anni, gli indicatori di calcio geneticamente codificati sono diventati i cavalli di battaglia per l'imaging di varie forme di attività neuronale. Questi indicatori combinano una proteina fluorescente modificata con una proteina chelante di calcio che cambia rapidamente l'intensità di fluorescenza dopo il legame degli ioni Ca2+34. L'applicazione di questi nuovi indicatori è vasta, consentendo una visualizzazione molto più semplice dei transitori intracellulari di calcio sia in vitro che in vivo. Una famiglia di questi reporter geneticamente codificati, nota come GCaMP, è ora ampiamente utilizzata. Questi indicatori contengono un dominio calmodulina C-terminale, seguito da una proteina fluorescente verde (GFP), e sono coperti da una regione di legame con la calmodulina N-terminale35,36. Il legame del calcio al dominio calmodulina innesca un'interazione con la regione di legame con la calmodulina, con conseguente cambiamento conformazionale nella struttura complessiva della proteina e un sostanziale aumento della fluorescenza della porzione GFP35,36. Nel corso degli anni, questa famiglia di reporter ha subito diverse evoluzioni per consentire letture distinte per particolari transienti di calcio con cinetica specifica (lenta, media e veloce), ognuno con proprietà leggermente diverse37,38. Qui, è stato evidenziato l'uso del reporter GcaMP6, che ha precedentemente dimostrato di rilevare potenziali d'azione singoli e transitori di calcio dendritico nei neuroni sia in vivo che in vitro37.
I transienti di calcio nella regione presinaptica innescano eventi di fusione delle vescicole sinaptiche, causando il rilascio di neurotrasmettitori nella sinapsi e l'inizio di eventi di segnalazione nella cellula postsinaptica28,39. Le vescicole sinaptiche vengono rilasciate rapidamente e riciclate, poiché la cellula mantiene omeostaticamente una superficie di membrana cellulare stabile e un pool prontamente rilasciabile di vescicole legate alla membrana in grado di fusione40. Il colorante stirilico qui utilizzato ha un'affinità verso le membrane lipidiche e cambia specificamente le sue proprietà di emissione in base all'ordinamento dell'ambiente lipidico circostante41,42. Pertanto, è uno strumento ideale per etichettare le vescicole sinaptiche di riciclaggio e il successivo tracciamento di queste vescicole in seguito alla stimolazione neuronale41,42. Il protocollo che è stato generato e ottimizzato è un adattamento dei concetti descritti inizialmente da Gaffield e colleghi, che ci consente di visualizzare continuamente la puntura di vescicole sinaptiche marcate con colorante stirilico nel tempo41.
Qui vengono descritte due metodologie correlate basate sulla fluorescenza, che riportano in modo affidabile eventi cellulari specifici coinvolti nella trasmissione sinaptica. Sono stati definiti protocolli per sondare la dinamica dell'afflusso terminale di calcio presinaptico mediato dalla depolarizzazione e dell'esocitosi delle vescicole sinaptiche nei neuroni in coltura. Qui, i metodi e i risultati rappresentativi si concentrano sull'uso di neuroni corticali o motoneuroni primari dei roditori come sistema modello in vitro, poiché ci sono studi pubblicati che utilizzano questi tipi di cellule43,44. Tuttavia, questi metodi sono applicabili anche ai neuroni corticali i3 umani differenziati45, poiché abbiamo anche avuto successo con entrambi i protocolli nella sperimentazione attualmente in corso nel nostro laboratorio. Il protocollo generale è delineato in un formato lineare graduale, mostrato nella Figura 1. In breve, per studiare la dinamica del calcio nei neuriti, i neuroni maturi vengono trasfettati con DNA plasmidico per esprimere il reporter fluorescente GCaMP6m sotto un promotore del citomegalovirus (CMV)37,46. Le cellule trasfettate hanno un basso livello di fluorescenza verde basale, che aumenta in presenza di calcio. Le regioni di interesse sono specificate per monitorare i cambiamenti di fluorescenza durante la nostra manipolazione. Ciò consente di misurare fluttuazioni del calcio altamente localizzate spazialmente e temporalmente37,46. Per valutare la fusione e il rilascio delle vescicole sinaptiche, i neuroni maturi vengono caricati con colorante stirilico incorporato nelle membrane delle vescicole sinaptiche mentre vengono riciclati, riformati e ricaricati con neurotrasmettitori nelle cellule presinaptiche41,42,43,47,48. Gli attuali coloranti utilizzati a questo scopo etichettano le vescicole sinaptiche lungo i neuriti e sono usati come proxy per queste regioni in esperimenti di imaging dal vivo, come è stato dimostrato dalla co-colorazione del colorante stirilico e della sinaptotagmina di Kraszewski e colleghi49. Qui sono incluse immagini rappresentative di colorazioni simili che sono state eseguite (Figura 2A). Precedenti ricercatori hanno ampiamente utilizzato tali coloranti per riportare la dinamica delle vescicole sinaptiche alla giunzione neuromuscolare e ai neuroni dell'ippocampo48,49,50,51,52,53,54,55,56 . Selezionando regioni puntiformi di vescicole cariche di colorante e monitorando le diminuzioni dell'intensità di fluorescenza dopo il rilascio delle vescicole, la capacità di trasmissione sinaptica funzionale e la dinamica temporale di rilascio possono essere studiate dopo la stimolazione43. Per entrambi i metodi, un mezzo contenente un'alta concentrazione di cloruro di potassio viene impiegato per depolarizzare le cellule per imitare l'attività neuronale. I parametri di imaging sono specificati per catturare intervalli inferiori al secondo che coprono una normalizzazione di base seguita dal nostro periodo di cattura della stimolazione. Le misure di fluorescenza in ogni punto temporale sono determinate, normalizzate sullo sfondo e quantificate nel periodo di tempo sperimentale. L'aumento della fluorescenza GCaMP6m mediato dall'afflusso di calcio o l'efficace diminuzione della fluorescenza dell'esocitosi delle vescicole sinaptiche styryl dye release può essere rilevata attraverso questa strategia. Di seguito sono descritti la configurazione metodologica dettagliata e i parametri per questi due protocolli e una discussione sui loro vantaggi e limiti.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62813/62813fig01.jpg"> Figura 1: Rendering visivo del processo generale del protocollo generale. (1) Isolare e coltivare i neuroni primari dei roditori in vitro fino al punto temporale di maturazione scelto. (2) Introdurre il DNA GCaMP o il colorante stirilico come reporter dell'attività sinaptica. (3) Impostare il paradigma di imaging utilizzando il microscopio confocale dotato di live-imaging e il software associato. Inizia il periodo di registrazione di base. (4) Mentre le cellule sono ancora in fase di acquisizione di immagini dal vivo, stimolare i neuroni attraverso un'elevata perfusione del bagno KCl. (5) Valutare le misurazioni dell'intensità di fluorescenza nel tempo per misurare i transitori di calcio o la fusione delle vescicole sinaptiche. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62813/62813fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Obiettivo ad aria 20x</td><td>Nikon</td><td></td><td>Per l'imaging</td></tr><tr><td>Obiettivo ad immersione in olio 40x</td><td>Nikon</td><td></td><td>Per l'imaging</td></tr><tr><td>Integratore B27</td><td>Thermo Scientific</td><td>17504044</td><td>Integratore per la crescita neuronale</td></tr><tr><td>Siringhe BD senza ago, 50 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-689-8</td><td>Parte del gruppo di perfusione per gravità</td></tr><tr><td>Cappa</td> <td>per colture cellulari di biosicurezzaBaker</td><td>SterilGARD III SG403A</td><td>Coltura cellulare ascettica, trasfezione e caricamento di coloranti</td></tr><tr><td>b-Mercaptoetanolo</td><td>Millipore Sigma</td><td>M3148</td><td>Per la coltura e il mantenimento di colture neuronali</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Millipore Sigma</td><td>A9418</td><td>Per la preparazione di colture neuronali</td></tr><tr><td>Cloruro di calcio diidrato</td><td>Millipore Sigma</td><td>223506</td><td>Componente delle soluzioni aCSF</td></tr><tr><td>Incubatore CO2 per colture cellulari</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-998-123</td><td>Per la coltura e il mantenimento dei neuroni</td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>Per la preparazione di colture neuronali</td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti +A1R core</td><td>Per l'imaging a fluorescenza</td></tr><tr><td>CoolSNAP ES2&nbsp; Fotocamera CCD</td><td>Fotometria</td><td></td><td>Per l'acquisizione delle immagini</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Millipore Sigma</td><td>G8270</td><td>Componente delle soluzioni aCSF</td></tr><tr><td>DNase</td><td>Millipore Sigma</td><td>D5025</td><td>Per la preparazione di colture neuronali</td></tr><tr><td>Femmine, gravidanza temporizzata Ratti Sprague Dawley Charles</td><td>river</td><td>400SASSD</td><td>Per la preparazione di colture di motoneuroni corticali e spinali embrionali</td></tr><tr><td>FITC Cubo filtrante</td><td>Nikon</td><td>77032509</td><td>Per l'imaging Transitori di calcio Gcamp</td></tr><tr><td>FM4-64 colorante stirrilico</td><td>Invitrogen</td><td>T13320</td><td>Per l'imaging del rilascio di vescicole sinaptiche</td></tr><tr><td>Piastre di Petri con fondo in vetro (Spessore #1.5)</td><td>CellVis</td><td>D35-10-1.5-N</td><td>Per la crescita dei neuroni su piastra di coltura compatibile con l'imaging</td></tr><tr><td>Pipetta Pasteur in vetro</td><td>Grainger</td><td>52NK56</td><td>Per la preparazione di colture neuronali</td></tr><tr><td>Soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS)</td><td>Millipore Sigma</td><td>H6648</td><td>Per la preparazione di colture neuronali</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Millipore Sigma</td><td>H3375</td><td>Componente delle soluzioni aCSF</td></tr><tr><td>Liquido cerebrospinale artificiale ad alto KCl (aCSF)</td><td></td><td></td><td>Per l'imaging. Si prega di consultare ricette*</td></tr><tr><td>siero di cavallo</td><td>Millipore Sigma</td><td>H1138</td><td>Per la coltura e il mantenimento dei neuroni</td></tr><tr><td>Cappa di dissezione a flusso laminare</td><td>NUAIRE</td><td>NU-301-630</td><td>Per la preparazione di colture neuronali</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Thermo Scientific</td><td>23017015</td><td>Per la preparazione di colture neuronali</td></tr><tr><td>L-15 Medium</td><td>Thermo Scientific</td><td>11415064</td> di Leibovitz <td>Per preparazione di colture neuronali</td></tr><tr><td>L-15 Medium di Leibovitz, senza rosso fenolo</td><td>Thermo Scientific</td><td>21083027</td><td>Per la preparazione di colture neuronali</td></tr><tr><td>L-Glutammina (200 mM)</td><td>Thermo Scientific</td><td>25030149</td><td>Integratore per colture neuronali</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Reagente per trasfezione</td><td>Thermo Scientific</td><td>11668019</td><td>Per trasfezioni neuronali</td></tr><tr><td>Basso KCl artificiale cerebrospinale fluido (aCSF)</td><td></td><td></td><td>Per l'imaging. Si prega di consultare le ricette*</td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>Millipore Sigma</td><td>208337</td><td>Componente delle soluzioni aCSF</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td> Software <td>Microsoft</td><td></td><td>per l'analisi/normalizzazione dei dati</td></tr><tr><td>Nalgene&nbsp; Unità di filtraggio, 0,2 & micro; m PES</td><td>Thermo Scientific</td><td>565-0020</td><td>Unità filtrante per soluzione aCSF</td></tr><tr><td>Terreno neurobasale</td><td>Thermo Scientific</td><td>21103049</td><td>Per la coltura e il mantenimento di colture neuronali</td></tr><tr><td>NIS-Elements Advanced Research</td><td>Nikon</td><td></td><td>Software per l'acquisizione e l'analisi delle immagini</td></tr><tr><td>Nunc 15 mL Provette coniche</td><td>Thermo Scientific</td><td>339650</td><td>Per la preparazione di colture neuronali e tampone soluzioni</td></tr><tr><td>Nunc 50 mL provette coniche</td><td>Thermo Scientific</td><td>339652</td><td>Per la preparazione di colture neuronali e soluzioni tampone</td></tr><tr><td>Optiprep</td><td>Millipore Sigma</td><td>D1556</td><td>Per la preparazione di colture neuronali</td></tr><tr><td></td><td>Papaina Millipore Sigma</td><td>P4762</td><td>Per la preparazione di colture neuronali</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Thermo Scientific</td><td>15140122</td><td>Per prevenire la contaminazione batterica delle colture neuronali</td></tr><tr><td>Sistema di perfusione</td><td>Warner</td><td>Instruments SF-77B</td><td>Per la sostituzione del tubo di perfusione aCSF</td></tr><tr><td></td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-30526-14</td><td>Parte del gruppo di perfusione per gravità</td></tr><tr><td>pGP-CMV-Gcamp6m</td><td>plasmide Addgene</td><td>40754</td><td>Per l'imaging di transitori di calcio</td></tr><tr><td>Bromidrato di poli-D-lisina</td><td>Millipore Sigma</td><td>P7886</td><td>Agente di rivestimento per piastre di Petri con fondo in vetro</td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Millipore Sigma</td><td>P3911</td><td>Componente delle soluzioni aCSF</td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Millipore Sigma</td><td>S5761</td><td>Componente delle soluzioni aCSF</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Millipore Sigma</td><td>S9888</td><td>Componente delle soluzioni aCSF</td></tr><tr><td>Stage Top Incubator</td><td>Tokai Hit</td><td></td><td>Per l'incubazione di neuroni vivi durante il periodo di imaging</td></tr><tr><td>TRITC Filter cube</td><td>Nikon 77032809</td><td></td><td>Per l'imaging FM4-64</td></tr><tr><td>Inibitore della tripsina</td><td>Millipore Sigma</td><td>T6414</td><td>Per la preparazione di colture neuronali</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%), rosso fenolo</td><td>Thermo Scientific</td><td>25200056</td><td>Per la preparazione di colture neuronali</td></tr><tr><td>Tabella di isolamento dalle vibrazioni</td><td>New Port</td><td>VIP320X2430-135520</td><td>Tavolo/supporto per microscopio</td></tr></tbody></table>

misurazione fluorescente in tempo reale delle funzioni sinaptiche in modelli di sclerosi laterale amiotrofica

Real-Time Fluorescent Measurement of Synaptic Functions in Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Prima della degenerazione neuronale, la causa dei deficit motori e cognitivi nei pazienti con sclerosi laterale amiotrofica (SLA) e /o demenza del lobo frontotemporale (FTLD) è la disfunzione della comunicazione tra neuroni e motoneuroni e muscoli. Il processo sottostante della trasmissione sinaptica coinvolge la fusione delle vescicole sinaptiche dipendenti dalla depolarizzazione della membrana e il rilascio di neurotrasmettitori nella sinapsi. Questo processo avviene attraverso l'afflusso localizzato di calcio nei terminali presinaptici dove risiedono le vescicole sinaptiche. Qui, il protocollo descrive metodologie di live-imaging basate sulla fluorescenza che riportano in modo affidabile l'esocitosi delle vescicole sinaptiche mediate dalla depolarizzazione e le dinamiche di afflusso terminale di calcio presinaptico nei neuroni in coltura.
Utilizzando un colorante stirilico incorporato nelle membrane delle vescicole sinaptiche, viene chiarito il rilascio di vescicole sinaptiche. D'altra parte, per studiare l'ingresso del calcio, viene utilizzato Gcamp6m, un reporter fluorescente geneticamente codificato. Impieghiamo una depolarizzazione ad alto contenuto mediata da cloruro di potassio per imitare l'attività neuronale. Per quantificare l'esocitosi delle vescicole sinaptiche in modo inequivocabile, misuriamo la perdita di fluorescenza normalizzata del colorante stirilico in funzione del tempo. In condizioni di stimolazione simili, in caso di afflusso di calcio, aumenta la fluorescenza di Gcamp6m. La normalizzazione e la quantificazione di questo cambiamento di fluorescenza vengono eseguite in modo simile al protocollo del colorante stirilico. Questi metodi possono essere multiplexati con sovraespressione basata sulla trasfezione di proteine mutanti marcate fluorescentemente. Questi protocolli sono stati ampiamente utilizzati per studiare la disfunzione sinaptica in modelli di FUS-ALS e C9ORF72-ALS, utilizzando i neuroni corticali e motori dei roditori primari. Questi protocolli consentono facilmente uno screening rapido di composti che possono migliorare la comunicazione neuronale. In quanto tali, questi metodi sono preziosi non solo per lo studio della SLA, ma per tutte le aree della ricerca neurodegenerativa e delle neuroscienze dello sviluppo.

A seguito del successo dell'implementazione del protocollo di cui sopra, vengono mostrati risultati rappresentativi per un tipico esperimento di rilascio di vescicole sinaptiche con colorante stirilico. I neuroni corticali primari di ratto in coltura sono stati caricati con colorante utilizzando il metodo descritto nel paragrafo 6. La specificità del carico del colorante è stata determinata dalla co-etichettatura con sinaptofisina con sinaptofisina marcatore delle vescicole sinaptico. La maggior parte dei puncta positivi...

Sono descritti due metodi correlati per visualizzare gli eventi subcellulari necessari per la trasmissione sinaptica. Questi protocolli consentono il monitoraggio in tempo reale della dinamica dell'afflusso di calcio presinaptico e della fusione della membrana delle vescicole sinaptiche utilizzando l'imaging a cellule vive di neuroni in coltura in vitro .

Misurazione fluorescente in tempo reale delle funzioni sinaptiche in modelli di sclerosi laterale amiotrofica

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe ...

Questi metodi consentono una rapida valutazione se una manipolazione sperimentale, una proteina causativa della malattia o l'RNA possono avere un impatto sui processi sinaptici e se i composti terapeutici possono ripristinare la funzione. Queste tecniche forniscono una lettura affidabile della funzione sinaptica da un gruppo di neuroni in un periodo di tempo relativamente breve rispetto all'elettrofisiologia. Questo protocollo può essere applicato a qualsiasi malattia dello sviluppo neuronale o della degenerazione.Questo funziona bene per le colture neuronali primarie di roditori e per i neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti indotte. Per iniziare, ottimizza le impostazioni di acquisizione delle immagini utilizzando il software di acquisizione di immagini confocali. Mantieni costante il tempo di esposizione della potenza di eccitazione, il guadagno del rilevatore e la frequenza dei fotogrammi su tutti i campioni.Per l'imaging time lapse, selezionare un rapporto di aspetto di 512 per 512 e una frequenza fotogrammi di due immagini al secondo per ridurre al minimo lo sbiancamento del colorante. Quindi selezionare le combinazioni di eccitazione fluorescente, dicroico e filtro di emissione per GCaMP sei M / GCaMP tre con Fitzy e colorante stearoilico con Trixi. Per evitare la deriva Z durante l'imaging time lapse, utilizzare la funzione di messa a fuoco perfetta del software di acquisizione di immagini confocali.Quindi, selezionare la scheda ora nel pannello di acquisizione delle immagini. Per la fase uno, impostare l'intervallo 500 millisecondi e la durata da tre a cinque minuti. E per la fase due, impostare l'intervallo 500 millisecondi e la durata, cinque minuti.Quindi, per assemblare l'apparato di perfusione gravitazionale per liquido cerebrospinale artificiale o ACSF, caricare il tampone ACSF ad alto contenuto di cloruro di potassio in una siringa da 50 millilitri nella parte superiore dell'apparecchio e impostare la portata a un millilitro al minuto. Quindi, caricare una parabola di vetro da 35 millilitri contenente neuroni sullo stadio di imaging confocale con l'estremità del tubo di perfusione posizionato sul bordo del piatto e scegliere il campo per l'imaging. 48 ore dopo la trasfezione, incubare i neuroni corticali o motori primari in un tampone ACSF a basso contenuto di cloruro di potassio per 10 minuti a 37 gradi Celsius.Quindi rimuovere il tampone mediante aspirazione e utilizzando una pipetta, caricare i neuroni al buio su una capsula di Petri con fondo di vetro riempita con ACSF contenente cloruro di potassio millimolare e 10 colorante stirilico micro molare. Dopo cinque minuti, rimuovere la soluzione di carico e bagnare i neuroni in un tampone ACSF a basso contenuto di cloruro di potassio a 37 gradi Celsius per 10 minuti per eliminare il carico di colorante non specifico. Quindi posizionare la parabola sullo stadio di imaging del microscopio confocale invertito e osservare le cellule sotto un obiettivo ad aria 20 volte o un obiettivo di immersione in olio 40 volte.Eccitare il colorante in acciaio utilizzando un laser a 546 nanometri e raccogliere le emissioni utilizzando un filtro passa-banda da 570 a 620 nanometri. Dopo aver selezionato il campo di imaging e aver attivato una messa a fuoco perfetta, scatta una singola immagine fissa con campo luminoso, Trixi e canali marcatori di fluorescenza per contrassegnare i confini neuronali. Quindi avviare Run Now nel software di acquisizione ed eseguire la registrazione basale per tre-cinque minuti per escludere variazioni nell'intensità del colorante.Proprio al passaggio alla fase due, attivare il pulsante di accensione per il sistema di perfusione e perfondere costantemente il cloruro di potassio 50 millimolari ai neuroni per facilitare lo scarico del colorante. Eseguire le registrazioni per cinque minuti, quindi attivare l'interruttore di spegnimento per il sistema di perfusione. Salvare l'esperimento per l'analisi dei dati in un secondo momento utilizzando il software confocale.48 ore dopo la trasfezione con GCaMP sei M, incubare i neuroni corticali dei roditori primari con ACSF a basso contenuto di cloruro di potassio per 15 minuti. Quindi montare la parabola sulla piattaforma di imaging e visualizzare la fluorescenza GCaMP sei M utilizzando un filtro Fitzy e un obiettivo 20 volte o 40 volte. Dopo aver selezionato il campo di imaging e aver attivato la messa a fuoco perfetta, scatta una singola immagine fissa con canali luminosi, Fitzy e marcatori di fluorescenza per contrassegnare i confini neuronali.Quindi, avviare Run Now nel software di acquisizione ed eseguire la registrazione basale per tre o cinque minuti. Quindi perfondere ACSF contenente cloruro di potassio millimolare ai neuroni come dimostrato in precedenza e registrare per cinque minuti. Quando l'acquisizione dell'immagine si interrompe, salva l'esperimento e procedi all'analisi dei dati utilizzando il software confocale.Per l'analisi delle immagini, apri le immagini time lapse nel software confocale e allinea le immagini facendo clic su Immagine, seguita dall'elaborazione, seguita da Allinea documento corrente, quindi seleziona Allinea al primo fotogramma. Seleziona le regioni di interesse lungo i neuriti utilizzando lo strumento di selezione del ROI e contrassegna anche un ROI che rappresenta l'intensità della fluorescenza di fondo. Quindi, avviare la funzione di misurazione dal pannello di misurazione del tempo per misurare la fluorescenza grezza nel tempo per i ROI selezionati.Dopo la misurazione, esportare le intensità di fluorescenza grezze nel software del foglio di calcolo. I neuroni corticali primari di ratto coltivati caricati con colorante stirilico sono mostrati qui. La specificità del carico del colorante è stata determinata dalla co-etichettatura con sinaptofisina con marcatore di vescicole sinaptofische e la maggior parte dei puncta positivi al colorante sterile sono co positivi per questo marcatore.L'analisi dei valori di intensità grezzi durante l'intero periodo di imaging rivela che la sinaptofisina e l'intensità rimangono costanti mentre l'intensità del colorante stirilico diminuisce dopo la stimolazione. Per i neuroni di controllo trasfettati con proteina fluorescente verde, il successo del rilascio di vescicole sinaptiche ha provocato la sorprendente perdita di fluorescenza del colorante a causa dell'elevata depolarizzazione del cloruro di potassio. Questo video rappresentativo mostra un neurone che scarica selettivamente il colorante stirilico in una nuova regione destra dopo la stimolazione.Al contrario, nei neuroni trasfettati con un C nove ORF 72 legato al costrutto di ripetizione del peptide del colorante a GA 50, la trasmissione sinaptica compromessa è rappresentata dalla fluorescenza del colorante mantenuta anche dopo un'elevata depolarizzazione del cloruro di potassio. Immagini rappresentative di fluorescenza di neuroni corticali trasfettati con GCaMP sei M prima e dopo la depolarizzazione del cloruro di potassio sono mostrate qui. L'aumento dei valori di fluorescenza e i neuroni corticali trasfettati con GCaMP six M indicano l'ingresso di calcio nei neuriti a seguito di depolarizzazione indotta dal cloruro di potassio.Alla fine del periodo di registrazione basale, i neuroni hanno espresso GCaMP sei M con una bassa fluorescenza. Un drammatico aumento della fluorescenza viene quindi osservato all'inizio della stimolazione. Assicurarsi che le registrazioni basali di fluorescenza per il colorante stirilico e GCaMP siano stabili.Usa sempre una messa a fuoco perfetta per evitare la deriva dell'immagine, il che renderebbe difficile l'elaborazione dei dati post-immagine. L'ulteriore coltura dei neuroni non è raccomandata, poiché i piatti sono esposti all'aria durante la profusione. Tuttavia, la colorazione immuno o l'estrazione di proteine o RNA può valutare le potenziali cause di alterazioni sinaptiche.

real-time-fluorescent-measurement-synaptic-functions-models

Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

Questo video mostra la valutazione del rilascio e della clearance del glutammato nelle singole sinapsi corticostriatali in una fetta di cervello di topo. La stimolazione elettrica facilita il rilascio di glutammato nella sinapsi. Il glutammato rilasciato altera la fluorescenza della proteina del sensore, che decade nel tempo, indicando l'efficienza del rilascio e della clearance.

Analisi del rilascio e della clearance del glutammato in una singola sinapsi neuronale in una fetta di cervello di topo

Fonte: Krishnamurthy, K. et al. Misurazione fluorescente in tempo reale delle funzioni sinaptiche nei modelli di sclerosi laterale amiotrofica. J. Vis. Exp. (2021)Questo video mostra l'imaging del calcio in tempo reale per monitorare l'attività sinaptica nei neuroni mutanti della SLA che esprimono un biosensore di calcio geneticamente codificato. Delinea i passaggi per preparare i neuroni per l'imaging, stimolare la dinamica del calcio e registrare la fluorescenza per misurare i cambiamenti in...

Imaging a fluorescenza della dinamica sinaptica del calcio in un modello in vitro di sclerosi laterale amiotrofica

La giunzione neuromuscolare (NMJ) è alterata in una varietà di condizioni che a volte possono culminare in un fallimento sinaptico. Questo rapporto descrive i metodi basati sul microscopio a fluorescenza per quantificare tali cambiamenti strutturali.

La giunzione neuromuscolare: Synapse Misurazione circonferenza, la frammentazione e Variazioni Synaptic Proteine ​​Densità Uso confocale microscopia a fluorescenza

Qui, descriviamo l'installazione, software di navigazione, e l'analisi dei dati per un metodo spazialmente e temporalmente precisa misurazione toniche e fasiche cambiamenti glutammato extracellulare in vivo utilizzando matrici di microelettrodi enzimatico (MEA).

Utilizzando biosensori a base di enzimi misurare Tonic e Phasic glutammato in modelli murini di Alzheimer

Questo protocollo descrive un metodo per misurare sensibilmente il tasso di trasporto nucleocitoplasmatico nelle cellule NSC-34 come motori neuronali quantificando il cambiamento in tempo reale nell'importazione nucleare di una proteina NLS-NES-GFP.

Analisi per misurare il trasporto nucleocitoplasmatico in tempo reale all&#39;interno di motori neuronici come le cellule NSC-34

Presentiamo un protocollo per valutare l'equilibrio tra il rilascio del glutammato e l'autorizzazione alle singole sinapsi glutamatergiche corticosterogiche in fette acute di topi adulti. Questo protocollo utilizza il sensore fluorescente iGluu per il rilevamento del glutammato, una telecamera sCMOS per l'acquisizione del segnale e un dispositivo per l'illuminazione laser focale.

Indicatori di sinapsi singola di Soldamento Release e Uptake in Acute Brain Slices da Topi Normali e Huntington

Relazioniamo un saggio semplice, efficiente in termini di tempo e ad alta produttività a base di spettroscopia a fluorescenza per la quantificazione dei filamenti di actina in campioni biologici ex vivo provenienti da tessuti cerebrali di roditori e soggetti umani.

Un saggio a base di spettroscopia a fluorescenza efficiente in termini di tempo per valutare lo stato di polimerizzazione dell'actina nei tessuti cerebrali dei roditori e umani

Introduciamo qui una procedura per misurare gli oligomeri proteici e l'aggregazione nel lisato cellulare e nelle cellule vive utilizzando la spettroscopia di correlazione a fluorescenza.

Rilevamento dell'aggregazione proteica mediante spettroscopia di correlazione a fluorescenza

L'assorbimento del glucosio è aumentato nei motoneuroni Drosophila affetti da proteinopatia TDP-43 (TAR DNA binding protein), come indicato da un sensore di glucosio geneticamente codificato basato su FRET.

Misurazione dell'assorbimento di glucosio in modelli di Drosophila di proteinopatia TDP-43

Utilizzando topi fluorescenti transgenici, vengono descritti protocolli dettagliati per valutare il trasporto assonale in vivo di endosomi e mitocondri di segnalazione all'interno di assoni motori e sensoriali del nervo sciatico intatto in animali vivi.

Espansione del toolkit per l'imaging in vivo del trasporto assonale

Presentiamo qui un protocollo su come preparare colture primarie di cellule gliali, astrociti e microglia da cortecce di ratto per l'imaging video time-lapse di Ca2+ intracellulare per la ricerca sulla fisiopatologia della sclerosi laterale amiotrofica nel modello di ratto hSOD1G93A .

Colture primarie di astrociti e microglia di ratto e loro utilizzo nello studio della sclerosi laterale amiotrofica

Scopri metodi di imaging fluorescente in tempo reale per valutare la funzione sinaptica in modelli di sclerosi laterale amiotrofica. Queste tecniche permettono di monitorare l'influsso di calcio presinaptico e la fusione delle vescicole sinaptiche in colture neuronali primarie e derivate da iPSC.

Misurazione fluorescente in tempo reale delle funzioni sinaptiche in modelli di sclerosi laterale amiotrofica

Esplora altri video