Metodo sandwich a membrana a due strati per la raccolta della saliva di Laodelphax striatellus

L'alimentazione artificiale e la raccolta della saliva forniscono un metodo diretto per rilevare gli effettori nella saliva degli insetti. Tuttavia, questo non è stato descritto in dettaglio prima. Questo protocollo è efficace per la raccolta di saliva da insetti saprofiti.

Inoltre, è una tecnica semplice, poiché utilizziamo un mezzo contenente solo saccarosio come dieta artificiale. La saliva degli insetti saprofiti può influenzare il sistema immunitario dell'ospite a beneficio del comportamento alimentare e trasmettere agenti patogeni. Questo medicinale che può essere utilizzato per il comportamento degli insetti e la ricerca sul percorso osseo degli insetti.

Questo è un metodo semplice da eseguire. Tuttavia, questo suggerisce il montaggio di un ambiente sperimentale pulito mentre la saliva viene raccolta per ulteriori ricerche. Inizia preparando una soluzione di saccarosio al 5% per la dieta artificiale e filtra la soluzione attraverso un filtro da 0,22 micron per rimuovere la contaminazione batterica e le impurità.

Affamare circa 200 piccole larve di tramogge di piante marroni per tre o cinque ore prima di introdurle in una camera di alimentazione. Successivamente, per preparare i cilindri di vetro come camere di alimentazione, coprire un'estremità aperta della camera con una membrana di paraffina prima di introdurre gli insetti sperimentali, quindi trasferire gli insetti nel cilindro di vetro e coprire l'altra estremità della camera con membrana di paraffina allungata. Aggiungere 200 microlitri di dieta artificiale sulla membrana, quindi coprire il liquido con un altro strato di membrana di paraffina allungata.

Infine, coprire la camera con un foglio di alluminio, lasciando l'estremità con il dispositivo dietetico artificiale esposto alla luce. Dopo 24 ore, raccogliere la saliva SBPH raffreddando il cilindro a quattro gradi Celsius per immobilizzare gli insetti, quindi scoprire il film esterno e raccogliere la dieta artificiale in tubi sterili da 1,5 millilitri utilizzando una pipetta sterile. Mantenere la saliva raccolta a meno 80 gradi Celsius fino all'analisi.

Quindi, risciacquare la membrana interna con 50 microlitri di dieta artificiale fresca tre volte pipettando delicatamente e raccogliere la dieta di lavaggio artificiale in tubi sterili da 1,5 millilitri. Dopo i tre risciacqui, aggiungere una dieta artificiale fresca sulla membrana interna e posizionare una membrana di paraffina appena tesa sopra. Infine, filtrare i campioni raccolti attraverso un'unità filtrante da 0,22 micron per rimuovere microbi e altri contaminanti.

Trasferire i campioni di saliva collettiva in un filtro centrifugo da 500 microlitri e 10 kilodalton. Centrifugare il campione. Raccogli il surnatante e porta il volume finale a 100 microlitri.

Per misurare la concentrazione della saliva raccolta, accendere lo spettrofotometro UV visibile e lavare i piedistalli tre volte con acqua a doppia distillazione. Selezionare le opzioni sullo schermo nel seguente ordine, proteine, proteina A280. Selezionare il tipo e un'unità di assorbanza pari a un milligrammo per millilitro.

Quindi selezionare la casella per la correzione della linea di base, 340 nanometri. Quindi, caricare due microlitri di soluzione acquosa al 5% di saccarosio come vuoti, quindi toccare Blank nella parte inferiore dello schermo. Infine, dopo aver fissato gli standard, caricare due microlitri della saliva raccolta e registrare la concentrazione proteica.

Quando si alimenta con il 5% di saccarosio, oltre l'80% di SBPH è sopravvissuto per i primi quattro giorni. Tuttavia, dal quinto giorno in poi, la mortalità è aumentata rapidamente al 40% e il settimo giorno, meno della metà dell'SBPH è sopravvissuta. Un'analisi della pagina SDS ha mostrato che i campioni di saliva concentrati dalla saliva SBPH infetta da RSV contenevano molte più proteine rispetto al controllo negativo del 5% di saccarosio.

In un'analisi Western blot per il rilevamento della proteina del capside RSV, un insetto non infetto e viruliferoso. La proteina del capside RSV è stata rilevata con successo nel campione viruliferoso, un anticorpo progettato contro il prodotto del gene LssgMP ha rilevato una proteina 78 kilodalton in campioni non infetti e viruliferosi, dimostrando che LssgMP è una proteina della saliva. Un'analisi QRT PCR dei livelli di trascrizione LssgMP in diversi tessuti ha mostrato che i livelli di trascrizione Lssg nella ghiandola salivare erano 20 volte superiori rispetto a tutto il corpo e all'intestino, confermando l'espressione specifica di LssgMP nella ghiandola salivare.

Affamare gli insetti sperimentali prima di introdurli in camera è necessario per garantire l'efficienza della nostra raccolta di saliva. Inoltre, un mezzo artificiale dovrebbe essere raccolto e scambiato ogni 24 ore per ridurre la contaminazione microbica nel campione raccolto. Questa tecnica fornisce un metodo diretto per studiare la funzione della saliva nella trasmissione di agenti patogeni.

Inoltre, può aiutare a studiare l'interazione dell'ospite patogeno degli insetti.